一种表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，属于生物技术领域 中的植物组织培养技术领域。
【背景技术】
[0002] 虎舌红属于（Ardisia mamillata Hance)紫金牛科（Myrsinaceae)紫金牛属 (Ardisia)，是一种多年生常绿小灌木。虎舌红因其通体覆盖茸毛，内藏大量污垢，给组织培 养时外植体的表面消毒造成很大的困难，往往导致消毒不彻底而污染率较高或者消毒过度 致使外植体生活力丧失，较难获得无菌材料。所以，有效无菌材料的获得是虎舌红组织培养 的关键。
[0003] 常规的植物组织培养中外植体的消毒方法是先流水冲洗，再用酒精消毒30秒到1 分钟，再用〇. 1%的生汞消毒几分钟，无菌水冲洗后最后进行接种。但对于植物全身覆盖茸 毛的外植体的消毒方式报道极少，常规的消毒方式往往会造成消毒不彻底而污染率较高。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是常规的植物组织培养中外植体的消毒方法对于植物 全身覆盖茸毛的外植体不适用，往往会造成消毒不彻底而污染率较高的问题。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
[0006] 一种表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0007] (1)母本植株的预处理：将母本植株移入温室内进行预培养，并进行多菌灵喷洒 预处理；
[0008] (2)外植体的取材；
[0009] (3)外植体的灭菌；
[0010] a.外植体的清洗：采用洗涤剂和水清洗；
[0011] b.外植体的酒精灭菌：采用75%的酒精灭菌；
[0012] c.外植体的升汞灭菌：采取二次升汞消毒；
[0013] (4)外植体的接种。
[0014] 进一步的，所述的母本植株的预处理为在母本植株抽梢前一个月将其移入温室 内，进行一定的肥水管理和病虫害防治，并在取材之前两天的时候向芽条上喷洒多菌灵。所 述的多菌灵为50%可湿性粉剂800倍液的多菌灵。这样对实验材料进行预处理既可以减少 外植体表面及茸毛中隐藏的活性微生物的数量，又可以减少植物组织培养过程中微生物感 染概率，还可以保持实验过程中材料间的一致性，从而提高实验的可重复性。
[0015] 进行外植体的取材时，在植物组织培养过程中，外植体的最佳采集时间是成功建 立组培体系的前提。对于虎舌红等的表面带茸毛植物而言，污染和褐变是影响外植体存活 的重要因素。因此分别在3月中旬、5月中旬、8月中旬和11月中旬进行，取顶芽及当年生 叶片。
[0016] 进一步的，所述的外植体的清洗为切取当年生枝条和萌蘖条上的茎尖浸泡在加有 洗涤剂的水中10~60分钟，用软刷轻轻刷洗外植体的表面，除去附在外植体表面的污垢和 部分菌体，然后流水冲洗1~2个小时。
[0017] 所述的外植体的酒精灭菌为将冲洗后的外植体沥干水分，在超净工作台内放入 75%的酒精中分别消毒30秒、45秒、60秒，用无菌水冲洗三次。75%的酒精对植物细胞具 有强的穿透性的杀伤力，容易使被处理的外植体受到杀害而丧失生活力，因此把握好消毒 时间是保持外植体活性的关键。
[0018] 进一步的，所述的外植体的升汞灭菌为采取二次升汞消毒的方式进行消毒处理， 并且每次使用升汞消毒时在升汞中都含有lmol/L的盐酸。所述的外植体的升汞灭菌为采 用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次，再用升汞消毒4分钟，无菌 水冲洗5次。
[0019] 所述的外植体的接种为将消毒过的保持有生物活性的外植体接种在预先准备好 的加有益培隆的MS培养基里。
[0020] 有益效果：
[0021] 本发明的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法对母株进行预培养和多菌 灵预处理，外植体用酒精消毒后，采用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分钟，无菌水冲 洗5次，再用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次，然后接种在含有益培隆的启动培养基中。此 方法能清除虎舌红外植体表面的污菌并能使外植体保持生活力。
【附图说明】
[0022] 图1 :本发明的技术路线图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0024] 实施例1
[0025] 1、母本植株的预处理
[0026] 在母本植株抽梢前一个月将其移入温室内，进行一定的肥水管理和病虫害防治。 在取材前二天向植株上喷洒50%可湿性粉剂800倍液的多菌灵。这样对实验材料进行预处 理既可以减少外植体表面及茸毛中隐藏的活性微生物的数量，又可以减少植物组织培养过 程中微生物感染概率，还可以保持实验过程中材料间的一致性，从而提高实验的可重复性。
[0027] 2、取材时期
[0028] 分别在3月中旬、5月中旬、8月中旬和11月中旬切取顶芽及当年生叶片进行实 验。实验结果（见表1)表明8月份是虎舌红外植体污染率最高期，五月份次之，11月份最 低；就外植体褐变而言，外植体中酚含量及多酚氧化酶的氧化活性在秋季最弱，春季较弱， 以后逐渐增强，从而使褐变加重，8月份取材褐变率最高。从成活率上来看，虎舌红外植体 最佳的取材时期是在三月份，主要是因为此时期植株营养充足，芽生长点处于活跃时期，茎 尖、茎段存活率高，同时此时期体内酚含量和多酚氧化酶活性还未达到高峰，大大提高了成 活率。
[0029] 表1不同取材时期虎舌红污染率、褐变率和成活率
[0031] 3、外植体的清洗为切取当年生枝条和萌蘖条上的茎尖浸泡在加有洗涤剂的水中 10~60分钟，用软刷轻轻刷洗外植体的表面，除去附在外植体表面的污垢和部分菌体，然 后流水冲洗1~2个小时。
[0032] 4、外植体的酒精灭菌
[0033] 实验将冲洗后的外植体沥干水分，在操净工作台内放入75%的酒精中分别消毒 30秒、45秒、60秒，无菌水冲洗三次。从表2中可以看出，虎舌红茎尖适宜的酒精浸泡时间 是30秒，60秒时虽然污染率为0,但外植体的死亡率达到95%，导致其成活率低。
[0034] 表2 75%酒精不同时间对外植体的影响
[0036] 5、外植体的升采灭菌
[0037] 本研宄中采取一次升汞消毒和二次升汞消毒的方式进行消毒处理（见表3)，
[0038] 表3 0. 1 %升汞不同消毒方法对外植体的影响
[0040] 注：3+2是指先用升汞消毒3分钟，无菌水冲洗3次，再用升汞消毒2分钟；4+4是 指先用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗3次，再用升汞消毒4分钟；5+5是指先用升汞消毒5分 钟，无菌水冲洗3次，再用升汞消毒5分钟。
[0041] 试验结果见表4,结果表明：对于成活率和污染率而言，相同处理时间下，二次消 毒处理的外植体的污染率低于一次消毒的外植体，成活率明显高于一次消毒的外植体，并 且虎舌红外植体随着0. 1 %升汞处理的时间增加污染率降低，但同时成活率也呈降低的趋 势。最佳的处理时间为用升汞消毒8分钟和5+3分钟，既降低了污染率，也大大提高了虎舌 红外植体的成活率，而处理时间为10分钟和5+5分钟虽然极大程度上降低了外植体的污染 率，但却使外植体的成活率呈极大地降低趋势，分析其原因可能是升汞消毒时间过长，对外 植体的毒害作用比较大所致。综上所述，最佳的处理方法是先用升汞消毒4分钟，无菌水冲 洗3次，再用升汞消毒4分钟，能提高虎舌红的成活率，降低其污染率。
[0042] 6、将消毒过的保持有生物活性的外植体接种在预先准备好的加有益培隆的MS培 养基里。
[0043] 表4 0. 1 %升汞不同处理时间和方式对虎舌红污染率和成活率的影响
[0044]
[0045] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟 悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实 施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之 内。
【主权项】
1. 一种表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 母本植株的预处理：将母本植株移入温室内进行预培养，并进行多菌灵喷洒预处 理； (2) 外植体的取材； (3) 外植体的灭菌； a. 外植体的清洗：采用洗涤剂和水清洗； b. 外植体的酒精灭菌：采用75%的酒精灭菌； c. 外植体的升汞灭菌：采取二次升汞消毒； (4) 外植体的接种。2. 如权利要求1所述的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：所 述的母本植株的预处理为在母本植株抽梢前一个月将其移入温室内，进行一定的肥水管理 和病虫害防治，并在取材之前两天的时候向芽条上喷洒多菌灵。3. 如权利要求1所述的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：所 述的多菌灵为50%可湿性粉剂800倍液的多菌灵。4. 如权利要求1所述的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：所 述的外植体的取材为分别在3月中旬、5月中旬、8月中旬和11月中旬进行，取顶芽及当年 生叶片。5. 如权利要求1所述的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：所 述的外植体的清洗为切取当年生枝条和萌蘖条上的茎尖浸泡在加有洗涤剂的水中10~60 分钟，用软刷轻轻刷洗外植体的表面，除去附在外植体表面的污垢和部分菌体，然后流水冲 洗1~2个小时。6. 如权利要求1所述的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：所 述的外植体的酒精灭菌为将冲洗后的外植体沥干水分，在超净工作台内放入75%的酒精中 分别消毒30秒、45秒、60秒，用无菌水冲洗三次。7. 如权利要求1所述的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：所 述的外植体的升汞灭菌为采取二次升汞消毒的方式进行消毒处理，并且每次使用升汞消毒 时在升采中都含有lmol/L的盐酸。8. 如权利要求1所述的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：所 述的外植体的升汞灭菌为采用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次， 再用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次。9. 如权利要求1所述的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：所 述的外植体的接种为将消毒过的保持有生物活性的外植体接种在预先准备好的加有益培 隆的MS培养基里。
【专利摘要】本发明涉及一种表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，属于生物技术领域中的植物组织培养技术领域。本发明的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法对母株进行预培养和多菌灵预处理，外植体用酒精消毒后，采用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次，再用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次，然后接种在含有益培隆的启动培养基中。此方法能清除虎舌红外植体表面的污菌并能使外植体保持生活力。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN104920224
【申请号】CN201510391257
【发明人】曾云英, 韩承辉, 符嫦娥, 叶海跃, 万强, 马存琛
【申请人】江苏城市职业学院
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月6日