一种耐高温木聚糖酶基因及其蛋白表达与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程及工业酶制剂领域，特别涉及一种耐高温木聚糖内切酶基因xynIIA异源重组表达及应用。
【背景技术】
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[0002]植物细胞壁多糖是地球上最丰富的生物质，是生物燃料生产的一项重要资源。植物细胞壁主要是由纤维素(40.6-51.2%)、半纤维素(37.2%_28.5)，和木质素(13.6-28.1%)组成的。其中半纤维素是仅次于纤维素的第二大可再生物质。而半木聚糖是半纤维素的主要组分。它是一个以β-1，4-糖苷键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基比如乙酰基、阿拉伯糖基、4-0-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的(Biely，P.，1985.Trendsin B1technology, 3 (11), 286-290)。木聚糖的完全降解,可以产生多种形式的纤维素类物质，从而有利于提高麦秸、玉米芯、杂柏等非常规、低成本原料的工业利用率和饲料转化效率。木聚糖的完全降解需要多种水解酶的参与而共同完成，它包括主链水解酶β_1，4-内切木聚糖酶、木糖苷酶和侧链水解酶a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶。其中β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。木聚糖酶可以应用在饲料、食品、纸浆(或纸)、纺织、脱墨、金属污染的污水处理等方面。在应用于生产饲料或能源的粮食加工过程中，木聚糖酶和通常应用于固态农工废弃物如稻草、小麦麸皮，甘蔗蔗渣的发酵。在食品加工方面，木聚糖酶是促进木聚糖水解并产生低聚木糖的高效酶，而木聚糖则是一种新兴的有益于人类肠道健康的益生元。在漂白纸浆(或纸)方面，木聚糖酶预处理能有效地提高产品质量。
[0003]木聚糖酶因为蛋白的折叠形式、作用机制、底物的特异性、水解效率、酶解产物和理化特性的不同，被归纳为GH5，GH8, GH10, GHlI, GH30和GH43六个不同的糖苷水解酶家族(Collins, T.，2005.FEMS microb1logy reviews, 29 (I), 3-23)。其中木聚糖酶大多存在于GHlO和GHll家族中。GHll作为木聚糖酶最主要的两个GH家族之一，以其对底物的特异选择性、低的蛋白分子量和高的等电点等特性区别于其他GH家族的木聚糖内切酶。木聚糖酶中的催化结构域为糖苷水解酶家族(GHs)，但在一些木聚糖酶中除了催化结构域之外还含有非催化结构域，这些结构域能促进酶与底物(特别是不溶性底物)的结合，被称为碳水化合物结合结构域(CBM)。它们在木聚糖和低聚木糖的水解过程中有着至关重要的作用。其中有的CBM还常常表现出对底物结合的特异性，并对耐热型木聚糖酶的热稳定性和酶活特异性有一定的影响(Wassenberg, D., 1997.Protein science, 6 (8), 1718-1726)。
[0004]已发现的厌氧型热解纤维素杆菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis能够在45-82 °C的环境下生长，其生长最适温度为70°C，并且能分解和利用纤维素、果胶、淀粉和木聚糖等(Mangala, S.，2003.Journal of MolecularCatalysisB:Enzymatic, 21 (4), 221-230)。C.kronotskyensis分泌的高温木聚糖酶具有相当可观的工业应用前景，且该菌株的全基因组测序已经完成。通过序列分析发现其基因组中有多种潜在的木聚糖酶基因，本发明提供一种携带有CBM的GHl I家族的木聚糖内切酶基因及其蛋白表达方法和应用。该木聚糖内切酶有优良的耐高温性能和较好的PH稳定性，并且在特定的条件下有极高的活性，具有潜在的工业应用价值。
【发明内容】
[0005]发明目的:
[0006]本发明的目的之一是提供一种能够应用于工农业的耐高温木聚糖内切酶。
[0007]本发明的目的之二是提供上述耐高温木聚糖内切酶的编码基因。
[0008]本发明的目的之三是提供包含上述耐高温木聚糖内切酶的重组载体。
[0009]本发明的目的之四是提供一种制备上述耐高温木聚糖内切酶的方法。
[0010]本发明的目的之六是提供上述耐高温木聚糖内切酶的应用。
[0011]本发明的技术方案:
[0012]为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案:
[0013](I)上述高温木聚糖酶基因xynllA工程菌的构建
[0014]①提取热解纤维素菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis的基因组，分别设计引物扩增xynllA。
[0015]②得到的目的基因片段和载体pET_28b经T4聚合酶处理后，连接转化大肠杆菌ToplO感受态细胞中。
[0016]③筛选阳性克隆送至测序公司(上海生工)测序，并对测序正确的工程菌提取重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，获得上述三种重组菌。
[0017](2)制备耐高温木聚糖内切酶XynllA
[0018]①培养上述重组菌株，加IPTG诱导表达。
[0019]②收集菌体，超声破碎，65°C热失活，亲和层析以及凝胶层析。
[0020]③SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达和纯化情况。
[0021](3)耐高温木聚糖内切酶XynllA酶学性质测定
[0022]①对木聚糖内切酶XynllA进行最适pH、最适温度、pH稳定性及热稳定性测定。
[0023]②对耐高温木聚糖内切酶XynllA进行特异性酶活测定。
[0024](4)耐高温木聚糖内切酶XynllA在酶解天然木聚糖和木质纤维素原料上的应用。
[0025]以秸杆、甘蔗渣、玉米芯等为底物，加入一定量的重组耐高温木聚糖酶XynllA，于60-750C、pH6.0条件下酶解6_24小时。取水解样品分析酶解产物，酶解产生是糖可作为微生物的发酵碳源。
【附图说明】
[0026]图1.耐高温木聚糖内切酶XynllA凝胶层析图谱和SDS-PAGE分析:A.凝胶层析图谱；B.Superdex200凝胶层析纯化后XynllA的SDS-PAGE分析。
[0027]图2.不同pH和温度对耐高温木聚糖内切酶XynllA活性的影响:A.不同pH对XynllA活性的影响；B.不同温度对XynllA活性的影响；
[0028]图3.耐高温木聚糖内切酶XynllA的pH稳定性及热稳定性:A.XynllA的pH稳定性；B.XynllA的热稳定性.
[0029]图4.耐高温木聚糖内切酶XynllA水解产物TLC:A.适当控制加酶量可以生成低聚木糖；B.榉木木聚糖和低聚木糖水解产物分析。
[0030]具体的实施方式
[0031]实施例1:耐高温木聚糖内切酶XynllA基因工程菌的构建和酶的表达
[0032]1.1基因组DNA的提取
[0033]取5ml 高温无氧条件下培养的 Caldicellulosiruptor kronotskyensis 菌液,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取Caldicellulosiruptor kronotskyensis细菌基因组，得到基因组DNA，-20°C冻存备用。
[0034]1.2引物设计
[0035]根据已发表Caldicellulosiruptor kronotskyensis基因组信息，预测木聚糖内切酶基因，设计如下引物:
[0036]用于扩增耐高温木聚糖内切酶基因xynllA的引物如下
[0037]xynllA-F:5，-GCC GCG CGG CAG CAT GGC AAT AAC CCT CAC AT—3，
[0038]xynllA-R:5’-GCG GCC GCA AGC GTT TAC TTA ATC TCC AAA TAA TCA AG-3’
[0039]用于扩增载体pET_28b的引物如下:
[0040]pET-28b-vector-F:5，-CGC TTG CGG CCG CAC TCG-3’
[0041]pET-28b-vector-R:5’-TGC TGC CGC GCG GCA CCA-3’
[0042]1.3PCR反应体系
[0043]耐高温木聚糖内切酶基因xynllA PCR:
[0044]在20ul体系中:1μ I模版DNA，上下游引物各0.8μ I (引物浓度为ΙΟμΜ)，10 μ 12*Pfu master mix (购自 TAKARA),力口 ddH20 至总体积 2O μ I。PCR 反应条件:94°C预变性5min ;第一个循环程序为94°C变性30s，35°C退火30s，72°C延伸2min，5个循环；第二个循环程序为94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，25个循环；最后72°C延伸5min。
[0045]pET-28b PCR:
[0046]在50μ I体系中:1μ I模版DNA，上下游引物各1.5μ I (引物浓度为ΙΟμΜ)，
1μ I KOD-PLus-酶(购自 Τ0Υ0Β0)，5 μ IlOx per buffer for KOD-PLus-, 5 μ 12mM dNTPs,
2μ 125mM MgSO4,加ddH20至总体积50 μ I。PCR反应条件:94°C预变性2min ;循环程序为94°C变性 15s，61。。退火 30s，68。。延伸 6min,30 个循环。
[0047]反应结束后取5μ I反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自上海生工)回收。
[0048]1.4耐高温木聚糖内切酶基因xynllA处理与连接
[0049]xynllA基因片段和质粒pET_28b EK/LIC用T4DNA Polymerase处理后，室温连接15min,获得重组表达载体pET-28b_xynllA。