专利名称：一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，尤其涉及一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法。
背景技术：
人尿胰蛋白酶抑制剂(Humanurinary trypsin inhibitor,简称为 HUTI)，是一种从人尿中分离纯化的药用蛋白，对胰蛋白酶、纤溶酶、弹性蛋白酶等多种酶均具有抑制作用。1909年，Beurer等首次发现了在人尿中存在的一种对胰蛋白酶有抑制作用的蛋白，也由此命名为人尿胰蛋白酶抑制剂。直到1977年，科学家首次成功地从人尿中经分离纯化得到完整的HUTI分子。HUTI是由143个氨基酸组成的一种糖蛋白，N端和C端分别为丙氨酸和亮氨酸。HUTI分子量为37000 43000 (SDS-PAGE电泳法)，等电点为2. 5左右。HUTI具有抑制胰蛋白酶等多种酶的生理功能，这与HUTI自身的分子结构有关。HUTI具有多个功能结构域，其中Kimitz型结构域是其主要的活性结构域。HUTI在临床上的应用最初是用于治疗急性胰腺炎，经过临床研究证明，HUTI对治疗胰腺炎具有良好的效果。HUTI的临床应用远不止于此，其多样的生物功能决定了其多样的临床应用价值。经研究发现HUTI可参与细胞表达分泌调控；参与炎症反应的调控，局限炎症反应，帮助组织的修复；可改善休克时的循环状况，减少器官功能衰竭；手术时有预防细胞功能障碍和改善细胞能力代谢的作用；具有保护羊膜、抑制宫缩、防治早产和降低围产期死亡的作用；可降低肿瘤细胞的扩散能力和侵袭力，抑制肿瘤细胞的转移等。由于HUTI在临床上的应用价值，人们一直在不断探索生产HUTI的新技术。当前， HUTI的制备工艺主要是使用阴离子交换层析法、阳离子交换层析法、疏水层析法、金属螯合层析法、凝胶层析法、亲和层析法或这几种方法得组合纯化HUTI，这些方法中有的工艺过于复杂，总收率非常低，有的则虽然工艺简单，但是具有不稳定或纯度不高等不足。因此，本领域的技术人员仍在不断地探索更好、更合理的纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，该方法适合在中高盐条件下实现对HUTI的有效吸附，通过改变流动相pH来实现HUTI的洗脱，可以避免对料液的预处理，提高纯化的效率。本发明是这样来实现的，方法步骤为
a.将人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解在水中，使得过滤后电导不低于30mS/cm，用稀盐酸将滤液PH调至2-5，接着用耐盐性混合模式吸附剂装柱对人尿胰蛋白酶抑制剂进行静态吸附，再通过常规柱层析纯化方法洗脱并收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；
b.利用pH为7-10的洗脱缓冲液对耐盐性混合模式吸附剂进行洗脱，收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；c.将收集的人尿胰蛋白酶抑制剂洗脱高峰进行冷冻干燥，即得到高纯度的人尿胰蛋白酶抑制剂。 所述耐盐性混合模式吸附剂的结构为为耐盐性混合模式吸附剂的载体包括甲基丙烯酸聚合物、琼脂糖或纤维素。所述耐盐性混合模式吸附剂的制备方法为
a.活化取甲基丙烯酸聚合物、琼脂糖或纤维素作载体，将载体与溶解于丙酮中的羰基二咪唑在30°C条件下搅拌反应，洗涤后抽干，得到活化的载体介质；
b.接臂将活化的载体介质加入到氨基己酸溶液中30°C搅拌，进行缩合反应，得到氨基己酸-甲基丙烯酸聚合物复合物；
c.偶联氨基己酸-载体介质复合物再与苯乙胺发生偶联反应，控制氨基己酸与苯乙胺的缩合反应，使得反应后羧基含量不低于30%，得到耐盐性混合模式吸附剂；
d.上述氨基己酸溶液1kg氨基己酸溶于1升pH9.3碳酸盐缓冲液；以上各步反应所用的试剂用量比例见下表
权利要求
1.一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是方法步骤为a.将人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解在水中，使得过滤后电导不低于30mS/cm，用稀盐酸将滤液PH调至2-5，接着用耐盐性混合模式吸附剂装柱对人尿胰蛋白酶抑制剂进行静态吸附，再通过常规柱层析纯化方法洗脱并收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；b.利用pH为7-10的洗脱缓冲液对耐盐性混合模式吸附剂进行洗脱，收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；c.将收集的人尿胰蛋白酶抑制剂洗脱高峰进行冷冻干燥，即得到高纯度的人尿胰蛋白酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是所述耐盐性混合模式吸附剂的结构为为
3.根据权利要求1所述的利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是耐盐性混合模式吸附剂的载体包括甲基丙烯酸聚合物、琼脂糖或纤维素。
4.根据权利要求2所述的利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是所述耐盐性混合模式吸附剂的制备方法为a.活化取甲基丙烯酸聚合物、琼脂糖或纤维素作载体，将载体与溶解于丙酮中的羰基二咪唑在30°C条件下搅拌反应，洗涤后抽干，得到活化的载体介质；b.接臂将活化的载体介质加入到氨基己酸溶液中30°C搅拌，进行缩合反应，得到氨基己酸-甲基丙烯酸聚合物复合物；c.偶联氨基己酸-载体介质复合物再与苯乙胺发生偶联反应，控制氨基己酸与苯乙胺的缩合反应，使得反应后羧基含量不低于30%，得到耐盐性混合模式吸附剂；d.上述氨基己酸溶液1kg氨基己酸溶于1升pH9.3碳酸盐缓冲液；以上各步反应所用的试剂用量比例见下表
5.根据权利要求1所述的利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是洗脱缓冲液为磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、 碳酸氢钠溶液、氨水、铵盐溶液、氯化钠溶液的一种或若干种的混合物。
全文摘要
一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，方法步骤为a.将人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解在水中，使得过滤后电导不低于30ms/cm，将滤液pH调至2-5，接着用耐盐性混合模式吸附剂选择性吸附人尿胰蛋白酶抑制剂；b.利用pH为7-10的洗脱缓冲液对耐盐性混合模式吸附剂进行洗脱，收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；c.将收集的人尿胰蛋白酶抑制剂洗脱高峰进行冷冻干燥，即得到高纯度的人尿胰蛋白酶抑制剂。本发明的技术效果是本发明的纯化方法具有纯化效率高，工艺步骤少，容易放大等特点，便于实现该技术的产业化应用。
文档编号C07K1/22GK102167739SQ20111003770
公开日2011年8月31日 申请日期2011年2月15日 优先权日2011年2月15日
发明者万偲, 朱碧君, 杨华英, 饶志伟, 高铁旦 申请人:南昌市浩然生物医药有限公司