一种抗胸苷激酶1抗体的制备方法及其在解脲支原体菌增殖中的应用
【专利说明】-种抗胸巧激酶1抗体的制备方法及其在解服支原体菌増 殖中的应用 【技术领域】
[0001] 本发明设及一种抗体的制备方法及其应用，具体讲设及一种解脈支原体胸巧激酶 l(Ureaplasma ureal}ft;ixum thymidine kinasel，UuTKl)抗体的制备方法及其在用于检测 人泌尿生殖道和呼吸道感染解脈支原体增殖度。 【【背景技术】】
[0002] 解脈支原体OJreaplasma ureal^icum，简称化）是从非淋球菌尿道炎（NGU)患 者的尿道分泌物中分离的一种没有细胞壁的原核细胞，根据其分解尿素的特性命名为解 脈支原体扣U)，其包括2个生物群，14个血清型。生物1群称为细小脈原体（化eaplasma parvum，简称化，含1、3、6、14共4个血清型，而将生物2群继续称为解脈支原体 OJreaplasma ureal^icum，简称化，含血清型2,4, 5, 7和7至13。目前关于生物1群的1 和3血清型，生物2群的4和8血清型与感染和致病性相关性的报导存在争议。
[000引人体泌尿生殖道存在的解脈支原体扣reaplasmaUreal^icum，化）大部分为正常 菌群，是常见的共生微生物，在健康人（包括婴幼儿）中是同样存在化的寄居。发现化在 孕妇生殖道的寄居率高达50-80%。所W检查出化寄居情况，该并不代表感染该种疾病， 只有部分解脈支原体亚型感染时才致病。当人的抵抗力下降时，例如体质虚弱，纵欲过度造 成性器官长期慢性充血或局部抵抗力下降，解脈支原体侵入机体组织与血液，或粘附于泌 尿生殖道上皮细胞后，该部位组织的解脈支原体大量繁殖而出现的炎症和一系列并发症症 状，称为"感染"。当泌尿生殖道发生炎症，粘膜表面受损时解脈支原体易从破损口侵入，引 起泌尿生殖道感染，但其具有潜伏期，而无临床症状，因此临床检查到化阳性，并不能判断 是携带还是感染状态。化感染后，患者大多无明显症状，很难被患者觉察，也易造成医生漏 诊。
[0004] 目前常规的解脈支原体的检测方法包括；形态学检查、支原体培养、抗原检测、血 清学方法和分子生物学方法，例如PCR技术，TDI-FP技术巧光偏振与模板指导的末端延伸 反应检测技术，微孔渗漏法，免疫组织化学，其中准确性和重复性好的为传统的病原学检测 方法，即取尿道分泌物、阴道分泌物作为支原体培养的，该也是确定化感染的金标准。该方 法利用化分解尿素时产生碱性的NHs能使酪红指示剂发生由黄变红的特性，但直接将检测 标本接种于液体培养基，若液体培养基被标本中的产酸菌污染，化产生的碱性物质即被中 和，也随之产生假阴性。因此液体培养不能准确判断支原体感染的有无，而且一种液体培养 基也不能同时判断两种支原体感染。与液体培养基相比，现提出固体培养基改良方法污染 率明显低于液体培养法，但分离阳性率无统计学差异。而分子生物学方法，例如：常规PCR、 PCR-SSCP、巧光PCR、TDI-FP (巧光偏振与模板指导的末端延伸反应检测技术）、PCR-系统 进化分析法等进行多种支原体的检测，具有快速、特异性强等优势，但巧光PCR法质控要求 高，需要相应的实验条件和设备，比较适合大型医院，作为常规检测方法有一定的限制。与 培养法检测结果比，现应用的巧光PCR法，无统计学意义。
[0005] 现有的测定解脈支原体抗体的血清学试验方法，有特异性血清学检测和非特异 性血清学检测。特异性血清学检测方法中，最常用的是补体结合试验，另有间接免疫巧光 染色检查法、生长抑制试验、代谢抑制试验、间接血凝试验、酶免疫法和酶联免疫吸附试验 巧LISA)等。非特异血清学方法有肺炎支原体冷凝集试验与MG链球菌凝集试验，对支原体 肺炎能起辅助诊断的作用。免疫组化法检测化抗原等技术也在应用。其缺点是检测特异 性抗体IgG的方法尚不能达到早期快速诊断，灵敏度比较低；MB抗原与疾病的关系，W及它 在疾病中的作用还有待进一步探讨。
[0006] 就解脈支原体感染的治疗而言，国内目前主要是抗生素。临床泌尿科、男性科、妇 科等多对就诊人员相关样本的分析方法主要是解脈支原体培养及药物敏感试验等检测，无 法区分各种亚型的，对显示阳性的患者报告和临床药物敏感试验报告，进行选择并使用抗 生素治疗，该模式可能滥用抗生素。一般而言，抗生素药物主要是大环内醋类药物（常用的 有红霉素、班己红霉素、罗红霉素、阿奇霉素）和嗟诺酬类药物（常用的有氧氣沙星、左氧氣 沙星）及大观霉素、克林霉素、克拉霉素等治疗生殖道支原体感染，疗程为1-2周。现发现 不同病症的患者对不同的抗生素的敏感性和抗药性是不同的，解脈支原体对抗生素的耐药 性问题已引起多方注意。滥用抗生素可能是导致解脈支原体耐药的重要因素，其中解脈支 原体对四环素的耐药株占10-20. 6%，对多西环素的耐药株占8-27. 5%，对红霉素的耐药 株占10-52. 4 %。解脈支原体和人型支原体对氧氣沙星的耐药株占近20 %。此外，对罗红霉 素及阿奇霉素耐药的解脈支原体也有报告。由于解脈支原体对抗生素的耐药性有日渐增加 的趋势，有专家主张在治疗解脈支原体感染时，为了减少或防止耐药株的出现，宜采用2-3 种不同类型的抗生素联合治疗。同时，还可用中药利尿消炎丸治疗。有许多长期使用抗生 素治疗的解脈支原体感染者，解脈支原体检查依然阳性，而且还出现了一些新的不适。原因 极为复杂，例如解脈支原体耐药、检测错误或试剂不过关、二重感染（长期应用抗生素者容 易出现真菌、其它不敏感细菌感染）。 【
【发明内容】
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[0007] 为克服现有检测及治疗方式中的局限性，本发明旨在采用祀标蛋白-解脈支原体 胸巧激酶1扣uTKl)，一个与解脈支原体增殖直接相关的关键酶来制备因解脈支原体增殖而 引发感染的试剂盒，利用该试剂盒可W快速、简便、准确地检测解脈支原体菌增殖并予W治 疗。
[000引为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0009] 本发明提供了一种化TK1抗体，该抗体特异性的识别整个化TK1酶和任何具有 化TK1表位活性的多肤，其中多肤包括具有酶活性/非活性的多肤、单体、2或4聚体TK1酶， 或TK1酶与其它分子形成的蛋白复合物或抑制物。
[0010] 本发明提供了一种化TK1抗原决定簇多肤，其抗原决定簇多肤为化TK1的C末端 10 肤（192-201)，其氨基酸序列为；Arg-His-His-His-Lys-Val-Pro-Asn-Arg-Pro,本发明 还提供了一种化TK1抗原，包括上述的化TK1抗原决定簇多肤或任何具有表位活性的多肤 位抗原及整个化TK1蛋白，并利用该抗原或抗原决定簇制备化TK1抗体。
[0011] 本发明提供了一种制备化TK1抗体的方法，将化TK1的C末端活性肤段与KLH交 联，免疫母鸡，提取卵黄液体，水萃取制备抗体溶液，用上述的化TK1的C末端活性肤段制备 的亲和层析柱纯化抗体，初筛得抗体。
[0012] 本发明还提供了一种化TK1抗体试剂盒，该试剂盒包含化TK1抗体，其由化TK1抗 体与化学发光检测系统结合制得的。
[0013] 本发明提供的试剂盒，可W用于检测和监视人泌尿生殖道和新生儿呼吸道感染疾 病人群感染解脈支原体的增殖度。
[0014] 本发明还提供了一种对该试剂盒的检测方法；包括硝酸纤维素膜点印染/免疫增 强发光检测系统巧化）的缩时检测方法、ELISA或免疫细胞化学涂片染色方法。
[0015] 哺乳类细胞DNA的合成有两条途径；一是从头合成途径（denovo synthesis); 是指W磯酸核糖、氨基酸、一碳单元及C〇2等简单物质为原料，经一系列酶促反应，合 成核巧酸。除某些细菌外，几乎所有的生物体均可用从头合成途径。另一是补救合 成途径（salvage pathway);即利用体内游离的碱基或核巧，经过简单的反应过程，合 成DNA的途径。在补救合成途径中，所需的胸腺喀晚核巧是必需由胸巧激酶（TK，ATP ; thymidines ' -phosphotransferase, EC. 2. 7. 1. 21，简称 TK)，催化脱氧胸巧为一磯酸胸 巧，提供合成DNA的必需前体物之一。细胞中的TK有2种同工酶形式：细胞质胸巧激酶（称 为TK1)和线粒体胸巧激酶（称为