专利名称：一种茶树胞质型谷氨酰胺合成酶gs基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS的基因以及由该基因编码的蛋白，通过茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因工程技术的研究，提高茶树氮素吸收率及其抗逆性，属于基因工程技术领域。
背景技术：
谷氨酰胺合成酶广泛分布在植物体中。谷氨酰胺合成酶以多种同工酶形式定位在植物体中，主要分为两大类胞质型GSl和叶绿体型GS2。GSl由多基因家族编码，定位于细胞质中。GS2由单基因编码，大多定位于叶绿体中。同工酶是同一种或属中，由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体，呈纯聚体状态或杂聚体状态，它们是一级结构、理化性质及生理功能有所不同，但催化功能相同的多态性酶类。同工酶广泛存在于生物界中，现已有 60多种动、植物体内的同工酶被研究报道。同工酶的特点是具有明显的种属、组织和发育阶段的特异性，既可作为生理指标，又是可靠的遗传标志。谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase, GS)是植物氮吸收的关键酶，它和谷氨酸合成酶联合作用催化氨的同化，使其转变为Gln和Glu，在高等植物体内作为N的供体。 对于茶树谷氨酰胺合成酶的研究有利于提高植物的氮素利用率，增强植物的抗逆性和物种的分类等。茶树[Camellia sinensis (L.) 0. Kuntze]属于山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物。茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一，具有许多生理保健作用。在包括中国在内的许多国家，茶树是重要的木本经济作物之一。它含有许多有重要价值的次生代谢产物如黄酮类、生物碱类、多酚类化合物等，其中以多酚类化合物中的儿茶素对于人体健康效果最为突出，它不仅具有防治肿瘤的效果，而且对增强微血管强韧性，降低血糖、血脂、血压， 预防肝脏及冠状动脉硬化都有明显疗效。迄今为止，尚无茶树(龙井43)完整GS基因克隆报告。
发明内容
本发明针对迄今为止，尚无茶树(龙井43)完整GS基因克隆报告的不足，提供一种茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS的基因以及由该基因编码的蛋白。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS 基因，以茶树(龙井43)总cDNA为模板，经过PCR扩增反应得到。本发明的有益效果是本发明利用已经在NCBI中公布的部分同源序列，设计简并引物扩增获得中间保守序列，再通过Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)反应获得两端序列，DNAman软件拼接最终获得茶树(龙井43)细胞质谷氨酰胺合成酶全长序列，并完成了该基因编码区的全序列分析；另外构建pET28b-GS质粒，转化至E. coli DH5 α感受态细胞进行表达，结果在在沉淀中发现带有His标签的GS蛋白包含体。进一步，所述苹果酸脱氢酶基因Cam-cyGS全长1430bp，包含一个ATG起始密码子、一个TAG终止密码子、21bp的polyA尾巴、87bp长的5’非编码区和257bp长的3’非编码区。进一步，所述谷氨酰胺合成酶基因Cam-cyGS由龙井43茶树总RNA经过提取cDNA、 PCR扩增反应和液体培养基培养的过程得到，并编码一个茶树cy-GS蛋白，所述谷氨酰胺合成酶基因Cam-cyGS基因经过菌液PCR验证。进一步，所述PCR扩增反应设计了上游引物CyGS-Fl和下游引物cyGS_F2，其序列分别为 CyGS-Fl CCATGGGCATGCATCATACTGAATCATCGTCGT,cyGS-F2 CTCGAGAACACCCAACTGGTTTTGCACC,反应参数为95°C预变性3min ;95°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 IminlOs, 反应35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。进一步，所述PCR扩增反应设计了上游引物cyGS-5’和下游引物cyGS_3’，其序列分别为cyGS-5 ‘序列GAAAACAAACACACAGATAATATAA，cyGS-3，序列TCATGGTTTCCACAGGATGGTGGTAG，反应参数为95°C预变性3min ；95°C变性30s — 55 °C退火30s — 72°C延伸 lmin30s,反应35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。进一步，所述茶树cy-GS蛋白的分子式为C176tlH27tl8N476O524Sltl，相对分子质量为 39. 240kD，等电点PI为6. 13 ；理论推导半衰期大约为30h，不稳定参数为37. 25，属于稳定蛋白(超过40认为蛋白质不稳定)，该蛋白中含量比较多的氨基酸是Gly (40个，11. 2% )、 Ala(30个，8. 4% )、Ile (28个，7. 9% )，该蛋白中含量比较少的氨基酸是Met (7个，2. 0% )、 His(6个，1.7% )、Cys(3个，0.8% )，总的带负电荷的残基(Asp+Glu)为44，带正电荷的残基(Arg+Lys)为41，脂肪指数(Aliphatic index)为75. 11，亲水性平均数(GRAVY) 为-0. 464，预测该蛋白质为亲水性蛋白质。进一步，所述菌液PCR验证的实验参数为95°C预变性3min ；95°C变性30s — 55°C 退火45s — 72°C延伸lmin，反应35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。本发明还提供一种解决上述技术问题的技术方案如下一种含有了所述的茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因的重组质粒pET28b-GS，经PCR扩增反应得到的产物与载体 pET28b采用Nco I和Xhol I双酶切4小时后，连接、转化至E. coli DH5 α感受态细胞，倒 LB平板，筛选阳性克隆，获得表达质粒。
图1为本发明谷氨酰胺合成酶基因Cam-cyGS基因的PCR扩增；M=Marker DL2000 ；1 基因的PCR扩增产物图2为本发明谷氨酰胺合成酶基因Cam-cyGS基因蛋白质编码区域的扩增；M=Marker DL2000 ；1 蛋白质编码区域的PCR扩增产物图3为本发明重组质粒的双酶切检测；
M=Marker DL2000 ；1 双酶切的重组质粒pET28b_GS ；2 双酶切的后的cyGS ；3 双酶切后的pET28b质粒图4为本发明pET28b_GS的蛋白质电泳图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例1 茶叶总RNA的提取与cDNA的获得。采用植物总RNA纯化试剂盒(MACHEREY NAGEL公司)提取茶树(龙井43)总RNA， 将提取出的茶树总RNA采用Reverse Transcription System试剂盒(Promega公司)获得总cDNA，并将总cDNA于_20°C保存。实施例2 谷氨酰胺合成酶全序列的获得。设计上下游引物cyGS-5，和cyGS-3，cyGS-5 ‘序列GAAAACAAACACACAGATAATATAA，cyGS-3 ‘序列TCATGGTTTCCACAGGATGGTGGTAG。以茶树总cDNA为模板，PCR扩增，PCR反应程序为95°C预变性3min ；95°C变性 30s，55 °C 退火 30s，72 °C 延伸 lmin30s，反应 35 个循环；72 °C 延伸 IOmin ;4°C 保存。 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收PCR 产物，连接到PMD19-T载体(TaKaRa公司生产)上，16°C连接过夜，把连接液转移到大肠杆菌E. coli DH5ci感受态细胞中，倒LB固体培养基(含Amp)并在其表面均勻涂布 40 μ 15-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷和7 μ 1异丙基-β -D-硫代半乳糖苷，12h培养后，挑取白斑，将白斑放在LB(含Amp)液体培养基中培养，用PMD19-T载体试剂中的引物M13-47/RV-M，进行菌液PCR(菌落PCR条件为95°C预变性3min ；95°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，反应35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存)验证阳性克隆，得到 Cam-cyGS基因，送交上海英骏生物技术有限公司测序。序列分析该基因全长1430bp，包含一个ATG起始密码子和TAG终止密码子以及 21bp的polyA尾巴，87bp长的5’非编码区和257bp长的3’非编码区，编码一个含有356 个氨基残基的蛋白质。用 Protparam (http //au. expasy. org/tools/protparam. html)预 贝Ij 茶丰对 cy-GS 蛋白的理化性质，推测该蛋白分子式为C176tlH27tl8N476O524Sici，相对分子质量为39. 240kD，等电点PI为6. 13 ；理论推导半衰期大约为30h，不稳定参数为37. 25，属于稳定蛋白(超过40 认为蛋白质不稳定)。该蛋白中含量比较多的氨基酸是Gly (40个，11. 2% )、Ala(30个， 8.4% Ile(28个，7.9% )，该蛋白中含量比较少的氨基酸是Met (7个，2. 0 %)、His (6 个，1.7% )、Cys(3个，0.8% )。总的带负电荷的残基(Asp+Glu)为44，带正电荷的残基 (Arg+Lys)为 41。脂肪指数(Aliphatic index)为 75. 11。亲水性平均数(GRAVY)为-0. 464， 预测该蛋白质为亲水性蛋白质。实施例3 :pET28b-GS重组质粒的构建
设计引物cyGS-F1 :CCATGGGCATGCATCATACTGAATCATCGTCGT ；cyGS-F2 CTCGAGAACACCCAACTGGTTTTGCACC,下划线分别为 Nco I 和 XhoI酶切位点。以实施例1中Cam-cyGS基因全序列为模板，PCR扩增蛋白质编码区域，反应条件为:95°C预变性3min ；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸IminlOs，反应35个循环；72°C 延伸IOmin ；4°C保存。扩增产物(图2)与载体pET28b采用Nco I和Xhol I双酶切4小时后，连接、转化至E. coli DH5 α感受态细胞，倒LB平板，筛选阳性克隆，获得表达质粒 pET28b-GS。采用Nco I和XhoI双酶切鉴定后(图3)，送交上海英骏生物技术有限公司测序，序列比对发现实施例1结果一致，扩增的序列确为茶树cyGS编码基因。实施例4 谷氨酰胺合成酶蛋白的诱导表达将pET28b_GS重组质粒转化至E. coli Rosetta (DE3)感受态细胞，挑取单克隆于含5 ml LB液体培养基的试管中，37°C，225rpm，培养12小时，得到菌液。取Iml菌液接种于50ml的LB液体培养基中扩大培养，16°C，225rpm，振荡培养至 0D600为0. 4-1. O时(最好0. 6)；加入0. 5mM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16°C诱导表达24h ；将诱导表达好的菌液于4°C，5，OOOrpm,离心5min，收集菌体，超声波破碎，在沉淀中发现带有His标签的GS蛋白(图4)。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因，其特征在于以谷氨酰胺合成酶基因 Cam-cyGS为模板，经过PCR扩增反应得到。
2.如权利要求1所述的茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因，其特征在于所述谷氨酰胺合成酶基因Cam-cyGS全长1430bp，包含一个ATG起始密码子、一个TAG终止密码子、2Ibp 的polyA尾巴、87bp长的5’非编码区和257bp长的3’非编码区。
3.如权利要求1所述的茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因，其特征在于所述苹果酸脱氢酶基因Cam-cyGS由龙井43茶树总RNA经过提取cDNA、PCR扩增反应和液体培养基培养的过程得到，并编码一个茶树cy-GS蛋白，所述谷氨酰胺合成酶基因Cam-cyGS基因经过菌液PCR验证。
4.如权利要求1所述的茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因，其特征在于所述PCR扩增反应设计了上游引物cyGS-Fl和下游引物cyGS-F2，其序列分别为CyGS-F1 CCATGGGCATGCATCATACTGAATCATCGTCGT，CyGS-F2 CTCGAGAACACCCAACTGGTTTTGCACC，反应参数为95°C预变性3min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸IminlOs，反应 35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。
5.如权利要求3所述的茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因，其特征在于所述PCR扩增反应设计了上游引物cyGS-5’和下游引物cyGS-3’，其序列分别为cyGS-5，序列GAAAACAAACACACAGATAATATAA，cyGS-3 ‘序列TCATGGTTTCCACAGGATGGTGGTAG，反应参数为95°C预变性3min ；95°C变性30s — 55°C退火30s — 72°C延伸lmin30s，反应35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。
6.如权利要求3所述的茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因，其特征在于所述茶树 cy-GS蛋白的分子式为C1760H27Q8N4760524S1Q，相对分子质量为39. 240kD，等电点PI为6. 13 ； 理论推导的半衰期为30h，不稳定参数为37. 25，属于稳定蛋白，该蛋白中包含40个氨基酸 Gly,30个氨基酸Ala、28个氨基酸Ile、7个氨基酸Met、6个氨基酸His、3个氨基酸Cys，总的带负电荷的残基Asp和Glu的总数为44，带正电荷的残基Arg和Lys的总数为41，脂肪指数为75. 11，亲水性平均数为-0. 464。
7.如权利要求3所述的茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因，其特征在于所述菌液 PCR验证实验参数为95°C预变性3min ；95°C变性30s — 55°C退火45s — 72°C延伸lmin， 反应35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。
8.一种含有了如权利要求1所述的茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因的重组质粒 pET28b-GS，其特征在于经过PCR扩增后的产物与载体pET28b采用Nco I和Xhol I双酶切4小时后，连接、转化至E. coli DH5a感受态细胞，倒LB平板，筛选阳性克隆，获得表达质粒。
全文摘要
本发明涉及一种茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS的基因及其编码的蛋白。所述茶树胞质型谷氨酰胺合成酶GS基因，以茶树(龙井43)总cDNA为模板，经过PCR扩增反应得到。本发明利用已经在NCBI中公布的部分同源序列，设计简并引物扩增获得中间保守序列，再通过Rapid Amplification of cDNA Ends反应获得两端序列，DNAman软件拼接最终获得茶树细胞质谷氨酰胺合成酶全长序列，并完成了该基因编码区的全序列分析。
文档编号C12N15/63GK102311961SQ20101022068
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者宣守芹, 朱国萍, 潘蔚, 王晖, 王鹏, 翟羽佳, 郑基阳, 高鹏 申请人:安徽师范大学