用于纯化cys连接的抗体-药物缀合物的方法
【专利摘要】本发明涉及使用疏水作用色谱法(HIC)纯化半胱氨酸连接的抗体?药物缀合物之混合物的方法，其中非缀合抗体的量在按重量计0％至40％的范围内。使用0.2M至1.5M盐水溶液将所述混合物加载到制备型HIC柱上，其中在流过级分中收集非缀合抗体，随后使用0mM至100mM盐水溶液洗脱经纯化的半胱氨酸连接的抗体?药物缀合物的混合物。
【专利说明】
用于纯化CYS连接的抗体-药物缀合物的方法
技术领域
[0001 ]本发明设及用于纯化半脫氨酸（Cys)连接的抗体-药物缀合物（antibody-drug con jugate，ADC)的混合物，特别是其中非缀合抗体的量在按重量计10 %至40 %范围内的混 合物的方法。
[0002] 运样的切S连接的ADC可能在新的祀向癌症治疗中具有重要作用。因此，具有用于 纯化切S连接的ADC之混合物的工业（制备）规模方法是运样的ADC未来商业成功的关键要 求。
[0003] 发明背景
[0004] 近年来，许多ADC已经投入临床前和临床开发中并且在过去几年中两种ADC已经批 准上市。除了将接头-药物与（单克隆)抗体(mAb)缀合的最近发展之外，在（临床前）临床开 发的大多数ADC中和目前市售的两种ADC中的药物可W通过赖氨酸残基的N原子或者通过半 脫氨残基的S-原子与抗体连接。市售产品长3(1€'5/1&@或曰(1〇-曲妥珠单抗emtansine (Roche/Genentech ImmunoGen)是赖氨酸连接的ADC的实例，Adcetris瑕或brentuximab vedotin(Seattle Genetics/Takeda Millennium)是半脫氨酸连接的ADC的实例。目前在 (临床前）临床开发中的一种ADC是下文所示式（II)的半脫氨酸连接的ADC，其中倍癌霉素 (duocarmycin)药物通过半脫氨酸残基与曲妥珠单抗(trastuzumab)缀合。
[0005] 首先从链霉菌（S化eptomyces)物种培养液中分离的倍癌霉素是抗肿瘤抗生素家 族的成员，其包括倍癌霉素 A、倍癌霉素 SA和CC-1065。运些极其强效的药剂据称是从小沟中 腺嚷岭的N3位置序列选择性烷基化DNA的能力中得到其生物学活性，运启动终止于调亡细 胞死亡机制的级联事件。
[0006] 为了制备切S连接的ADC，通常部分还原抗体W将一个或更多个链间二硫键转换为 两个或更多个游离的半脫氨酸残基。然后游离的半脫氨酸残基的琉基或氨硫基(SH)基团随 后与接头-药物分子缀合W形成切S连接的ADC。通常，该缀合过程产生加载有0、2、4、6和8个 接头-药物之抗体的随机不均匀混合物。平均药物-抗体比（化ug-to-ant化ody ratio，DAR) 越低，则反应混合物中非缀合抗体(DARO)的量越高。
[0007] 已知药物负荷（drug loading)对ADC的抗肿瘤活性具有作用，例如由 K.J.Hamblett等在Clinical &ncer Research 10(2004)7063-7070中所描述的。药物负荷 还会影响CMC(化学、制造和控制)性质，如聚集。
[000引
【申请人】的W02011/133039公开了 DNA烷基化剂CC-1065的一系列新类似物及其抗 体-药物缀合物(ADC)。在实施例15中，已经描述了使用1.1摩尔当量的还原剂W使每个mAb 产生2个游离琉基来制备许多曲妥珠单抗-倍癌霉素缀合物。泽灭后，使用r-蛋白A柱纯化 ADCW得到平均DAR为约2的接头-药物缀合物。
[0009] 现有技术公开了疏水作用色谱法化7化〇地obic interaction chromatogra地y， HIC)作为许多单克隆抗体(mAb)纯化过程中精制(polishing)步骤的用途。提到色谱法的运 个模式特别适用于去除聚集体，并且其为其他生产相关的杂质(例如宿主细胞蛋白、DNA、内 毒素、浸出的蛋白A和内源病毒)提供了良好的清除。
[0010] HIC也是用于(分析)测定半脫氨酸连接的ADC之DAR和药物负荷分布的行之有效的 方'法（Laurent Ducry(编车茸），Antibody-Dru邑 Conju邑ates，Methods in Molecular Biology ,1045(2013)275-283)。由化n Ouyang在运本书第17章276页的图2中描绘了切s连 接的ADC(即，MC-VC-PABC-MMAE)的代表性HIC色谱图。提到用降低的盐浓度和提高的有机改 性剂的梯度进行洗脱影响了载药种类的柱保留，首先洗脱最低疏水性、非缀合形式（即，非 缀合抗体，DAR0 )，最后洗脱具有8个接头-药物(DAR8)的最高疏水性抗体。279页表2中的数 据表明，加权平均DAR为3.6的Cys连接的ADC的混合物只含有4.7%的非缀合抗体。
[0011] US4771128描述了使用HIC分离和纯化毒素缀合物，特别是与有毒核糖体-失活蛋 白藍麻毒素 A缀合的免疫球蛋白（抗体）的方法。所述方法包括通过筛分色谱法（sizing chromatography)(即，尺寸排阻色谱法，SEC)首先去除未缀合的藍麻毒素 A和聚集体，随后 通过疏水凝胶色谱法（即，HIC，使用化enyl Sepharose化-4B，体积70ml)，其中通过用离子 强度逐渐降低的盐溶液进行洗脱来分离缀合物混合物。首先洗脱非缀合的免疫球蛋白。在 筛分步骤(sizing step)和随后的色谱分离步骤两者中使用的缓冲液含有氯化钢（1M)，流 速为约20ml/h至40ml/h，参考实施例1。在一个替代实施方案中，提供"高流速(fast flow)" 色谱分离和纯化（即，使用陆日11如5邱4日'〇30化-48，柱直径1畑1，体积3.141111)，其中用第一 柱体积的憐酸盐缓冲液/氯化钢（1.5M)溶液W约0.13mL/h的流速去除未缀合的免疫球蛋 白，参考实施例2，并且用第二柱体积的含有10体积％至60体积％有机溶剂（即，实施例2中 60体积％甘油)的憐酸盐缓冲液去除免疫缀合物。
[0012] 现有技术中公开的方法的主要缺点是使用工业规模生产上既不期望也不可接受 的有机溶剂。
[0013] 就
【申请人】所知，现有技术中尚未解决的一个问题是ADC纯化过程的规模扩大。
[0014] 回顾了现有技术，显然需要用于纯化切S连接的ADC之混合物的新方法。特别是，期 望具有在工业制备规模上用于纯化平均DAR为约2至3的切S连接的ADC的混合物且不是必须 使用多个色谱步骤的方法，所述混合物通常含有相对高量的非缀合抗体，有时多至按重量 计40 %。
【发明内容】
[0015] 本发明设及用于纯化半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的混合物，特别是平均DAR 为约2至3的混合物的新方法，其中非缀合抗体的量在按重量计10%至40%范围内。
[0016] 在第一方面，本发明提供了用于纯化半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物之混合物 的方法，其中非缀合抗体的量在按重量计10%至40%的范围内，所述方法包括：
[0017] a.提供在0.2M至1.5M盐水溶液中的所述混合物；
[0018] b.将所述溶液加载到制备型疏水作用色谱柱上；
[0019] C.收集含有非缀合抗体的流过级分(flow-t虹OU曲fraction);
[0020] d.用0.2M至1.5M盐水溶液洗涂所述柱，同时收集所述流过级分；W及
[0021 ] e.用OmM至lOOmM盐水溶液洗脱所述柱W获得经纯化的半脫氨酸连接的抗体-药物 缀合物的混合物。
[0022]在本发明的一个特别优选的实施方案中，半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的混 合物为式(II)的混合物
[0023]
[0024] 其中，
[00巧]Ab是曲妥珠单抗，并且
[0026] q的范围为0至8。
[0027] 附图简述
[00%]图1示出了还原剂的量对DAR种类(species)的分布的影响的一个实例。当使用1.0 当量的还原剂时，非缀合曲妥珠单抗抗体DAR0的百分比为按重量计约20%。
[0029] 图2描绘了根据实施例3中的纯化，在制备规模上进行HIC纯化之前和之后，根据式 (II)的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物之混合物的分析型HIC色谱图。
[0030] 图3描绘了根据实施例4中的纯化，在制备规模上进行HIC纯化之前和之后，根据式 (II)的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物之混合物的分析型HIC色谱图。
[0031] 发明详述
[0032] 根据本发明，发现其中非缀合抗体的量在按重量计10%至40%范围内的半脫氨酸 连接的抗体-药物缀合物(切S连接的ADC)的混合物可W有利地通过疏水作用色谱法从非缀 合抗体(DAR0)和非缀合接头-药物中纯化出来，运通常在缀合反应完成后被泽灭。根据本发 明的方法包括：
[0033] a.提供在0.2M至1.5M盐水溶液中的混合物；
[0034] b.将所述溶液加载到制备型疏水作用色谱柱上；
[0035] C.收集含有非缀合抗体的流过级分；
[0036] d.用0.2M至1.5M盐水溶液洗涂所述柱，同时收集流过级分；W及
[0037] e.用OmM至lOOmM盐水溶液洗脱所述柱W获得经纯化的半脫氨酸连接的抗体-药物 缀合物的混合物。
[003引在本说明书的上下文中"盐"并不意味着"缓冲液"（盐）。根据本发明的方法待使用 的合适的盐和缓冲液的实例在下文中给出。有利地，在本发明的方法中使用缓冲的盐水溶 液。
[0039] 根据本发明的方法，只使用水性溶液，因此，在任意步骤a、b、d或e中不使用添加的 有机溶剂。需要明确的是，步骤e可在不存在盐的条件下进行。
[0040] 所要求保护的方法包括在允许加载有2至8个接头-药物的抗体、非缀合接头-药物 和杂质(通常是聚集体)的混合物与柱填充材料(column packing material)结合的柱负荷 条件下，使切S连接的ADC的混合物与HIC柱填充材料在盐水溶液中接触，同时在负荷条件下 非缀合抗体不与之结合，并立即被洗掉/流过所述柱。用较低浓度的盐水溶液进行洗脱将与 柱填充材料保持结合/留在柱上的非缀合接头-药物和杂质与Cys连接的ADC分离。
[0041] 用于加载(步骤b)和洗涂（步骤d)的盐水溶液可W相同或不同。有利地，用于加载 (步骤b)和洗涂(步骤d)的盐水溶液是相同的。
[0042] 如本领域技术人员已知的和在US20100069617的[0057]段中所描述的，HIC柱上最 佳的加载/结合和洗脱条件取决于许多因素。因此，不同ADC混合物的单独保留特征的变化， 例如，由于抗体、接头和药物的变化，使得期望根据本发明定制/优化HIC柱的操作条件。运 种优化主要包括例如，通过确定任何具体的ADC之DAR2种类的（相对)疏水性来确定待纯化 的ADC混合物的疏水性，并选择柱填充材料(的疏水性）。它还包括选择/优化加载/结合盐水 浓度、洗脱盐水浓度、任何缓冲盐的浓度、和pH值。
[0043] 根据本发明式(I)和（II)的切S连接的ADC的混合物具有通过半脫氨酸残基的S-原 子与抗体缀合的接头-药物，即，它们是半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物。通常，半脫氨酸 残基是存在于抗体(Ab)的重链和/或轻链中的天然半脫氨酸残基并形成链间二硫键。本发 明特别设及其中接头-药物通过Ab(更特别是mAb)的链间二硫键缀合的ADC化合物的纯化。 例如，IgGl抗体通常具有四个链间二硫键，所有四个均位于抗体的较链区中，在二硫键(部 分)还原之后，接头-药物随机地与游离琉基连接。
[0044] 根据本发明式(I)和（II)的切S连接的ADC化合物的混合物可根据本领域技术人员 公知的方法和过程获得。在所述二硫键被完全或部分还原后，可发生通过链间二硫键的缀 合。用于制备运样化合物的合适的方法可W在
【申请人】W02011/133039的描述和实施例中找 到。特别地，W02011/133039的实施例15描述了部分还原曲妥珠单抗W使每个mAb产生2个游 离琉基W及与许多接头-药物缀合产生平均DAR为约2的ADCdW02005/084390的实施例7和8 描述了用于具有接头-药物vcMMAE之抗体的（部分)负荷的部分还原、部分还原/部分再氧化 W及完全还原策略。
[0045] 根据本发明待纯化的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物(切S连接的ADC)的混合物 含有按重量计10%至40%范围内，更特别地按重量计10%至35%范围内，甚至更特别地按 重量计15%至35%范围内的非缀合抗体的量。本领域公知，缀合后非缀合抗体存在的量随 着平均药物-抗体比(DAR)提高而降低。例如，本发明人已经发现当使用大于1.5当量的还原 剂来还原单克隆抗体曲妥珠单抗的链间二硫键时，在缀合物的混合物中存在按重量计小于 10%的非缀合抗体(DAR0)。当使用1.0当量的还原剂时，在缀合物的混合物中存在按重量计 最大量为约50%的DAR2,并且非缀合的抗体(DAR0)曲妥珠单抗的百分比按重量计为约20% (参见图1)。应注意，根据所使用的反应物和反应条件，DAR种类的分布随着还原剂:mAb比而 变化。
[0046] 当尝试具有约2至3，更特别地2.6至2.9，甚至更特别的2.7至2.9的平均DA則寸，根 据本发明的方法是特别有利的。
[0047] 根据本发明的方法所使用的制备型HIC柱可W是任何市售的制备型柱。运样的柱 和/或合适的柱填充材料的供应商的实例包括Tosoh Bioscience、GE Healthcare、Bi〇-Rad 和Merck Millipore。
[004引所述HIC柱可填充有FYactogel EMD propyl (Merck) Jractrogel EMD phenyl (Merck Mi 11ipore)、Butyl-S sepharose(GE Healthcare)、0ctyl Sepharose(GE Healthcare)、Capto Octyl(GE Healthcare)、Capto Butyl(GE Healthcare)、Capto Phenyl ImpRes(GE Healthcare)、Capto Butyl ImpRes(GE Healthcare)、Toyopearl PPG- 600M(Tosoh Bioscience)、Toyopearl Hexyl-650(Tosoh Bioscience)、Toyopearl Butyl- 650(Tosoh Bioscience)、Toyopearl Phenyl-650(Tosoh Bioscience)、Toyopearl Ether- 650(Tosoh Bioscience)、Macroprep t-Butyl(Bio-Rad)、Macroprep phenyl(Bio-Rad)、 Cellufine ButyKjNC Corporation)、Cellufine Phenyl(JNC Corporation)或Poros HP2 (Applied Biosystems)。
[0049] 有利地，所述HIC柱填充有GE Healthcare的树脂But^-S Se地arose6化St Flow (FF)、Capto Octyl、0ctyl Sepharose 4Fast Flow、Phenyl Sepharose 6Fast Flow、Capto Butyl、Butyl Sepharose4Fast Flow或Capto Butyl ImpRes、或Tosoh Bioscience的树月旨 Toyopearl PPG-600M。多种柱填充材料/树脂的相对疏水性和许多其他特征可从供应商处 获得的所述树脂的信息页得到。优选地，根据本发明的方法，HIC柱填充有Butyl-S Sepharose 6FF、Capto Butyl、Butyl Sepharose 4FF、Capto Butyl ImpRes或Toyopearl PPG-600M，更优选地填充有Butyl Sepharose 4FF、Capto Butyl ImpRes或Toyopearl PPG- 600M，最优选地其填充有Butyl S巧harose 4FF或Toyopearl PPG-600M。
[0050] 通常，根据本发明的方法，柱床高度为约20cm至25cm，有利地为约20cm，并且柱上 的压力保持在低于化ar。
[0051] 柱尺寸由期望或需要加载到HIC柱上的ADC材料的量决定。如本领域技术人员公 知，可加载的ADC材料的量随着柱内部直径和柱长度而增加。
[0052] 根据本发明的方法所使用的制备型HIC柱的直径通常在4.0111111至2,000111111，优选 15mm至2，000mm，更优选80mm至2，000mm，最优选400mm至2，000mm的范围内。柱的直径越大， 则可被加载到柱顶部上的ADC材料越多。有利地，因为如此选择柱负荷和洗涂条件使得非缀 合抗体(DAR0)流过所述柱，所W柱的容量增加。例如，如果在切S连接ADC的混合物中存在的 非缀合抗体的量按重量计为30%，则根据本发明的纯化过程允许所述柱具有约30%更高的 负荷。
[0053] 加载到根据本发明的方法所使用的制备型柱上的ADC材料的量通常在5g/L至50g/ L范围内，优选在5g/L至40g/L，更优选lOg/L至40g/L，甚至更优选30g/L至40g/L的柱填充材 料的范围内。
[0054] 根据本发明的方法，有利地可纯化20g至2,OOOg的批量(batch amount)，使得目前 本发明要求保护的HIC纯化方法适合于工业规模生产GMP(Good Manirfacturing Practice， 药品生产质量管理规范)ADC材料。
[0055] 除了柱直径和长度之外，柱填充材料的平均颗粒大小(dso,倘R，累积体积分布的中 值颗粒大小)也是相关的。
[0056] 根据本发明的方法，所选择的颗粒大小允许W最小的流速进行良好的分离。根据 本发明的方法，柱填充材料的颗粒大小在30WI1至180WI1的范围内。优选地，柱填充材料的颗 粒大小在35μηι至100μηι的范围内；甚至更优选地，柱填充材料的颗粒大小在45μηι至90]im的范 围内。
[0化7] 根据本发明的方法，流速在50cm/h至300cm/h的范围内。优选地，流速在80cm/h至 250cm/h，更优选lOOcm/h至220cm/h，最优选约lOOcm/h至1 lOcm/h的范围内。
[0058] 根据本发明的方法，在步骤e中的洗脱可WW常规模式（即，洗脱过程中的流动与 加载和洗涂过程中的流动方向相同）或W反向模式(reverse mode)(即洗脱过程中的流动 与加载和洗涂过程中的流动方向相反)进行。在应用所要求保护的纯化方法之前，在从非缀 合的接头-药物中纯化ADC的（缀合反应)混合物，例如通过使所述(缀合反应)混合物进行 (例如，活性炭)过滤的情况下，经纯化的切S连接的ADC之混合物的反向模式洗脱是特别有 利的。
[0059] 有利地，盐水溶液的盐选自硫氯酸钟、氯化钢、氯化钟、氯化锭、硫酸钢、硫酸钟和 硫酸锭。优选地，所述盐是氯化钢或硫酸锭。更优选地，所述盐是硫酸锭。
[0060] 根据本发明的方法，用于加载(步骤b)和洗涂(步骤d)的盐水溶液的盐与用于洗脱 (步骤e)的盐水溶液的盐可W相同或不同。有利地，相同的盐用于步骤b、d和e。
[0061] 根据本发明的方法，用于加载(步骤b)和洗涂柱(步骤d)的盐水溶液的浓度为0.2M 至1.5M。优选地，盐水溶液的浓度为0.2M至1.0M，更优选0.45至0.9M，最优选0.55M至0.9M。
[0062] 根据本发明的方法，用于洗脱柱(步骤e)的盐水溶液的浓度为OmM-lOOmM。优选地， 盐水溶液的浓度为OmM至90mM，更优选OmM至80mM，甚至更优选OmM至70mM，最优选OmM至 55mM〇
[0063] 根据本发明的方法，优选地盐水溶液还含有缓冲液。有利地，当盐水溶液的浓度为 OmM(步骤e)时，它包含缓冲液。有利地，缓冲液选自憐酸钢、憐酸钟、憐酸锭、乙酸钢、乙酸 钟、巧樣酸钢、巧樣酸钟、巧樣酸锭、及其混合物。优选地，缓冲液是憐酸盐、乙酸盐或巧樣酸 盐、或其混合物，例如巧樣酸盐-憐酸盐缓冲液。更优选地，缓冲液是憐酸钢或乙酸钢。
[0064] 根据本发明的方法，用于加载(步骤b)、洗涂(步骤d)和洗脱柱(步骤e)的缓冲液的 浓度为OmM至1 OOmM，优选OmM至50mM，更优选20mM至30mM。有利地，缓冲盐水溶液用于本发明 方法的所有步骤(步骤a至e)。
[0065] 根据本发明的方法有利地使用的缓冲盐水溶液优选缓冲至约4至约8,更优选约5 至约7，最优选约5.0至约5.5的抑。
[0066] 根据本发明方法之ADC的疏水作用色谱法利用了非缀合抗体、加载有多至8个接 头-药物的抗体、非缀合接头-药物和杂质（即，聚集体）的疏水性质的差异W实现经纯化的 切S连接的ADC之混合物的分离和隔离。抗体、ADC、接头-药物或杂质的疏水性越大，它与柱 填充材料的相互作用将越强。
[0067] 根据本发明的方法，包括在半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物之混合物中所期望 的ADC的疏水性通过确定相对于参照（即市售的mAb曲妥珠单抗（Herceptitt獲,Roche/ Genentech)的保留时间），在分析型HIC柱上的保留时间来测量。为了测量疏水性，制备具有 在0.8M硫酸锭中终浓度为Img/mL的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的ADC样品，使用的分 析型HIC柱是TSKgel Butyl-NPR柱（Tosoh Bioscience)。使用线性梯度从100%缓冲液C (25mM憐酸钢，1.5M硫酸锭，pH 6.95)至100 %缓冲液D(25mM憐酸钢，pH 6.95，20 %异丙醇） 在20分钟内W0.4ml/分钟洗脱ADC样品，并且在214nm处测量吸光度W及ADC样品中DAR2种 类相对于曲妥珠单抗（Herceptin? )的保留时间。
[0068] 根据本发明的方法，使用分析型HIC柱和前面段落中描述的方法，DAR2切S-连接的 ADC种类的相对疏水性在0.1至0.6，特别是0.2至0.5，更特别地0.2至0.45的范围内，曲妥珠 单抗（Hereeptin敏)術保留时间做)为6.7分钟。
[0069] 根据本发明的方法特别适用于纯化式（I)的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的 混合物
[0070]
[0071] 其中，
[0072] Ab是抗体，
[0073] L是选自W下的连接基团：
[0074]
[0075] yi是天然和/或非天然氨基酸的条件性可切割二肤，
[0076] 化是选自W下的环化接头：
[0077]
[007引其中η是1至16的整数，
[00巧]R选自Η、C出、邸2邸3、0邸3、0CH2C出、CF3、0CF3、Cl、F，q的范围为0至8,并且 [0080] DB是选自W下的DNA结合部分：
[0081]
[0082] 运样的切s连接的ADC混合物已经在
【申请人】的W02010/062171和W02011/133039中 进行了详细地描述。
[0083] 根据本发明的方法，天然和/或非天然氨基酸的条件性可切割二肤有利地选自：苯 丙氨酷赖氨酸、鄉氨酷赖氨酸、鄉氨酷丙氨酸、丙氨酷赖氨酸、鄉氨酷瓜氨酸、N-甲基鄉氨酷 瓜氨酸、苯丙氨酷瓜氨酸、异亮氨酷瓜氨酸、色氨酷赖氨酸、色氨酷瓜氨酸、苯丙氨酷精氨 酸、苯丙氨酷丙氨酸、苯丙氨酷-N9-甲苯横酷基精氨酸、苯丙氨酷-N9-硝基精氨酸、亮氨酷赖 氨酸、亮氨酷瓜氨酸和苯丙氨酷-0-苯甲酯-苏氨酸。优选地，所述二肤是苯丙氨酷赖氨酸、 鄉氨酷赖氨酸或鄉氨酷瓜氨酸。
[0084] 根据本发明的方法，所述Ab选自：抗CD 19抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33 抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD74抗体、抗CD 138抗体、抗化レl抗体、抗5T4抗体、抗 CD303抗体、抗标签72抗体(anti-Tag 72antibody)、抗Lewis A样碳水化合物抗体(anti- Lewis A like carbohy化ate antibody)、抗E；phB3抗体、抗HMW-MAA抗体、抗CD38抗体、抗 Cripto抗体、抗E；phA2抗体、抗GPNMB抗体、抗整联蛋白抗体(anti-integrin antibody)、抗 丽抗体、抗皿R2抗体、抗PSMA抗体、抗EGFR抗体、抗CD203C抗体、抗化C44A4抗体、抗连接蛋 白-4抗体(曰111:;[-化。1:;[]1-4曰]11:化〇(15〇、抗间皮素抗体(曰]11:;[-1116301:1161;[]1曰]11:化〇(15〇、抗〔044 抗体、抗CD79抗体、抗化化5抗体、抗MUCl 6抗体、抗化Pi 2b抗体、抗STEAP-1抗体、抗ETBR抗 体、抗TF抗体、抗MUC1抗体、抗HGFR抗体、抗CD37抗体、抗F0LR1抗体、抗CEACAM抗体、抗TR0P2 抗体、抗GCC抗体、抗LewiS Y抗体、抗LIV1抗体、抗化L3抗体和抗EPCAM抗体。所述抗体优选 为单克隆抗体(mAb)。
[0085] 根据本发明的方法，所述Ab或优选mAb是抗肥R2抗体。更优选地，所述抗体是抗 肥R2单克隆抗体，特别是曲妥珠单抗或其生物仿制药(biosimilar)。
[0086] 在本发明方法的一个具体实施方案中，通过使用抗体曲妥珠单抗或其生物仿制药 制备根据式（II)的切S连接的ADC的混合物，该抗体被Ξ(2-簇乙基)麟(TCEP，每摩尔抗体 1.1摩尔当量化原，并与式(III)的接头-药物(每个游离琉基1.3摩尔当量)反应。缀合通常 在Ν，Ν-二甲基乙酷胺(DMAc)或二甲基亚讽(DMS0)，优选在DMAc中进行。
[0087]
[0088] 在本发明方法的某些实施方案中，用N-乙酷半脫氨酸储液(每个接头-药物缀合物 1摩尔当量)处理缀合反应混合物W封闭式(III)非缀合接头-药物的反应性基团。
[0089] 在本发明方法的某些实施方案中，使缀合反应混合物进行过滤步骤W去除不溶的 过量式（III)的接头-药物。将反应混合物加载到柱上之前去除过量的接头-药物增加了柱 的容量。可使用本领域技术人员公知的过滤器。通常，过滤步骤包括使用预过滤器，随后使 用具有绝对孔径等级(rating)的过滤器。合适的预过滤器是含有活性炭的深层过滤器。优 选例如Ze1:a(^i;rbon SLP(3M)的过滤器。
[0090] 合适的绝对孔径过滤器是由聚酸讽（PES)、乙酸纤维素（CA)或聚偏二氣乙締 (PVD巧制成。优选的过滤器是PVDF或PES过滤器，通常具有0.2皿的绝对孔径。
[0091] 在本发明方法的某些实施方案中，通过使用憐酸钢和硫酸锭(在P册.0-6.5下调节 至终浓度20-30mM的憐酸钢和0.55-0.65M的硫酸锭(缓冲液A))制备缀合反应混合物W用于 HIC柱纯化。
[0092] 在本发明方法的一些替代实施方案中，通过使用乙酸钢和硫酸锭(在pH 5.0-5.5 下调节至终浓度20-30mM的乙酸钢和0.55-0.9M的硫酸锭(缓冲液A))制备缀合反应混合物 W用于HIC柱纯化。
[0093] 在本发明方法的一个具体实施方案中，所述方法包括使用首先用Ξ个柱体积的缓 冲液A(20-30mM憐酸钢、0.55-0.65Μ硫酸锭，pH 6.0-6.5) W lOOcm/h的流速平衡的HIC柱 (8cmX20cm，Butyl Sepharose 4Fast Flow),随后加载到在缓冲液A中的缀合反应混合物 的柱上(步骤b)，并收集含有非缀合抗体的流过级分(步骤C)。
[0094] 步骤d包括用Ξ个柱体积的相同缓冲液A(20-30mM憐酸钢、0.55-0.65M硫酸锭，pH 6.0- 6.5) W lOOcm/h的流速洗涂HIC柱，同时收集流过级分，从而去除残留量的非缀合抗体。 [00巧]步骤e包括用Ξ个柱体积的缓冲液B(20-30mM憐酸钢、45-55mM硫酸锭，pH6.0- 6.5) W lOOcm/h的流速洗脱HIC柱W获得经纯化的切S连接的ADC混合物。所述洗脱可W W正 常模式或反向模式进行(如上文解释的）。
[0096] 在本发明方法的另一个具体实施方案中，所述方法包括使用首先用Ξ个柱体积的 缓冲液A(20-30mM乙酸钢、0.55-0.9M硫酸锭，pH 5.0-5.5) WlOOcm/h的流速平衡的HIC柱 (lcmX20cm，Toyopea;rl PPG-600M)，随后加载到在缓冲液A中的缀合反应混合物的柱上(步 骤b)，并收集包含非缀合抗体的流过级分(步骤C)。
[0097] 加载后，用^个柱体积的相同缓冲液A( 20-30mM乙酸钢，0.55-0.9M硫酸锭，pH 5.0- 5.5) W lOOcm/h的流速洗涂HIC柱，同时收集流过级分，从而去除残留量的非缀合抗体。 [009引步骤e包括用Ξ个柱体积的缓冲液B(20-30mM乙酸钢，pH 5.0-5.5)W50cm/h至 lOOcm/h的流速洗脱HIC柱W获得经纯化的切S连接的ADC混合物。所述洗脱可正向模式 或反向模式进行(如上文解释的）。
[0099] 因此，纯化切S连接的ADC的混合物主要是为了得到所期望的DAR2和DAR4种类。在 上述条件下，大部分DAR6和DAR8种类、非缀合接头-药物W及任何聚集体杂质保留在HIC柱 上。通过用注射用水(water-for-in jection，WFI)洗涂HIC柱，可W从柱上洗脱DAR6和DAR8 种类W及非缀合接头-药物。
[0100] 根据本发明的方法特别适用于纯化式（II)的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的 混合物
[0101]
[0102] 其中，
[0103] Ab是曲妥珠单抗，并且
[0104] q的范围为0至8。
[0105] 使用用于纯化根据本发明之切S连接的ADC的混合物的方法的结果是显著地从所 述ADC的混合物去除了非缀合抗体，平均DAR增加。例如，如W下实施例3所示，根据式(II)之 Cys连接的ADC化合物的平均DAR在HIC纯化后从1.75增加到2.5。
[0106] HIC纯化后，通常将经纯化的切S连接的ADC的缓冲液改变为冻干缓冲液，随后使用 常规方法和设备冻干Cys连接的ADCW得到冻干的饼(cake)。 实施例
[0…7] 实施例1-式(III)化合物接头-药物溶液的制备
[0108] 在隔离器(手套箱)的保护环境中，将足够量的式（III)化合物的固体称重到瓶中。 将所述固体溶解于100%的DMAc中W达到约20mM的浓度。然后，将所述瓶从隔离器中取出并 在室溫下且避免光照地将其储存在通风楓中。
[0109] 在确定确切的浓度后，将接头-药物溶液稀释至40mM。
[0"0]实施例2-接头-药物与曲妥珠单抗的缀合
[0111] 将抗肥R2单克隆抗体(mAb)曲妥珠单抗与式（III)的接头-药物缀合，从而得到式 (II)的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的混合物。
[0112] 所有操作均在通风楓中于持续揽拌下进行。
[0113] 在缀合之前，立即将在pH 6的4.2mM组氨酸、50mM海藻糖、0.01%聚山梨醇醋20中 的60mg/mL曲妥珠单抗的溶液与还原缓冲液(4.2mM组氨酸、50mM海藻糖、3mM EDTA(乙二胺 四乙酸）和ImM TCEP，pH 6) W 2:1混合。TCEP是还原剂并且W相对于1当量曲妥珠单抗1.15 摩尔当量的摩尔比添加 W使每个mAb产生2个游离琉基。在室溫下解育60分钟后，添加 N，N- 二甲基乙酷胺(DMAc)溶液（100% )和式(III)的接头-药物(在DMAc中lOmM，相对于mAb为2.2 当量似使得DMAc的终浓度为2.5 % v/v。
[0114] 在过夜缀合后，通过活性炭过滤器(ZetaCarbon化P，3M)，随后通过0.2WI1聚酸讽 (PES)过滤器过滤该混合物W去除不溶的过量式(III)的接头-药物。
[0115] 图2A和图3A示出了在分析型HIC柱(下文描述)上两个不同批次的所得缀合反应混 合物的色谱图。没有检出DAR8。平均DAR经计算为1.75。
[0"y 实施例3-使用HIC的纯化
[0117] 所有的色谱步骤均在室溫下进行。
[0118] 通过将憐酸钢(84mM)和硫酸锭(2.21M)的缓冲液体积的缓冲液与2体积的缀合 反应混合物的比混合W得到在DH 6.5下终浓度26mM的憐酸钢和0.62M的硫酸锭来制备上述 获得的缀合反应混合物W用于HIC柱纯化。
[0119] 制备型 8cmX 20cm 柱填充有 Butyl SeDharose 4化31 Flow(GE Healthcare)。用3 个柱体积的缓冲液A(26mM憐酸钢、0.62硫酸锭，pH 6.5)W100 cm/h的流速平衡柱。将缀合反 应混合物加载到柱上直到lOg/L的柱填充材料/树脂。流速设定为lOOcm/h。在运些条件下， 非缀合抗体(即，曲妥珠单抗)不与柱结合/流过柱，并用3个柱体积的缓冲液A(26mM憐酸钢、 0.62M硫酸锭，DH 6.5) W lOOcm/h的流速进一步从柱洗掉非缀合抗体。收集并合并加载及洗 涂的流过级分。通过用3个柱体积的缓冲液B(25mM憐酸钢、50mM硫酸锭，pH 6.2) WlOOcm/h 的流速洗脱来实现半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的DAR2和DAR4种类的洗脱。在运些条 件下，任何剩余的非缀合接头-药物和大部分DAR6半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物保留在 柱上。用2个柱体积的注射用水(WFI) W lOOcm/h的流速洗涂柱W洗脱任何剩余的非缀合接 头-药物和大部分DAR6半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物。
[0120]图2B示出了在制备规模上进行HIC纯化后，在分析型HIC柱(下文描述)上缀合反应 混合物的色谱图。没有检出DAR0。平均DAR经计算为2.50。
[0。1] 实施例4-使用HIC的替代纯化
[0122] 所有色谱步骤均在室溫下进行。
[0123] 通过将乙酸钢(75mM)和硫酸锭(2.4M)的缓冲液体积的缓冲液与2体积的缀合 反应混合物混合W达到在pH 5.3下终浓度为25mM的乙酸钢和0.8M的硫酸锭来制备如上述 获得的单独批次的缀合反应混合物W用于HIC柱纯化。
[0124] 制备型IcmX20cm柱填充有Toyopearl PPG-600M(Tosoh Bioscience)。用3个柱体 积的缓冲液A(25mM乙酸钢、0.8M硫酸锭，pH 5.3)WlOOcm/h的流速平衡柱。将缀合反应混合 物加载到柱上直到35g/L的柱填充材料/树脂。流速设定为lOOcm/h。在运些条件下，非缀合 抗体(即，曲妥珠单抗)不与柱结合/流过柱，并用3.5个柱体积的缓冲液A(25mM乙酸钢、0.8M 硫酸锭，pH 5.3)WlOOcm/h的流速进一步从柱中洗掉非缀合抗体。收集并合并加载及洗涂 的流过级分。通过用3.5个柱体积的缓冲液B(25mM乙酸钢，pH 5.3)WlOOcm/h的流速洗脱W 实现半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的DAR2和DAR4种类的洗脱。在运些条件下，任何剩余 的非缀合接头-药物和大部分DAR6半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物保留在柱上。用2个柱 体积的40%异丙醇WlOOcm/h的流速洗涂柱W洗脱任何剩余的非缀合接头-药物和大部分 DAR6半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物。
[0125] 图3B示出了在制备规模上进行HIC纯化后，在分析型HIC柱(下文描述)上缀合反应 混合物的色谱图。没有检出DAR0。平均DAR经计算为2.80。
[01%] 实施例5-使用分析型HIC的分析
[0127] 通过分析型疏水作用色谱化1C)进行半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的分析。通 过用90化0.89M的硫酸锭水溶液稀释10化的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物产生在0.8M 硫酸锭中终浓度Img/mL的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物来制备样品。将10化的该样品 注射到TSKgel But^-NPR柱(Tosoh Bioscience)上。洗脱方法由在20分钟内W〇.4ml/分钟 的从100 %缓冲液C(25mM憐酸钢、1.5M硫酸锭，pH 6.95)至100 %缓冲液D (25mM憐酸钢，pH 6.95，20 %异丙醇）的线性梯度组成。使用配备有PDA检测器和Empower软件的Waters Acquity H-Class UPLC系统。在214皿处测量吸光度并测定半脫氨酸连接的抗体-药物缀合 物的保留时间。
[0128] 在曲妥珠单抗/Hereeptki?样品上应用相同的分析方法，并且如上所述制备该 样品并在214nm处测量样品的保留时间。
[0129] 实施例6-相对疏水性的测定
[0130] 使用切S连接的ADC之混合物中所述DAR2种类的保留时间（Rt)计算DAR2半脫氨酸 连接的抗体-药物缀合物种类的相对疏水性，并使用下式计算曲妥珠单抗/.Herceptmii的 保留时间：
[013。 [Rt(DAR2)-Rt(曲妥珠单抗/脈fcep紙I?) ]/化（曲妥珠单抗/脈reep献Λ。
[0132]当曲妥珠单抗/Herceptin?的保留时间为6.7分钟时，在上述分析型HIC柱上式 (II)的半脫氨酸连接的抗体-药物缀合物的MR2种类显示9.6分钟的保留时间和0.4的相对 疏水性。
【主权项】
1. 用于纯化半胱氨酸连接的抗体-药物缀合物之混合物的方法，其中非缀合抗体的量 在按重量计10%至40%的范围内，所述方法包括： a. 提供在0.2M至1.5M盐水溶液中的所述混合物； b. 将所述溶液加载到制备型疏水作用色谱柱上； c. 收集含有非缀合抗体的流过级分； d. 用0.2M至1.5M盐水溶液洗涤所述柱，同时收集所述流过级分；以及 e. 用OmM至IOOmM盐水溶液洗脱所述柱以获得经纯化的半胱氨酸连接的抗体-药物缀合 物的混合物。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述柱填充有Fractogel EMD propyl、Fractrogel EMD phenyl、Butyl_S sepharose^Octyl Sepharose>Capto Octyl ^Capto ButyKCapto Phenyl ImpRes、Capto Butyl ImpRes、Toyopearl PPG_600M、Toyopearl Hexyl-650、 Toyopearl Butyl-650、Toyopearl PhenyI_650、Toyopearl Ether-650^Macroprep t_ Butyl、Macroprep phenyl、Cellufine Butyl、Cellufine Phenyl或Poros HP2〇 3 ·根据权利要求1或2所述的方法，其中所述柱的直径在4 · Omm至2，OOOmm，优选15mm至 2 ,OOOmm的范围内。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述柱负荷在5g/L至50g//L的柱填充 材料，优选5g/L至40g/L的柱填充材料的范围内。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述柱填充材料的平均颗粒大小在30 μπι至180μηι的范围内。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述盐水溶液的盐选自：硫氰酸钾、氯 化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾和硫酸铵，优选地所述盐是氯化钠或硫酸铵。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述盐水溶液还含有缓冲液。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述缓冲液选自：磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、乙酸钠、 乙酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、及其混合物，优选地所述缓冲液是磷酸钠或乙酸 钠。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其中所述盐水溶液被缓冲至pH约4至约8。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤e中的所述洗脱以反向模式进 行。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中当在如本说明书中所限定的条件下 在分析型TSKgel Butyl-NPR HIC柱上进行测量时，相对于曲妥珠单抗/Herceptin，DAR2半 胱氨酸连接的抗体-药物缀合物的相对疏水性在0.1至0.6的范围内。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述半胱氨酸连接的抗体-药物缀 合物的混合物为式(I)的混合物其中η是1至16的整数， R选自 H、CH3、CH2CH3、OCH3、OCH 2CH3、CF3、OCF3、Cl、F， q的范围为0至8,且 DB是选自以下的DNA结合部分：13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述Ab选自：抗CD 19抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗 体、抗⑶33抗体、抗⑶56抗体、抗⑶70抗体、抗⑶74抗体、抗⑶138抗体、抗CLL-1抗体、抗5T4 抗体、抗⑶303抗体、抗标签72抗体、抗Lewi s A样碳水化合物抗体、抗EphB3抗体、抗HMW-MAA 抗体、抗⑶38抗体、抗Cr ipto抗体、抗EphA2抗体、抗GPNMB抗体、抗整联蛋白抗体、抗MN抗体、 抗HER2抗体、抗PSMA抗体、抗EGFR抗体、抗⑶203c抗体、抗SLC44A4抗体、抗连接蛋白-4抗体、 抗间皮素抗体、抗CD44抗体、抗CD79抗体、抗FcRL5抗体、抗MUC16抗体、抗NaPi 2b抗体、抗 STEAP-1抗体、抗ETBR抗体、抗TF抗体、抗MUCl抗体、抗HGFR抗体、抗CD37抗体、抗FOLR1抗体、 抗CEACAM抗体、抗TR0P2抗体、抗GCC抗体、抗Lewis Y抗体、抗LIVl抗体、抗DLL3抗体和抗 EPCAM抗体。14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述半胱氨酸连接的抗体-药物缀 合物的混合物为式(II)的混合物其中， Ab是曲妥珠单抗，并且 q的范围为O至8。
【文档编号】A61K47/48GK105899235SQ201580003965
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月9日
【发明人】盖伊·鲁德, 鲁德·马丁·韦斯泰根, 鲁迪·赫拉尔杜斯·伊丽莎白·库曼斯
【申请人】斯索恩生物制药有限公司