专利名称：Crm197突变体的纯化方法
技术领域：
本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及大肠杆菌表达的CRM197突 变体的纯化方法，属于医药技术领域。
技术背景CRM197 (cross—reacting forms of toxin 197)是白喉毒素丧失了毒性的一种突变 体，它是由野生型白喉毒素的碱基序列中由一个碱基G突变为A，从而导致了第52位氨基酸 GLY突变为GLU。从结构上看，CRM197具有完整的白喉毒素功能结构，但实验表明，NAD结 合位点的变化影响了白喉毒素的酶活性及毒性。后来研究证明52位的GLY在白喉毒素NAD 结合位点起着重要作用，这就导致白喉毒素酶活性位点一一同NAD:EF2 ADP核糖转移酶结 合区发生改变，导致CRM197片断A不能与EF2结合，不能对细胞起到毒性作用。CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有白喉毒素的免疫原性，因此CRM197也常被用 作一种免疫蛋白载体交联其它半抗原一起作为疫苗。早在1985年美国科学家就利用CRM197 的免疫原性，将嗜血流感菌表面的多糖交联到白喉类毒素及CRM197的蛋白载体上制作疫苗 防治呼吸道感染，从防治效果上看，两种交联疫苗在效果上没有显著差异，但都能使小孩 产生较强的免疫记忆。美国科学家针对小儿在2岁前对于肺炎球菌疫苗(球菌表面多糖， PnPs)不能产生免疫记忆，因此将球菌表面七价多糖交联于多种蛋白载体以便在小儿2岁 前能对肺炎球菌产生抗体，经过多种蛋白载体交联后的动物及临床效果比较，发现PnPs 一CRM197能产生较好的免疫效果，而且安全无毒副作用。目前该产品也已通过美国TOA批 准上市，商品名为Prevnar。意大利科学家Francesco针对流行性脑膜炎也采用了利用其病 菌表面多糖交联CRM197制作疫苗，他们从CRM197的结构上分析了交联的可行性，其中 CRM197带有39个Lysin氨基酸残基和16个Arg残基，能提供较多的交联用的游离氨基。从实 验结果来看，虽然化学交联率较高，但都没有达到理论交联率。美国专利US6， 962， 803描述了白喉毒素CRM107采用棒状杆菌表达分泌到培养液中，得 到的CRM107毒素收率虽然比较高，可高达培养基总蛋白的70%以上，但是由于培养基中的 成分比较复杂，且盐离子强度较高，导致后续的纯化过程比较困难，工艺复杂，成本偏高， 目的产物收率低等。针对现有CRM197的不足，海南天源康泽医药科技有限公司对原有C賜197的基因序列 进行了改进，构建了表达CRM197的重组表达质粒并转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形 式表达。参见中国专利CN200610042194. 7。发明内容对于采用大肠杆菌以包涵体形式表达重组CRM197突变体，本发明提供一种适宜于规 模扩大化生产的快速、简便、高效的CRM197突变体的纯化方法，具有工艺简单、成本低， 目的产物收率高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。本发明CRM197突变体的纯化方法，包括如下步骤 (1)采用大肠杆菌以包涵体形式表达重组CRM197突变体，包涵体经过变、复性后得 到含有目的蛋白组分的复性液；(2) 复性液通过超滤进行分离和浓縮，并用Tris-HCl缓冲液进行换液，将复性液浓 縮5-25倍，得超滤浓縮液；(3) 上述超滤浓縮液通过阴离子交换层析进行纯化层析，截留核酸和大部分杂蛋白 质，得到含有目的蛋白CRM197突变体的分级组分；(4) 用平衡缓冲液对阴离子交换层析系统进行平衡，使目的蛋白吸附到阴离子层析 柱上，大部分杂质穿出阴离子层析柱；(5) 用添加了NaCl的平衡缓冲溶液对上述步骤(4)处理后的阴离子交换层析柱进行 洗脱，使目的蛋白穿出阴离子交换层析柱，收集洗脱蛋白液，即得目的蛋白液。经过上述步骤的处理，得到的目标蛋白CRM197突变体的纯度高， 一次处理量大，且收 率大大提高，为大规模生产提供了技术基础。上述步骤(1)中的变、复性方法可采用蛋白变、复性通用的方法。上述步骤(2)中所述的复性液通过超滤进行分离和浓縮，可一次性进行超滤浓縮， 也可先超滤去除大分子蛋白或杂质，再进行超滤浓縮。在层析前加上超滤浓縮步骤，除去复性液中的大、小分子蛋白、多肽或其它杂质，以 利于后续步骤的操作。上述步骤(3)中所述的阴离子交换层析，所使用的阴离子交换层析柱的层析介质选 自琼脂糖凝胶(S印harose)类或聚苯乙烯(SOURCE)类，配基选自季铵基(Q)或二乙基 氨乙基(DEAE)。所使用的阴离子交换层析介质具体选自下列之一DEAE-S印harose FF， Q-S印harose FF， S0URCE30-Q或Q-Big-Beds，最优选DEAE-S印harose FF层析介质。上述步骤(4)和(5)中的平衡缓冲液选用Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液 的浓度为10腿ol/L-lmol/L;缓冲液的pH值为6. 0-11. 0。上述步骤(5)中所述的添加了NaCl的平衡缓冲液，其中NaCl浓度为10mmol/L—lmol/L。上述步骤(5)中的洗脱方式可以采用非梯度洗脱或连续梯度洗脱。本发明采用大肠杆菌以包涵体形式表达重组CRM197突变体，如CN200610042194. 7"白 喉毒素突变体CRM197及其制备方法"中提供的包涵体，进行进一步纯化。本发明的CRM197突变体的纯化方法的技术关键点在于在对复性液进行离子交换层析前，先用超滤进行了分离和浓縮，使目的蛋白的含量提 高，使后面的纯化过程更简单，节约了成本，提高了收率。通过本发明的方法制备的CRM197突变体收率高、纯度好，可用于疫苗方面的交联使用； 同时采用本发明的方法纯化CRM197突变体，工艺简便、快速，设备投资小，规模放大容易， 适合大规模生产。
图1是利用SDS-PAGE电泳分析本发明方法纯化后的CRM197突变体纯度图谱。图中的l、 2、 3分别对应为三次实验的阴离子DEAE层析收集液的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。
具体实施方式
以下通过实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应作为本发明的限制。 本发明的方法包括顺序使用包涵体的变、复性，复性液的超滤分离，阴离子交换层析 来纯化CRM197突变体。CRM197突变体包涵体的制备参见CN200610042194. 7"白喉毒素突变 体CRM197及其制备方法"实施例1中2. 4"采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白，经诱导表达 后的菌液以5000Xg离心10min，然后用缓冲液(50誦ol/LTris-HC1、 5mmol/LEDTA)重悬，用超声破碎仪按1.25A脉冲破碎10min，然后离心收集沉淀，用缓冲液(50mmol/L Tris — HC1、 5mmol/L EDTA)洗包涵体洗8遍，离心收集沉淀得到包涵体。"以下实施例中使用的超滤器是Millipore公司的Pellicon-2，超滤膜采用盒式膜堆。 实施例l1、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性10g CRM197突变体包涵体加入1000ml变性液中，所用变性液含8mol/L尿素，lml(3-巯 基乙醇，Tris-HC1 50隱ol/L， pH8,0，搅拌溶解30min，离心力为15000Xg—29000Xg离 心10min，收集上清，倒入10L Tris-HCl缓冲液中，搅拌混匀后于4-10。C复性24-72小时。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为7.0，浓度为10mmol/L的Tris-HC1缓冲溶液对超滤器和大孔径(300KD)超滤 膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留 浓縮。当复性液浓縮至1L左右时；用1 —3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同 的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(300kd)超滤膜堆换为小孔径(10kd) 超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓縮，浓縮至1L左右时，用2倍体积的上 述Tris-HC1缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓縮液。通过超滤浓 縮收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到85%以上。3、 阴离子交换层析用300ml浓度为10mmol/L， pH为7. 0的Tris-HC1平衡缓冲液平衡DEAE-S印harose FF (L6X15cm)层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、、过滤用浓度为10mmol/L， pH为7.0的Tris-HC1平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有 0.5mol/LNaCl的pH为7. 0、浓度为10mmol/L Tris-HCl缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集 洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达到 98%以上。 实施例21、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例l。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为8.0，浓度为30腿ol/L的Tris-HCl缓冲溶液对超滤器和大孔径(300KD)超滤 膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留 浓縮。当复性缓冲液浓縮至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到 相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(300kd)超滤膜堆换作小孔径(10kd) 超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓缩，浓縮至1L左右时，用2倍体积的上 述Tris-HCl缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓縮液。通过超滤浓 縮收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80%以上。3、 阴离子交换层析用300ml浓度为100mmol/L， pH为8. 0的Tris-HC1平衡缓冲液平衡Q-S印harose FF (1. 6 X15cm)层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、过滤用浓度为100ram l/L， pH为8.0的Tris-HCl平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有 0.2mol/L NaCl的pH'为8.0、浓度为100mmol/L Tris-HCl缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达 至1」98%以上。 实施例31、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例l。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为9.0，浓度为50腿ol/L的Tris-HC1缓冲溶液对超滤器和和大孔径(500KD)超 滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截 留浓縮。当复性缓冲液浓縮至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤 到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(500kd)超滤膜堆换作小孔径 (5kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓縮，浓縮至1L左右时，用2倍体 积的上述Tris-HCl缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓縮液。通过 超滤浓縮收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80%以上。3、 阴离子交换层析用300ml pH为9.0，浓度为50腿o1/ L的Tris-HC1平衡缓冲液平衡S0URCE30-Q (1.6 X15cm)层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、过滤用浓度为50mrao1/ L， pH为9. 0的Tris-HC1平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后将NaCl 的浓度在20min内从0腿ol/L升到100隱ol/L，继续在100min内将NaCl浓度从100mmol/L升 高到lmol/L进行梯度洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白中CRM197突变体的纯度大于 98%，浓度达到10mg/ml以上。 实施例41、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例l。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为6.0，浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液对超滤器和小孔径(10kd)超滤膜 进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，进行复性液的浓縮。当复性液浓縮至 1L左右时；用1一3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释2次， 收集超滤透过液。通过超滤浓縮收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到 80%以上。3、 阴离子交换层析 ， 用300ml浓度为10mmol/L， p服.0的磷酸盐平衡缓冲液平衡DEAE-S印harose FF (1.6X15cm)层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、过滤用浓度为10mraol/L， pH6. 0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后将NaCl的浓度在 20min内从0 mmol/L升到10Ommol/L，继续在100min内将NaCl浓度从100mmol/L升高到 lmol/L进行连续梯度洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白中CRM197突变体的纯度大于 98%，浓度达到10mg/ml以上。 实施例51、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例l。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为7.0，浓度为50mmol/L磷酸盐缓冲溶液对超滤器和大孔径(500kd)超滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为l. 3bar和0. 3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留浓縮。 当复性缓冲液浓縮至1L左右时；用1一3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的 体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(500kd)超滤膜堆换作小孔径(10kd) 超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓縮，浓縮至1L左右时，用2倍体积的上 述磷酸盐缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓縮液。通过超滤浓縮 收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到85%以上。3、 阴离子交换层析用300ml浓度为50mraol/L， pH为7. 0的磷酸盐平衡缓冲液平衡Q-Big-Beds(l. 6X 15cm) 层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、过滤用浓度为50咖ol/L， pH为7.0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有20mmol/L NaCl的pH为7.0、浓度为50mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。 所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达到98%以上。 实施例61、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例l。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为8.0，浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液对超滤器和和大孔径(500KD)超 滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截 留浓縮。当复性缓冲液浓縮至1L左右时；用1一3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤 到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(500kd)超滤膜堆换作小孔径 (5kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓縮，浓縮至1L左右时，用2倍体 积的上述磷酸盐缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓縮液。通过超 滤浓縮收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80%以上。3、 阴离子交换层析用300ml浓度为100誦ol/L， pH为8. 0的磷酸盐平衡缓冲液平衡Q-S印harose FF (1.6 X15cm)层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、过滤用浓度为100mmol/L， pH为8. 0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有O. 3mol/L NaCl的pH为8.0、浓度为100mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。 所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达到98%以上。 实施例71、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例l。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为10.0，浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液对超滤器和大孔径(300kd)超滤 膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留 浓縮。当复性缓冲液浓縮至1L左右时；用1一3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到 相同的体积如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(300kd)超滤膜堆换作小孔径(10kd) 超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓縮，浓縮至1L左右时，用2倍体积的上 述磷酸盐缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓縮液。通过超滤浓縮 收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80%以上。3、 阴离子交换层析用300ml浓度为100mmol/L， pH为10. 0的磷酸盐平衡缓冲液平衡DEAE-S印harose FF (1.6X15cm)层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、过滤用浓度为100mmol/L， pH为10. 0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后将NaCl的浓 度在20min内从0誦ol/L升至ljlOOmmol/L，继续在100min内将NaCl浓度从100誦ol/L升高到 lmol/L进行梯度洗脱，收集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可 达到9mg/ml以上，纯度达到98%以上。 实施例81、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例l。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为ll.O，浓度为200咖ol/L的Tris-HCl缓冲溶液对超滤器和大孔径(500kd)超 滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截 留浓縮。当复性缓冲液浓縮至1L左右时；用1一3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤 到相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(500kd)超滤膜堆换作小孔径 (10kd)超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓縮，浓縮至1L左右时，用2倍 体积的上述Tris-HCL缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓縮液。通 过超滤浓縮收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80%以上。3、 阴离子交换层析用300ml浓度为200mmol/L， pH为ll. O的Tris-HCL平衡缓冲液平衡Q-S印harose FF (1. 6 X15cm)层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、过滤用浓度为200mmol/L， pH为11. 0的Tris-HCL平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有 10mmol/L NaCl的pH为ll.O、浓度为200mmol/L Tris-HCL缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收 集洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到10mg/ml以上，纯度 达到98%以上。 实施例91、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例l。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为8.0，浓度为500國ol/L的磷酸盐缓冲溶液对超滤器和大孔径(300kd)超滤 膜进行平衡，保持进出口压力分别为1.3bar和0.3bar，开始进行大分子蛋白或杂质的截留 浓縮。当复性缓冲液浓縮至1L左右时；用1一3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到 相同的体积；如此稀释2次，收集超滤透过液。将大孔径(300kd)超滤膜堆换作小孔径(10kd) 超滤膜堆，按照上述方法将上述超滤透过液进行浓縮，浓縮至1L左右时，用2倍体积的上 述磷酸盐缓冲液稀释后继续超滤至相同的体积，共稀释3次，收集浓縮液。通过超滤浓縮 收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/ml，纯度达到80%以上。3、 阴离子交换层析用300ml浓度为500mmol/L， pH为8. 0的磷酸盐平衡缓冲液平衡S0URCE30-Q( 1. 6X15cm) 层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、过滤用浓度为500mmol/L， pH为8. 0的磷酸盐平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有O. 8mol/L NaCl的pH为8.0、浓度为500mmol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱蛋白液。 所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到8mg/ml以上，纯度达到98%以上。 实施例IO1、 CRM197突变体包涵体的溶解和变、复性，同实施例l。2、 复性液的超滤分离和浓縮先用pH为8.0，浓度为1000mmol/L的Tris-HCL缓冲溶液对超滤器和小孔径(10kd)超 滤膜进行平衡，保持进出口压力分别为L3bar和0.3bar,进行复性液的浓縮。当复性液浓 縮至1L左右时；用1—3倍体积的上述缓冲液稀释复性液，再超滤到相同的体积；如此稀释 2次，收集浓縮液。通过超滤浓縮收集的CRM197突变体的级分浓度可达到3mg/m1,纯度达 到80%以上。3、 阴离子交换层析用300ml浓度为1000mmol/L， pH为8. 0的Tris-HCL平衡缓冲液平衡DEAE-S印harose FF (1.6X15cm)层析柱，将超滤后的浓縮液上柱。4、 平衡、洗脱、过滤用浓度为1000mmol/L， pH为8. 0的Tris-HCL平衡缓冲液冲洗3个柱体积，换用含有 lmol/LNaCl的pH为8. 0、浓度为1000mmol/L Tris-HCL缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集 洗脱蛋白液。所得的目的蛋白液中CRM197突变体的级分浓度可达到10mg/ml以上，纯度达 到98%以上。
权利要求
1. 一种CRM197突变体的纯化方法，包括如下步骤(1)采用大肠杆菌以包涵体形式表达重组CRM197突变体，包涵体经过变、复性后得到含有目的蛋白组分的复性液；(2)复性液通过超滤进行分离和浓缩，并用Tris-HCl缓冲液进行换液，将复性液浓缩5-25倍，得超滤浓缩液；(3)上述超滤浓缩液通过阴离子交换层析进行纯化层析，截留核酸和大部分杂蛋白质，得到含有目的蛋白CRM197突变体的分级组分；(4)用平衡缓冲液对阴离子交换层析系统进行平衡，使目的蛋白吸附到阴离子层析柱上，大部分杂质穿出阴离子层析柱；(5)用添加了NaCl的平衡缓冲溶液对上述步骤(4)处理后的阴离子交换层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出阴离子交换层析柱，收集洗脱蛋白液，即得目的蛋白液。
2、 如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于步骤(2)中所述的复性液通过超滤进行分离和浓縮，是一次性进行超滤浓縮。
3、 如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于步骤(2)中所述的复 性液通过超滤进行分离和浓縮，是先超滤去除大分子蛋白或杂质，再进行超滤浓縮。
4、 如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中所述的阴离子交换层析，所使用的阴离子交换层析柱的层析介质选自琼脂糖凝胶类或聚苯乙烯 类，配基选自季铵基或二乙基氨乙基。
5、 如权利要求1或4所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中所 述的阴离子交换层析，所使用的阴离子交换层析介质选自下列之一DEAE-S印harose FF， Q-S印harose FF， S0URCE30-Q或Q-Big-Beds。
6、 如权利要求1或4所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中所 述的阴离子交换层析，所使用的阴离子交换层析介质DEAE-S印harose FF层析介质。
7、 如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于所述步骤(4)和(5) 中的平衡缓冲液选用Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度为10國ol/L-lmol/L; 缓冲液的pH值为6. 0-11.0。
8、 如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于所述步骤(5)中所述 的添加了NaCl的平衡缓冲液，其中NaCl浓度为10mmol/L—lmol/L。
9、 如权利要求1所述的CRM197突变体的纯化方法，其特征在于所述步骤(5)中的洗 脱方式采用非梯度洗脱或连续梯度洗脱。
全文摘要
本发明涉及一种大肠杆菌表达的CRM197突变体的纯化方法，属于医药技术领域。纯化方法步骤包括如下将包涵体变性、复性后，先利用超滤方法进行浓缩后，在利用阴离子交换层析进行纯化，收集蛋白峰，即可得到高纯度的蛋白样品。本方法具有适合规模化生产、操作简便、生产周期短、产品纯度高、工艺稳定性强等特点。
文档编号C07K1/00GK101265288SQ200710013378
公开日2008年9月17日 申请日期2007年3月13日 优先权日2007年3月13日
发明者孙丽霞, 薛 张, 徐同文, 王克波, 王晶翼, 婷 董 申请人:齐鲁制药有限公司