专利名称：胸苷酸合酶mRNA干扰肽作为肿瘤治疗剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及运用mRNA体外展示筛选胸苷酸合酶mRNA干扰肽的制备及其在治疗恶性肿瘤中的应用。
背景技术：
肿瘤等重大疾病是危害人类健康的主要疾病，也是当前全球研究的热点。目前临床上应用的抗肿瘤药物仍以细胞毒类药物为主，这类药物对肿瘤虽然具有一定的疗效，但存在选择性差、毒副作用大等缺点。近年来随着分子生物学的发展，人们对肿瘤发生发展的分子机制的了解不断深入，发现了肿瘤的发生与一些特异的基因的特殊表达密切相关，如肿瘤组织的TS、EGF、VEGF、bFGF等基因相比较正常组织都有过表达现象，从而引起了肿瘤细胞的过分增殖，引起肿瘤的发生。从而为肿瘤治疗找到许多新的靶点，提供了新的模式。目前的针对这些基因治疗的主要策略是采用中和性抗体、反义寡核苷酸或干扰性RNA、可溶性受体、肽类受体拮抗剂。这些治疗策略中有些已经进入临床使用或正在进行临床试验。
应用展示技术筛选不同功能的核酸、肽和蛋白是近年的研究热点，目前应用的展示技术包括噬菌体展示技术、核糖体展示技术及mRNA体外展示技术等。展示技术已用于多种功能肽的鉴定。但是通过展示技术筛选靶RNA干扰肽用于肿瘤治疗未见报道。本发明主要涉及利用mRNA体外展示技术由大容量多肽库中(＞1013)筛选与胸苷酸合酶mRNA结合的多肽(干扰肽)从而抑制胸苷酸合酶的表达，达到抑制和治疗肿瘤的效果。为解决肿瘤这一医学难题找到了新的治疗策略。
胸苷酸合成酶是生物体内催化胸苷酸合成所必需的酶，多年来一直作为肿瘤化疗的重要靶酶。对TS基因调控机制的研究表明基因扩增、转录、翻译和翻译后过程都参与了TS表达的调控。除具催化活性外，TS还是一种RNA结合蛋白，TS可与自身的mRNA结合形成TS-mRNA复合物，使mRNA翻译受阻。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)等抗代谢药物可与TS蛋白结合，结合后的复合物不能与TS mRNA作用，使上述负反馈调控机制丧失，导致体内TS的表达升高，这种翻译自调控模型是肿瘤细胞产生抗药性的重要分子机制之一。本发明主要涉及通过展示技术获得与TS mRNA结合的亲和肽，利用亲和肽抑制TS基因表达，达到治疗肿瘤的目的。运用此方法可进行靶RNA干扰肽的筛选，因此在开发抗肿瘤药物方面具有良好的产业化前景。
发明内容
本发明涉及mRNA体外展示技术筛选胸苷酸合酶mRNA干扰肽的方法及其作为肿瘤治疗剂的应用。它主要包含下述步骤[1]体外合成编码多肽库的DNA库，经过体外转录、翻译合成蛋白质库。
蛋白质库与固定在载体的胸苷酸合酶mRNA进行筛选反应。得到具有胸苷酸合酶mRNA亲和性的多肽分子。
通过凝胶阻滞实验证明多肽分子与胸苷酸合酶mRNA的体外亲和性。
经过干扰翻译实验验证得到的多肽分子对胸苷酸合酶mRNA翻译干扰作用。从而得到胸苷酸合酶mRNA干扰肽。
胸苷酸合酶mRNA干扰肽作为肿瘤治疗剂的应用。利用获得的干扰肽，抑制肿瘤胸苷酸合酶基因的表达，达到治疗肿瘤的效果。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权力要求书所界定的本发明发明范围。
图1.体外合成编码多肽库的DNA库。
图2.体外转录图3. mRNA-蛋白质融合体的RT-PCR结果图4 TS RNA亲和肽的cDNA的PCR分析图5 蓝白斑筛选结果图6. 12轮循环选择肽与TS mRNA体外结合图7 干扰肽的翻译抑制效果具体实施方式
I亲和融合肽的筛选1.体外合成编码多肽库的DNA库。DNA序列为TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAGGG ACA ATTACT ATT TAC AAT TAC A ATG GAC TAC AAA GAC GAC GAC GAT AAG AAG ACT YAC TGZ(XYZ)18YAC TGG TCA GCG AGC TGC CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAC CGG CTA T2.DNA库PCR扩增，扩增产物琼脂糖电泳纯化和回收。
3.以上述DNA库为模板，采用T7 RNA聚合酶进行体外转录，获得RNA库。RNA产物运用变性琼脂糖凝胶电泳检测，变性丙烯酰胺胶纯化回收。
4.RNA与嘌呤霉素修饰的DNA接头在紫外条件下进行光交联反应。
5.将上述连接产物加入兔网织红细胞体外翻译体系进行体外翻译实验，运用S35标记的蛋氨酸进行蛋白质产物的放射性标记。翻译产物通过变性丙烯酰胺胶检测。运用Oligo-(dT)纤维素对翻译产物进行纯化。
6.将上述得到的融合肽在反转录酶作用下进行反转录反应，得到cDNA/RNA-linker-peptide的融合肽。
7.通过以下两种方法进行融合肽的筛选。①生物素标记的TS30 RNA固定于Streptavidin琼脂糖凝胶载体进行亲和肽的筛选。得到的亲和肽经过释放得到第一循环的DNA库。②将亲和肽与TS mRNA进行体外结合，凝胶迁移电泳，获得的融合多肽。得到的融合多肽分子进行PCR扩增，进入下一循环。
II对随机库进行了12轮循环的选择及扩增，并对第8个和第12个循环PCR产物的克隆和测序。
利用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物中的约200bp片段，克隆到pMD 18-T载体上，转化E.coli XL Blue，进行蓝白斑筛选，以菌落PCR或提质粒酶切方法检测阳性结果，随机挑取阳性转化子由上海博亚生物技术有限公司进行序列测定1.PCR产物连接入T载体。
2.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化3.阳性克隆的筛选。酶切方法筛选细菌菌落4.测序。
III RNA-蛋白结合试验经过8个循环，将获得的融合多肽以RNA酶消化，降解融合肽上的RNA，胶迁移分析发现，最初的多肽与TS RNA的结合非常微弱以至检测不出。8个循环之后获得的多肽分子，与TS mRNA形成明显的多肽-RNA复合物。而第12轮循环获得的多肽分子对TS RNA的亲和力比8个循环的选择肽更强，说明以mRNA体外展示技术获得的多肽分子，可以与TS RNA结合，而且其与TS RNA的亲和力随着筛选的进行而大大提高。
IV选择肽的翻译抑制效果为明确选择肽的功能，进行了体外翻译试验。以RNA酶消化mRNA-蛋白质融合体，获得的多肽加入全长TS mRNA翻译体系中。如图15所示，加入0.1μg第12轮循环的选择肽后，人TSmRNA的翻译受到抑制，而相同剂量的BSA对TS RNA无翻译抑制效果。这一结果表明以mRNA体外展示获得的多肽可以与TS RNA结合并能抑制其翻译。对随机库进行了12轮循环的选择及扩增，分析了亲和肽的序列及结构特点，阐述了选择肽与TS RNA之间的作用特征。体外翻译试验证实，选择循环之后的多肽能够与TS RNA高度亲和并能抑制TS RNA的翻译，说明mRNA体外展示方法得到的亲和肽具有我们预期的功能。
权利要求
1.一种胸苷酸合酶mRNA干扰肽，它由mRNA体外展示方法获得，与胸苷酸合酶mRNA具有高度亲和性，抑制胸苷酸合酶mRNA的翻译，具有抗肿瘤的效果活性。
2.一种获得权利要求1所述的胸苷酸合酶mRNA干扰肽的方法，它包括以下步骤[1]体外合成编码多肽库的DNA库，经过体外转录、翻译合成蛋白质库。[2]蛋白质库与固定在载体的胸苷酸合酶mRNA进行筛选反应。得到具有胸苷酸合酶mRNA亲和性的多肽分子。[3]通过凝胶阻滞实验证明多肽分子与胸苷酸合酶mRNA的体外亲和性。[4]经过干扰翻译实验验证得到的多肽分子对胸苷酸合酶mRNA翻译干扰作用。从而得到胸苷酸合酶mRNA干扰肽。[5]胸苷酸合酶mRNA干扰肽作为肿瘤治疗剂的应用。利用获得的干扰肽，抑制肿瘤胸苷酸合酶基因的表达，达到治疗肿瘤的效果。
全文摘要
本发明公布了以mRNA体外展示技术进行了由大容量多肽库中(＞10
文档编号C07K1/14GK101058599SQ20071001399
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月7日 优先权日2007年4月7日
发明者林秀坤, 王征, 阎松, 牛荣丽 申请人:中国科学院海洋研究所