专利名称:用“高聚物、盐、水”两相系统纯化酶制剂的制作方法
本发明属酶制剂的提纯方法。
随着酶制剂发酵工业的迅速发展，发酵产品的分离纯化技术日显迫切需要，将发酵所得酶制剂应用于食品加工业之前，必须先将粗酶制品中所含的不符合卫生要求、有使人不愉快气味和色泽的种种杂质除去，方可应用。1977年前后，西德学者M.-R.Kula等人将水两相系统应用于酶制剂工业生产过程。他们采用葡聚糖、聚乙二醇、水所构成的两相系统，分离纯化了克雷伯氏肺炎菌(Klebsie-lla pneumoniae)产生的异淀粉酶(普鲁兰酶)和1，4葡聚糖磷酸化酶，以及由大肠杆菌产生的三种氨基酰tRNA合成酶，并获得专利权〔西德专利DE2616584(1977)〕，采用葡聚糖、聚乙二醇、水两相系统，虽可对细胞、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等生物大分子或颗粒进行分离纯化，但由于葡聚糖的价格十分昂贵，不利于大规模工业生产上使用。
本发明的任务是给酶制剂大规模生产过程提供一种成本低廉、操作简单、效率高而且安全的分离纯化技术，使经过纯化的产品可供食品加工业及其它方面应用。
本发明采用了价格低廉的、对人畜安全的高聚物、盐、水构成的两相系统，对酶制剂进行分离提纯。具体做法是用聚乙二醇(简称PEG)、盐、水构成的两相系统，通过液、液萃取操作方法(见具体操作方法)，纯化发酵生产的枯草杆菌α-淀粉酶，以及其它酶制剂(包括蛋白酶、脂肪酶等发酵生产的酶制剂)，使之能适用于食品加工工业。
枯草杆菌α-淀粉酶是工业发酵液喷干粉，它内部含有大量杂质(包括培养基附随物、细菌菌体、色素等)，并带有不愉快的气味。利用α-淀粉酶、杂质在水两相系统中有不同的分配行为，可以将它们分离。首先令粗酶混悬液于〔10～30%(最好是20.5%)PEG/10～20%(最好是13.7%)(NH4)2SO4〕两相系统中进行分相，分相后，90%以上的α-淀粉酶存在于上层相(PEG相)中;不溶性物质(如菌体、培养基附随物)聚集于两相界面;亲水性色素则分布于下层相(硫酸铵相)。去除下层相后，加入适量磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液，构成10～30%(最好是13.7%)PEG/10～30%(最好是10%)磷酸盐两相系统，此时α-淀粉酶转入新的下层相里(即磷酸盐相)，而其它杂质、色素则存留于上层PEG相中。去除上层相后，就可以获α-淀粉酶溶于磷酸缓冲液中的液态制剂。这种液态α-淀粉酶制剂无色、无味。经透析除盐、冻干，便可制成粉状制剂，可用于食品加工业，或供进一步精制的中间原料。
提纯α-淀粉酶所用试剂有下列几种
1.50%(每一百克溶液含PEG50克。以下均同)聚乙二醇(PEG6000)胶态溶液。
2.50%(每一百毫升溶液含硫酸铵50克。以下均同)硫酸铵(NH4)2SO4溶液。
3.25%(每一百毫升溶液含磷酸盐25克，以下同)磷酸盐〔Na2HPO4-NaH2PO4〕缓冲液，PH值为6.0。
4.12.5%(每一百毫升溶液中含酶制品12.5克)枯草杆菌α-淀粉酶粗酶混悬液。
具体操作方法如下1.取容积为125毫升带刻度的液漏斗，称重加入50%PEG溶液10～30克(最好是20.5克)，终浓度为10～30%(最佳为20.5%)，用移液管加入50%(NH4)2SO4溶液10～20毫升(最好是13.7毫升)，终浓度为10～20%，(最好为13.7%)，12.5%粗酶液16.0毫升。系统总体积为50毫升(以上重量、体积均可按比例放大或缩小)。充分摇荡均匀，静置待分层清晰后，记录上下相体积，各取出1毫升，进行酶活力及蛋白质浓度测定。
2.从分液漏斗放出下层相。上层相仍留在分液漏斗中，再加入25%磷酸盐缓冲液35毫升，蒸馏水25毫升(以上重量、体积均可按比例放大，缩小)。充分摇匀，静置分层记录两相体积。各取出1毫升，按Bernfeld法测α-淀粉酶活力及蛋白质浓度。在581-G型比色计中使用绿色滤光片追踪黄色色素的分布动向。
3.分出下层相得α-淀粉酶精制品浓液中透析除盐，冻干即得成品。
在本项发明“高聚物、盐、水”两相系统中，所用高聚物聚乙二醇完全无毒，对人畜安全，是合格的食品填充剂。由于构成两相系统的主要成份是水，因而有利于酶蛋白的稳定性;使用本系统所需设备简单，操作方便，分离迅速，效率高，操作规模可以根据生产情况准确放大和缩小。且原材料成本低廉，适宜于大规模工业生产过程的使用。
权利要求
1.一种酶制剂的提纯方法，其特征是采用“高聚物、盐、水”所构成的两相系统对酶制剂进行分离提纯。
2.根据权利要求
1所述的酶制剂提纯方法，其特征是可采用“聚乙二醇、盐、水”两相系统对枯草杆菌α-淀粉酶制剂进行分离提纯。
3.一种如权利要求
1、2所述的酶制剂提纯方法，其特征是采用如下具体做法a.取50%的聚乙二醇溶液(每一百克溶液含聚乙二醇50克，以下同)10～30克，(终浓度为10～30%)，置于分液漏斗中，加入50%硫酸铵(NH4)2SO4溶液(每一百毫升溶液含硫酸铵50克，以下同)10～20毫升，(终浓度为10～20%)、12.5%枯草杆菌α-淀粉粗酶液(每一百毫升溶液含酶制品12.5克，下同)16.0毫升，(以上重量、体积均可按比例放大、缩小)充分摇荡均匀，静置分层;b.从分液漏斗放出下层相，上层相仍留在分液漏斗中，另外加入25%磷酸盐缓冲液(每一百毫升溶液含磷酸盐25克)20～40毫升，蒸馏水25毫升，(以上重量体积均可按比例放大缩小)，充分荡匀，静置分层;c.分出下层相得α-淀粉酶精制品溶液，透析除盐冻干即得成品。
4.根据权利要求
3所述的酶制剂提纯方法，其特征是最佳做法如下a.取50%的聚乙二醇溶液20.5克，(终浓度为20.5%)，置于分液漏斗中，再加入50%硫酸铵(NH4)2SO4溶液13.7毫升，(终浓度13.7%)，12.5%枯草杆菌α-淀粉粗酶液16毫升，(以上重量体积均可按比例放大缩小)，充分摇荡均匀，静置分层;b.从分液漏斗放出下层相，上层仍留在分液漏斗中，另外加入25%磷酸盐缓冲液35毫升，蒸馏水25毫升，(以上重量体积均可按比例放大缩小)，充分摇匀，静置分层;c.分出下层得α-淀粉酶精制品溶液，透析除盐，冻干即得成品。
专利摘要
本发明属酶制剂的提纯方法。
文档编号C12N9/28GK86103207SQ86103207
公开日1987年11月18日 申请日期1986年5月5日
发明者林哲甫, 张维钦, 李玉玲 申请人:中山大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan