专利名称：一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法
技术领域：
本发明涉及临床医学测定方法和检测分析，特别指一种基于磁性纳米微粒 的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法，即采用磁性纳米技术和现代荧光免疫分析技术结合，对人类工型胸苷激酶(hTKl)血液和组织液实施准确检测的新方法。
技术背景关于人胸腺嘧啶脱氧核苷激酶I型(hTKl)的技术背景人类I型胸腺嘧啶脱氧核苷激酶，中文简称为人类I型胸苷激酶；其英文名 为Human thymidine kinase,简写为hTKl。 DNA在合成之前，胸腺嘧啶脱氧核 苷(TdR)被摄入细胞并在转化成TMP时必须经过磷酸化激酶的催化，而磷酸化反 应过程必须有TK酶的催化。正常生理状况下，人细胞中的TK主要以两种同工酶的形式存在，即hTKl 和hTK2。 一般地说，hTKl主要存在于细胞质中，而hTK2则主要存在于亚细胞结 构的线粒体中。由于其中一种同工酶大量存在于胚胎组织，也有学者分别称它 们为胚胎TK(Fetal TK)和成人TK (Adult TK)。有研究发现，胚胎TK是与细胞 的分裂相关，存在于细胞质中，称之为hTKl;而成人TK存在于线粒体中，它的 表达与细胞周期无关，又称之为hTK2。或者将hTKl称为细胞质胸苷激酶，hTK2 称为线粒体胸苷激酶。hTKl基因定位在于染色体17q23. 2-q25. 3，靠近于半乳糖 激酶；而hTK2基因则定位于染色体16q22-q23. 1。事实上，在上个世纪80年代已有学者完成了 hTKl基因编码区域的cDNA分 子克隆及其序列分析。研究表明，TK1全酶分子量为96000道尔顿，其分子结构 为四聚体，等电点聚焦免疫电泳测得其等电点为8.3-8.5。 TKl的四聚体中每一单体a螺旋/ P折叠区域组成与ATP酶家系类似，其p-环是TK1酶活性调节区域， 即底物反应区域。四聚体中P折叠区域有一锌原子与e折叠区域连接。在这0-丝状带折叠的底部，干链变宽成为一个套索闭环，是dTTP负责TKl活性反馈抑 制调节的的区域，但TK1这套索环结构是不同于其它脱氧核苷酸激酶。hTKl是存在于机体中的重要激酶之一，它作为一种胸苷参与DNA合成的关 键激酶，能可逆性催化胸腺嘧啶脱氧核苷与磷酸脱氧核苷之间的转化，并真实而 客观地反映着细胞的增殖状况。正是由于hTKl与细胞分裂密切相关，在细胞分 裂Gl期含量较低，到S期后逐渐升高，至G2期达到最高，因此，编码hTKl的mRNA 及其所表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。可以说，TKl水平的高低与 DNA在细胞周期的S期DNA合成速度密切相关。 一般情况下，所观察到正常增殖 细胞TKl的水平在细胞周期的Gl和S期交界处开始升高，随着细胞进入Gl晚 期，TKl酶的水平逐渐急剧上升，直至S和G2期交界处，但在肿瘤细胞中，这种 高TKl水平从S晚期一直持续到M早期。大量离体试验结果表明，TKl在增殖 细胞和肿瘤细胞周期调控代谢过程具有特殊的意义。通常， 一些非增殖细胞的 TK1和健康人血清和组织中TK1，其含量极微或检测不到，而在异常增殖细胞或 恶性肿瘤患者中，TK1酶伴随着肿瘤细胞数的急剧增殖而升高。不同来组织增殖 细胞中细胞周期与TKl信使RNA (TKlmRNA)的表达关系是复杂的，mRNA的剪切 和翻译也是随细胞生长状态变化的，推测TKl水平主要是通过翻译后调控机制 发挥作用。而且，已有研究表明，增殖细胞生长的不同时期，TKl活性的调控则 主要是通过dTTP反馈抑制途径和底物循环方式进行调节的。按照现有研究，癌细胞异常或失控的增殖是由于正常细胞的某种或多重突 变的与增殖相关的基因引起的，因此，正常细胞中生长相关的基因突变最终的 导致相关的癌蛋白的过度表达，阻抑蛋白的缺失或突变蛋白产物表达，并伴随 一系列与细胞生长相关的酶和蛋白质调节失控。由于TKl与细胞异常增殖和肿瘤细胞表达密切相关，即在非增殖细胞和健康人血清中，含量极微或检测不到， 而在恶性肿瘤患者中伴随着肿瘤细胞的急剧增殖而升高等特征，使学术界对TK1的研究引起了广泛的关注和重视，并认为TK1有可能作为一种有价值的血清学细胞增殖标记物来检测增殖细胞的增殖活性，适用于恶性肿瘤的细胞增殖度检测。特别是已有文献表明，TK1的活性在肿瘤细胞大于总量的95%，而TK2低于 5%，在正常健康人的血清中检测很低或不可以检测，因此采用检测血清TK活性 将评估肿瘤增殖的恶性程度。hTKl在细胞异常增生时含量或活性增高，特别是 在细胞增生旺盛的早期恶性肿瘤患者的体液或血液中更是显著增高，且hTKl水 平的高低与恶性肿瘤的切除和复发呈降低和升高的趋势。曾有学者增采用12种 人癌组织进行免疫组化分析，发现TK1均呈现阳性结果，这初步证明了癌症患者 与TK1活力或含量增高有关,且进一步试验也证明，随着肿瘤细胞增殖速度明显 提高，TK1活力增强，DNA合成速度加快，从而促进了肿瘤细胞的进一步增殖，形 成一个病情不断加重的恶性循环。TK1在血清中保存是稳定的，通常在-2(TC条件下可保存5年以上，其之所 以稳定的可能原因，被认为是TK1在血清中是与其它蛋白质形成一大分子稳定 的复合物有关。不过，关于血清TK1的结构和性质仍然是不清楚的，其中包括 这酶在细胞内被破坏或者是由细胞以活性或非活性的状态被分泌出去。目前关于hTKl分析测定方法的技术背景由于体内恶性肿瘤细胞的增殖不是按照正常细胞的2倍体分裂方式，根据这 种无休止恶性分裂的肿瘤细胞特征，建立了肿瘤细胞增殖标志物的理论基础。过 去，通过体外培养细胞，观察到胸苷(Thymidine,简称Thd)参与到DNA合成。放 射性同位素标记的胸苷(放射自显影)或胸苷的类似物可以检测肿瘤细胞中DNA 合成速度，发现细胞DNA的复制仅仅限定在细胞特定周期(S期)。这种同位素标 记方法检测肿瘤细胞中DNA合成速度，计数细胞周期中S期细胞数增殖的比例，已被应用于检测细胞的增殖速度，可用于对患者肿瘤细胞增殖度的检测和评估患 者预后的十分有意义的参数。S-期细胞增殖指数高预示患者肿瘤预后差。以后采用胸苷的类似物溴代尿苷(BrdU)的摄入法以及它的抗体应用到流式细胞DNA 检测仪，定量检测DNA合成的速度与S期细胞增殖的速率相关性，但使用这种同位 素标记胸苷或BrdU的方法需要在活细胞中进行，仅仅是限于研究工作和有限的 患者检测，且流式细胞计的技术不可能鉴别细胞周期中GfGi期的增殖细胞和非 增殖细胞，加之S期细胞成分复杂，也不可能用流式细胞计的技术分离恶性肿瘤 细胞和良性肿瘤细胞。后来通过免疫组化技术，基因组学和蛋白质组学等等技术 对组织活检样本分析，可以检测到肿瘤细胞中许多与生长相关联的蛋白质或酶 的水平异常改变，检测患者肿瘤疾病期中的异常蛋白质或酶升降水平，将疾病发 现或复发风险和后评估提供有意义临床参数。在血清中检测这类异常蛋白或肿瘤标志物的升降水平，可以帮助评估肿瘤早 期发生，肿瘤全切除术后的效果，疾病复发和预后评估。基于肿瘤细胞增殖标 志物的理论基础是由于肿瘤细胞失出正常细胞生长调控导致细胞恶性增殖，这 一理论引导研究开发一种准确、无侵害性的血清学检测方法，即在现代仪器可 能检测出肿瘤以前，将可能更早期检测已有肿瘤疾病或潜在的恶变，将给患者 提供较好的治疗时机。因此，人们一直在寻求与肿瘤细胞增殖生长密切相关的， 同时可用于血清学和组织学的肿瘤细胞增殖标志物标记物，如CEA， CA19-9， CA125, CA15-3，因其特异性的问题已在临床应用上有争议。当然，通过血液循环 类肿瘤标记物不同特性的信息及其对上述标志物的检测，仍为临床提供了许多 有价值的参考和辅助诊断。hTKl在生长旺盛的细胞中表达升高，特别是肿瘤细胞，它是一种较为敏感 的新的肝癌标志物，它能可逆性催化胸腺嘧啶脱氧核苷与磷酸脱氧核苷之间的 转化，它与细胞的分裂和增殖有密切关系。而且，hTKl是一好的既适用于血清学也适用于组织学的广谱型细胞增殖标记物，已用于人群体检，恶性肿瘤的早期 发现，监控肿瘤患者治疗效果和评估预后。人体液中hTKl的水平可以间接地反映体内是否有增生活跃的细胞，hTKl的水平可以判断肿瘤的发生、发展和预 后。正如前述，细胞DNA合成速度，与其细胞周期S期细胞百分比比值关系己经 被流式细胞计证实，肿瘤组织中与正常组织比较，低分化的肿瘤与高分化肿瘤 比较，低分化肿瘤细胞TK1的检测值升高；细胞增殖度缓慢的鼠肾癌细胞中的TK1 活性高于正常值的2-5倍。特别是基于在TK1的活性在肿瘤细胞大于总量的95。/。， 而TK2低于5。/。，在正常健康人的血清中检测很低或不可以检测，因此采用检测血 清TK活性将评估肿瘤增殖的恶性程度。而且，采用hTgl活性检测，对实体肿瘤 细胞增殖度也有许多报导。前列腺癌、胃癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、 头颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肉瘤等恶性肿瘤TK1活性较良性肿瘤和正常人明显增 高并显示出有统计学意义的差别；而且，TK1的活性检测同样适用于检测癌组织 中细胞中细胞质提取液TK1活性，并被认为是一种评估肿瘤细胞增殖度的好方 法。有研究从多个乳腺癌患者的癌组织中提取细胞的细胞质组分并进行TK1活性 检测，结果显示出高的TK1活性与肿瘤增殖度差相关。而且，TK1是一个好的增殖 细胞和肿瘤细胞的标记物，它的浓度变化可以被用于监控手术治疗患者的效果。 因此，发明一种更加准确、实用和稳定性好、特异性高的方法检测hTKl活性或 含量，对于肿瘤早期诊断，特别是乳癌的早期诊断具有特别重要的临床意义。在过去的临床和科研工作中，用于检测或监测hTKl含量或活性的方法主要 有放射免疫法(RIA)、酶联免疫法、化学发光法、免疫组化法、western blotting 法、点免疫印迹化学发光法、ELISA法、免疫增强化学发光法、压电石英晶片免 疫传感器法等。虽然，目前这些实验室的检测方法均能较为准确的测定出癌变 组织或体液及血液(血清或血浆)中hTKl的含量或活性，但过去主要采用的放射 免疫法(RlA)检测血清hTKl的酶活性，即可以通过放射性同位素标记的3H胸苷的方法检测血清中总量TK活性来表示血清TK1 (简称STK1)的活性，但这方法的 灵敏度不高，不适应于临床血清中TK1的检测；以后又发展了胸苷类似物-'251-5-碘-2-脱氧尿苷作为底物，建立一种灵敏度较高的血清TK1 (STK)放射性同位素检 测方法，应用于人血清学肿瘤细胞增殖标记物检测。尽管国际上已有学者采用1251 标记尿嘧啶核苷放射性酶分析法可测定出hTKl蛋白的活性和含量，但该方法 会部分受到人胸苷激酶2活性的影响，测定方法特异性不高,灵敏度、重复性和 稳定性均较差，临床用于诊断和鉴别诊断存在着较大的局限性和误差，且无法进 行临床的早期诊断，有时甚至出现假阴性或假阳性的结果，而且有一定的放射性 污染，给临床诊断和鉴别诊断带来了很大困难。尤其值得一提的是，采用1251标 记脱氧尿嘧啶不仅半衰期短(仅在4周时间)，且具有放射性污染，久而久之容易 造成对检测者健康损伤和环境污染，而且胸苷类似物-1251-5-碘-2-脱氧尿苷并非 是TK1活性分析的专一性底物,并且在血清TK的活性测定中，对pH和温度非常 敏感，常产生不准确结果，且需要使用贵重的检测仪器(Y闪烁仪)，这种检测需 要特别的设备和熟练技术人员操作，因此，该检测技术在临床应用上有很大的局 限性，也很难在临床上广泛推广使用。后来，又有学者采用酶法和夹心ELISA方 法作血清学TK1鉴定，没有发现健康人血清TK1和癌症患者血清TK1之间有显著 性差异，认为是夹心ELISA方法不灵敏所致。以后国外有报道，应用Western Blotting检测血清中hTKl的含量或活性，且能进行定量分析,在对肿瘤细胞的评 估方面远远优于胸腺嘧啶掺入法，因为胸苷激酶1测定直接代表该肿瘤中的胸 苷激酶1量而不受体外检测条件的干扰,也免除了影响外源性胸腺嘧啶掺入DNA 内的影响，但在临床应用并不适用；点免疫印迹发光法虽然利用了发光技术的高 灵敏性，并通过X线片曝光，避免了使用发光检测仪，且可长期保存实验结果，但 需通过设立标准品对照，并根据斑点的深浅进行定量分析，但因这些方法操作繁 琐，也难以在临床上普及应用。而增强发光-免疫点印迹法主要参考印迹法原理，该方法操作复杂和繁琐，不仅需时长，需要有特异好和灵敏度高的抗TK1抗体作为探测血清或者组织中微量的TK1分子的探针，而且需要大量贵重的仪器设备和 经验丰富的专业操作人员，不仅无法在基层医疗单位普及应用，在大型综合性医 院也很难临床应用。即使是我们不久前曾研究成功了 hTKl压电石英晶片免疫传 感器法，且具有较上述方法更多的特点和优势，但也存在着检测时间较长(40-60 分钟)、检测难度较大、特别是每次只能测定一个样品，无法同时批量测定样品 等，这在临床上应用几乎非常困难。尤其是上述所有检测TK1的方法，基本上都 需要较为昂贵和特殊的仪器设备及配套试剂，或者需要专业检测设备，加上操作 过程繁琐，检测时间较长，技术要求高，需要一定仪器等，无法在基层医疗单位或 家庭普及应用。但是，如果有特异性强、亲和力好和灵敏度高的两种TK1抗体， 免疫夹心法仍是很有前途的方法，这也是本发明采用扬长避短的依据之一。由于hTKl目前定量检测体液中的hTKl尚无一个满意的方法,研究和建立及 发明一种新型、灵敏、准确、实用的荧光免疫分析和检测技术对于观察和检测 体液(特别是血液)中的hTKl含量和水平具有重要的诊断价值和临床意义。目前关于荧光免疫分析测定方法的技术背景荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种，它是将某抗原或抗体用荧 光素进行标记，在与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定抗原抗体复合物中 荧光素的一种免疫技术，也被称为免疫荧光素技术。很早以来就有一些学者试 图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原 物质的定位，而这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体 技术。荧光抗体技术是抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法， 也是荧光显微镜技术；而免疫荧光测定技术，则是在抗原抗体反应后，利用特 殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。实际上，荧光免疫法按其 反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种，但都是利用物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发 出荧光。当停止提供激发能量，荧光现象随即终止。与放射免疫法相比，荧光 免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。可以说，荧光免疫测定， 与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用广泛。荧光免疫技荧光免疫技术正是这种先应用致荧光物质对单克隆抗体进行标 记，检测相应抗原的方法。目前主要有竞争法和双抗体夹心法。通常，双抗夹 心法是先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然 后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去 未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体一抗 原一抗体复合物。最后根据检测产物发出的荧光强度，即可对被测蛋白抗原进 行定量。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。荧光免疫分析(FIA)是历史最悠久的 -种标记免疫分析，灵敏度很高。它在 临床疾病(包括恶性肿瘤)诊断方面有着极为广泛的用途。但是生物样品(如血清)本身的荧光位于400-600nm，与常用的荧光标记物(如FITC)的荧光发射光谱 产生重叠，从而，容易对自然本底荧光产生过大的干扰，并直接影响到检测结 果的敏感性和准确性。现代荧光免疫分析作为一种高灵敏分析技术已被广泛应用到医学，生物学 和环境学等领域，尤其是酶促荧光免疫分析，利用具有潜在荧光的底物作为酶 标物催化放大的显示系统，由于累积放大和荧光的高敏感性，使方法学的灵敏 度提高很多。但传统的免疫反应都是在酶标板中进行，抗原或抗体分子固定于 酶标板孔表面，由于酶标板孔比表面积小，抗原抗体分子固定量有限。酶标板 孔反应界面相对较小，抗原抗体分子的免疫反应性和标记酶分子的催化活性均 受到影响，造成免疫反应和酶催化反应效率不高，反应不均匀，且耗时长。而 微颗粒由于其比表面积大，具有生物分子固定量大、免疫反应快、分离方便等优点，被作为免疫分析的固相载体已得到研究学者和仪器厂家的重视。ABBOTT 公司采用多孔的塑料微颗粒作为固相载体，碱性磷酸酶为标记用酶，以4-甲基 伞型酮磷酸盐(4-MUP)为酶底物，发展了 IMX全自动酶免疫分析系统，其抗原抗体结合反应在塑料微颗粒固相上完成，分析仪需将塑料微颗粒转移至特定的玻璃纤维上，再加入洗涤缓冲液将没有结合的抗原或抗体被洗涤下去，而结合于塑料微粒固相上的抗原抗体则因微粒与玻璃纤维的不可逆结合而保留在玻璃纤维上。这种洗涤分离过程的效果虽然比较好，但是过程较为复杂，时间亦比较长。发明内容本发明的目的是针对背景技术中存在的缺点和问题加以改进、创新，提供 一种基于酶催化反应的高灵敏免疫分析技术，其检测灵敏度可达到pg/ml甚至 更低，完全可满足血清中hTKl含量检测的要求，且其使用的酶标记试剂与ELISA 所用一样，所用标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、 制备方法成熟、成本较为低廉。而磁性颗粒(MP)性能稳定，功能化后可方便地 实现抗原或抗体的固定化，并可均匀分散在液相中与相应的抗体或抗原反应， 在外加磁场的作用下，可快速有效地实现免疫复合物与反应液的分离，具有固定 均匀、特异性高、分离快、重现性好等特点，为样品的分离、富集和提纯提供了 很大方便。针对传统检测方法的不足，本发明结合酶催化荧光免疫分析技术和 核壳型超顺磁性纳米颗粒的优点，建立一种快速简便的高通量人胸苷激酶免疫 检测技术，用于hTKl的临床检测。本发明的目的通过以下技术方案实现本发明hTKl包被的核壳型磁性颗粒(hTKlTMP)的制备包括以下步骤 l)磁性纳米颗粒的制备:采用液相共沉淀方法，分别将一定浓度的FeCl3化0 和FeCl2 '犯20在氨性溶液中共沉淀，静止分层并去掉上层清液后，立即加入浓度为20-30%的四甲基氢氧化铵溶液，再用超声法分散后，再用砂漏斗过滤，除去 其中较大的磁性纳米颗粒，即可得到颜色为灰褐色、且磁性纳米颗粒大小均匀一致的溶液；2) 磁性纳米颗粒的氨基硅烷化吸取一定剂量的磁性纳米颗粒溶液、并加 入至在100-200 ml异丙醇溶液中；用超声法将磁性纳米颗粒进行分散；同时， 边搅拌边加入3-6 g聚乙二醇(PEG-4000)，继续搅拌10-20min后加入适量蒸 馏水，然后加入O. 1-0.3ml正硅酸乙酯(TES0)水解形成硅壳层；在特定磁场作 用下，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤干净后，分散于无水乙醇中再加入适量蒸 馏水后，在不断搅拌下加入0. 1-0. 3ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，形成 氨基化硅烷壳层；在特定磁场作用下，分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤干净后， 分散于PH7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，所得物质即为氨基硅烷化的磁性 纳米颗粒(丽Ps);3) 磁性纳米颗粒标记人类I型胸苷激酶(hTKl):将上述氨基硅烷化的 磁性纳米颗粒(MNPs)用戊二醛活化，用pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗 涤干净后，再分散于相同的PBS中；然后，直接在此PBS溶液中加入一定剂量 的hTKl (用基因克隆技术，在大肠杆菌中表达hTKl基因，制备得到hTKl的 融合蛋白)，在一定条件下反应O. 5-1.5h，即可将hTKl共价固定于MNPs上， 得到hTKl包被的磁性纳米颗粒(hTKl-丽Ps);4) 封闭在hTKl-MP分散溶液中加入甘氨酸溶液反应1 h，即可封闭磁 性纳米颗粒表面的活性醛基；最后，用pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤 干净后，再分散于相同的PBS中；5) 保存将hTK卜MNPs保存在4"C的冰箱中备用。 本发明hTKl酶催化荧光检测包括以下步骤采用竞争免疫分析方法，将待测hTKl与辣根过氧化物酶标记的hTKl单克隆抗体(服P-Ab)反应30-60min，再加入同体积的hTKl-MP，在37'C下竞争反应 30-60min，用pH7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲溶液洗涤干净后，在特定磁场作用下分离， 并分散于PH7. 0-7. 6磷酸盐缓冲溶液中，加入一定浓度的对羟基苯丙酸(HPPA)、 过氧化氢(HA)和磷酸盐缓冲溶液，反应0.5-lh，在特定磁场作用下分层；移 取上层清液、并置于荧光比色皿中，用紫外光激发，测量可见光处的荧光强度； 测试溶液的荧光强度随着试样中的hTKl的浓度增加而减弱，荧光响应与hTKl在 0. 0卜lng/ml之间成线性关系，从而实现对hTKl的准确测定，其检测下限可达到 0. 008 ng/ml;通常情况下，由于恶性肿瘤(乳癌)等血清样品中的hTKl浓度约为 ng/ml水平，所以，采用此灵敏度高的方法可以进行人体血清中hTKl浓度的测定。 本发明的技术原理采用竞争免疫分析方法，将待测hTKl和hTKl-MP共同与辣根过氧化物酶标 记的hTKl单克隆抗体(HRP-Ab)竞争反应，并在磁场作用下分离，将结合了 HRP-Ab的hTKl-MP加至对羟基苯丙酸(HPPA)溶液中，催化产生强荧光的二聚体 化合物，导致荧光强度增强(图1)。待测溶液中hTKl浓度越大，结合到hTK卜MP 的HRP-Ab就越少，荧光强度变化也小，因此可以根据荧光强度的变化来定量溶 液中hTKl的浓度，实现人体血清中hTKl浓度的测定。本发明的主要技术特点① 本发明采用液相共沉淀方法进行磁性纳米颗粒的制备，不仅纳米颗粒均 匀一致,而且,实际操作容易，方法简单，试剂成本低廉。② 本发明应用3-氨基丙基三乙氧基硅烷材料，其技术特点是能在该磁性纳 米颗粒表面形成生物相容性良好的氨基硅烷化壳层，改善了磁性纳米颗粒的分 散性和稳定性，且固定化的hTKl分子的免疫反应活性提高，反应速度加快，其整 个免疫反应可以在40 min以内完成。③ 本发明设计的分析检测方法结合了磁性纳米颗粒富集与酶催化反应的双重效果，其技术特点是发挥了磁性纳米颗粒富集，以提高单位体积内待检物的浓 度，以及酶催化反应的高效和特异的特点，从而大大提高了该方法对血清中hTKl检测的灵敏度，其检测下限可达到0. 008ng/ml。 本发明的主要技术优点① 检测方法简单,通过将hTKl抗原事先共价固定于氨基硅烷化的核壳型磁 性纳米颗粒上，简化了测定步骤。② 氨基硅烷化的核壳型磁性纳米颗粒性能稳定，生物相容性好，固定化hTKl 抗原具有良好的免疫反应活性，确保了分析方法的高灵敏度。③ 硅烷化的核壳型磁性纳米颗粒可均匀分散在液相中与相应的抗体或抗原 反应，具有固定均匀、特异性高、重现性好等特点，由于反应为近均相反应， 反应速度快。④ 在外加磁场的作用下，可快速有效地实现核壳型磁性纳米颗粒的免疫复 合物与反应液的分离，为样品的分离、富集提供了很大方便。⑤方法操作简单，易于实现自动化检测，可完成大批量的测试任务。
本方法对hTKl具有良好的响应特异性。⑦ 本方法采用了酶催化方法，利用过氧化物酶催化HPPA氧化形成强荧光二 聚体，可获得极高的检测灵敏度。⑧ 本方法结合酶催化技术和核壳型磁性纳米颗粒的高生物相容性、分散性 和分离快的特点，可实现hTKl的快速检测，可望成为一个hTKl新的可靠检测 方法，用于肿瘤病人早期诊断的临床检测。本发明的主要创新点 .① 将3-氨基丙基三乙氧基硅烷在磁性纳米颗粒用作为hTKl的固定化载体材 料，确保了 hTKl分子高免疫反应活性，提高了反应速度。② 以辣根过氧化物酶为标记酶，对羟基苯丙酸为底物发展了一种hTKl酶催化荧光免疫分析方法。③ 采用竞争免疫分析方法，并将辣根过氧化物酶标记的hTKl单克隆抗体与待测hTKl先反应一段时间，再和hTKl-MP竞争反应，提高低浓度待测hTKl与 标记抗体的免疫反应效率。④ 在磁场作用下，实现血清中hTKl的富集，提高了 hTKl的检测灵敏度。
图1是本发明荧光响应机理示意图 图2是hTKl荧光免疫分析示意图 图3是荧光响应信号对hTKl浓度的校正曲线具体实施方式
实施例一hTKl包被核壳型磁性颗粒的制备① 磁性纳米颗粒(MNPs)的制备分别准确称取O. 59g FeCl3 H"和 0. 40FeCl2 4H力溶于4 ml 2M的HC1中，使其浓度分别为0.82 M和O. 43 M。迅速 混合于250 ml三口烧瓶中，再迅速滴加40 ml 1 M的氨水，5 min后加入O. 0202g 抗坏血酸(分析纯)，搅拌30 min，静止分层并去掉上层清液，加入1.5 ml 25%的 四甲基氢氧化铵(分析纯)溶液，搅拌10min，加入蒸馏水使其总体积为40 ml，超 声波振荡15 min，用砂漏斗过滤，除去大颗粒即得磁性纳米颗粒，得到灰褐色磁 性纳米颗粒溶液。② 磁性纳米颗粒的氨基硅烷化将lml磁性纳米颗粒与100ml异丙醇混合并 超声30min，边搅拌边加入3g聚乙二醇(4000,分析纯)，继续搅拌10min后，加入9 ml蒸馏水，再搅拌IO min，加入O. lml四乙氧基硅垸(TEOS，分析纯)，搅泮 24h(450rpm/min);在磁场作用下，用无水乙醇和蒸馏水各洗3次，每次3 min,分 散于9.5ml无水乙醇中，加入0.5ml水，搅拌下加0.2 ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，继续搅拌8h(450rpm/min)，在磁场作用下用无水乙醇和蒸馏水各洗3次，每次 3min，并分散于5 ml pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液(PB,由1/30M Na2HP04和1/30M KH2P(^ 成比例配成)溶液中备用，所得物质即为氨基硅烷化的磁性纳米颗粒。③ 磁性纳米颗粒(MNPs)标记hTKl:取lml上述磁性纳米颗粒，加入100pl 2.5 %戊二醛活化90min，用pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，每次3 min，分散于lml pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入20111 0.01mg/ml hTKl，反应l h，得到hTKl包被 的磁性纳米颗粒。④ 封闭取l ml hTKl包被核壳型磁性颗粒，加2ml 20mg/ml甘氨酸封闭lh， 用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，分散于lml磷酸盐缓冲溶液中。(D保存将hTKl包被核壳型磁性颗粒保存在4°C的冰箱中备用。实施例二hTKl的检测取20 pl不同浓度(0-2. Ong/ml)的hTKl溶液分别与10|al50ng/ml辣根过氧 化物酶标记的hTKl单克隆抗体(通过用大肠杆菌表达和纯化的人胸苷激酶免疫 Balb/C小鼠，免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，HAT选择培养和ELISA筛选阳 性克隆，阳性克隆杂交瘤注入小鼠腹腔制备腹水，再纯化制得)反应40min，再加 入10^1磁性纳米颗粒标记hTK(hTKl-MNPs)，在37t:条件下反应40min，再用磷酸 盐缓冲溶液(pH二7. 4)洗涤3次，在磁场作用下分离后，分散于1(^1 pH=7. 4磷酸 盐缓冲溶液中，依次加入150|il pH5. 5磷酸盐缓冲溶液，20ial 4.4X10、 HPPA 和20pl 8.8X10—4 M &02，反应30min，在磁场作用下，用微量加样器吸取上层清 液20(^1置于荧光比色皿中，然后用F-4500荧光光度仪(Hitachi High-Technologies Corporation )进行荧光检测，在286nm处激发，测量407， 处的荧光强度。荧光增强强度与试样中的hTKl的浓度成反比，实验结果见图3。 通过线性回归分析显示，荧光响应与hTKl浓度在0. 01ng/ml到lng/ml之间成线性关系，检测下限为0.008 ng/ml，表明本酶催化荧光免疫分析可以对hTKl进行 准确的测定。 应用实施例对临床血清样品检测利用本方法对4例正常血清样品和4例肝癌血清样品，分别进行4次平行 测定。即用微量加样器分别准确吸取2)lll各种血清样品置于不同的试管中，再用 pH7. 4磷酸盐缓冲溶液将各种血清样品分别稀释10倍至20 pl，并彩色记号笔做 好标记；然后，分别与10(il 50 ng/ml HRP-Ab反应40min;再分别加入10|il hTKl-丽Ps,在37。C恒温水浴的条件下反应40min，再分别用磷酸盐缓冲溶液 (p^7.4)洗涤3次;在磁场作用下进行分离后，将其各自分散于10 pl磷酸盐缓 冲溶液(p!K7.4)中，依次加入150jLi1 pH5. 5磷酸盐缓冲溶液、20 pl 4. 4X10—4M HPPA和20(il 8. 8 X 10—4 M HA,反应lh,再在磁场作用下，取上层清液200|a1置于 荧光比色皿中，用F-4500荧光光度仪进行荧光检测，在波长286nm处激发，测量 波长407nm处的荧光强度。4例正常血清样品的荧光强度分别为305. 9±4. 2、 302.9±5.7、 299. 3土3.9和300.6士4.0:而4例肝癌血清样品的荧光强度则分 别为271.5士3. 4、 268. 1 ±5. 5、 270. 5±3. 7和265. 4 ±4.8。结果显示，肝癌 血清样品经稀释10倍后荧光强度约为270， hTKl的浓度都高于2. 0 ng/ml 。正 常的血清样品荧光强度约为300， hTKl浓度约为0.1 ng/ml。正常的血清样品 中的hTK含量明显高于正常血清样品，表明本方法可以满足血清中hTKl浓度的本发明实施的注意事项① 所用FeCl3 H20和FeCl2 4H20用量比例应准确；反应过程中添加氨水要 迅速。② 在进行氨基硅烷化反应前需要加入聚乙二醇；另外，氨基硅烷化反应时，一定要搅拌均匀。③ 在进行磁性纳米颗粒标记hTKl时，其磷酸盐缓冲溶液的pH值尽可能控制 为7.4。④ 磁性颗粒封闭时不需要洗涤，磁性颗粒封闭完后要洗涤干净；hTKl包被 核壳型磁性颗粒保存在4"C的冰箱中，不要冰冻。 进行hTKl检测时，应先让hTKl溶液和辣根过氧化物酶标记的hTKl单克 隆抗体反应后，再加磁性纳米颗粒标记hTKl进行竞争反应。⑥ 进行hTKl检测时，所有酶催化反应时间务必一致，均为30 min;另外,其 底物磷酸盐缓冲溶液的pH值为5. 5。⑦ 在进行hTKl血清标本检测时，血清样品先用pH7. 4磷酸盐缓冲溶液稀释 IO倍再进行检测。⑧ 同样，在进行hTKl血清标本检测时，血清标本稀释液应先与辣根过氧化 物酶标记的hTKl单克隆抗体反应后再加入磁性纳米颗粒标记hTKl进行竞争反 应；酶催化反应时间要一致，为30 min;底物磷酸盐缓冲溶液的pH值为5. 5。⑨ 本发明中要求技术保密的部分先让hTKl溶液辣根过氧化物酶标记的 hTKl单克隆抗体反应时间10-60 min，再加入磁性纳米颗粒标记hTKl进行竞争 反应;酶催化反应底物磷酸盐缓冲溶液的pH值范围3. 5-7. 5;血清样品检测前用 磷酸盐缓冲溶液稀释倍数2-100倍。本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对 本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前题下，本领域中的 学者或工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本 发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，己经全部记在权利要求书中。
权利要求
1、一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法，其特征在于，hTK1包被的核壳型磁性颗粒(hTK1-MP)的制备包括以下步骤1)磁性纳米颗粒的制备采用液相共沉淀方法，分别将一定浓度的FeCl3·H2O和FeCl2·4H2O在氨性溶液中共沉淀，静止分层并去掉上层清液后，立即加入浓度为20-30％的四甲基氢氧化铵溶液，再用超声法分散后，再用砂漏斗过滤，除去其中较大的磁性纳米颗粒，即可得到颜色为灰褐色、且磁性纳米颗粒大小均匀一致的溶液；2)磁性纳米颗粒的氨基硅烷化吸取一定剂量的磁性纳米颗粒溶液、并加入至在100-200ml异丙醇溶液中；用超声法将磁性纳米颗粒进行分散；同时，边搅拌边加入3-6g聚乙二醇(PEG-4000)，继续搅拌10-20min后加入适量蒸馏水，然后加入0.1-0.3ml正硅酸乙酯(TESO)水解形成硅壳层；在特定磁场作用下，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤干净后，分散于无水乙醇中；再加入适量蒸馏水后，在不断搅拌下加入0.1-0.3ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，形成氨基化硅烷壳层；在特定磁场作用下，分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤干净后，分散于pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，所得物质即为氨基硅烷化的磁性纳米颗粒(MNPs)；3)磁性纳米颗粒标记人类I型胸苷激酶(hTK1)将上述氨基硅烷化的磁性纳米颗粒(MNPs)用戊二醛活化，用pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤干净后，再分散于相同的PBS中；然后，直接在此PBS溶液中加入一定剂量的hTK1(用基因克隆技术，在大肠杆菌中表达hTK1基因，制备得到hTK1的融合蛋白)，在一定条件下反应0.5-1.5h，即可将hTK1共价固定于MNPs上，得到hTK1包被的磁性纳米颗粒(hTK1-MNPs)；4)封闭在hTK1-MP分散溶液中加入甘氨酸溶液反应1h，即可封闭磁性纳米颗粒表面的活性醛基；最后，用pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤干净后，再分散于相同的PBS中；5)保存将hTK1-MNPs保存在4℃的冰箱中备用。
2、 一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法，其特征在于， hTKl酶催化荧光检测包括以下步骤采用竞争免疫分析方法，将待测hTKl与辣根过氧化物酵标记的hTKl单克 隆抗体(HRP-Ab)反应30-60min，再加入同体积的hTKl-MP，在37。C下竞争反应 30-60min，用pH7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲溶液洗涤干净后，在特定磁场作用下分离， 并分散于pH7. 0-7. 6磷酸盐缓冲溶液中，加入一定浓度的对羟基苯丙酸(HPPA)、 过氧化氢(H202 )和磷酸盐缓冲溶液，反应0.5-lh，在特定磁场作用下分层；移 取上层清液、并置于荧光比色皿中，用紫外光激发，测量可见光处的荧光强度； 测试溶液的荧光强度随着试样中的hTKl的浓度增加而减弱，荧光响应与hTKl在 0. 01-lng/ml之间成线性关系，从而实现对hTKl的准确测定，其检测下限可达到 0. 008 ng/ml;通常情况下，由于恶性肿瘤(乳癌)等血清样品中的hTKl浓度约为 ng/ml水平，所以，采用此灵敏度高的方法可以进行人体血清中hTKl浓度的测定。
全文摘要
本发明涉及一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法。本发明建立一种快速简便的高通量人胸苷激酶(hTK1)免疫检测技术，用于hTK1的临床检测。主要通过戊二醛将hTK1共价固定于氨基硅烷化的超顺磁性纳米颗粒固定化载体表面，采用竞争性免疫分析方法，以辣根过氧化物酶为酶标记、对羟基苯丙酸为荧光底物，实现了对hTK1的测定。本方面采用的硅烷化的核壳型磁性纳米颗粒可均匀分散在液相中，具有固定均匀、特异性高、重现性好、反应速度快等特点，在外加磁场的作用下，可快速有效地实现核壳型磁性纳米颗粒的免疫复合物与反应液的分离与富集，分析方法操作简单、准确、灵敏、快速，易于实现自动化检测，可完成大批量的测试任务。
文档编号G01N33/532GK101231288SQ20081003061
公开日2008年7月30日 申请日期2008年1月31日 优先权日2008年1月31日
发明者宇 丁, 丁克祥, 莉 刘, 刘卫国, 吴朝阳, 费定宇 申请人:丁克祥