黄瓜靶斑病抗病基因Cca及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因序列和应用领域，具体涉及黄瓜靶斑病抗病基因 Cca及其编码蛋 白和应用。
【背景技术】
[0002] 黄瓜（Cucumis Sativus. L)在世界上广泛栽培，中国是世界上黄瓜栽培面积最大、 总产量最高的国家。
[0003] 黄瓜棒孢叶斑病，又称祀斑病，是一种世界性分布的病害。目前已成为危害黄瓜露 地和保护地栽培的重要病害之一，尤以越冬温室、冬春温室、春大棚等保护地内发生严重。 主要危害叶部，病斑初呈淡褐色后变褐绿色，严重时叶片枯死。该病导致落叶率低于5 %时， 病情扩展慢，约2周，而后一周内发展快，落叶率可由5 %发展至90 %。棚室内反季节种植黄 瓜在冬春季节和初夏均易流行发病。田间发病率一般在10% -25%，严重时为60% -70%， 造成损失达30%以上。
[0004] 黄瓜祀斑病的病原菌为多主棒孢菌[Corynespora cassiicola (Berk. Curt.) Wei.]，属半知菌类真菌。多主棒孢菌丝分枝、半透明、壁光滑，宽2~6μηι。无子座。分生 孢子梗由菌丝衍化而来，直立、单生、浅棕色，有隔膜。分生孢子梗顶端具有〇~9个圆柱 状的层出梗，层出梗宽4~Ι?μπι，长110~850μπι。分生孢子常单生，或2~6个串生于 顶端，分生孢子直立或稍弯，圆柱形或倒棍棒形，半透明至浅橄榄色，4~20个假隔膜，基脐 4~8μπι宽，孢子大小为9~22μπιΧ40~220μπι。多主棒孢是一个高度变异的群体，导 致棒孢叶斑病防治过程中常常存在抗病品种持效期短、化学药剂防效不稳定等，不仅使生 产投入增加且会造成环境安全隐患，倒茬嫁接使技术困难和劳动成本增加。因此快速选育 抗病品种是解决靶斑病危害的最佳途径。
[0005] 克隆基因是寻找与目标性状连锁的分子标记最重要的应用之一。图位克隆 (Map-based cloning)是利用分子遗传图谱，把目标性状和分子标记通过遗传连锁作图联 系起来，把目标基因定位在与之连锁非常紧密的侧翼标记之间；也可以用群体分离分析法 (BSA法）或近等基因系法得到与目标基因连锁的分子标记，然后利用作图群体把该分子标 记定位到图谱上。然后由这些标记去筛选大片段DNA文库，鉴定出与标记有关的克隆，继 之以亚克隆和染色体步移（Chromosome walking)形式获得含有目的基因的克隆片段，最终 再辅之以转化和互补测验加以验证（王永飞，分子标记在植物遗传育种中的应用原理及现 状，西北农林科技大学学报（自然科学版），2001，106-113)。目前，运用基于图位克隆技术 已分离到了大量的植物基因，尤其是与抗病有关的基因（闻其涛，植物基因分离的图位克 隆技术，分子植物育种，2005, 585-590)，但未见有关黄瓜靶斑病的抗病基因被成功克隆的 报道。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种黄瓜祀斑病抗病基因 Cca。
[0007] 本发明的目的之二在于提供一种上述黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的遗传标记。
[0008] 本发明的目的之三在于提供用于扩增上述黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的一对引物。
[0009] 本发明的目的之四在于提供一种上述黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的cDNA序列。
[0010] 本发明的目的之五在于提供一种上述黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的编码蛋白。
[0011] 本发明的目的之六在于提供一种上述黄瓜靶斑病抗病基因 Cca及遗传标记的应 用。
[0012] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0013] 黄瓜靶斑病抗病基因 Cca，（a)为序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，（b)为 具有与序列表中SEQ ID NO: 1所示序列90%以上同源性且具有与序列表中SEQ ID NO: 1所 示序列相同功能的核苷酸序列。
[0014] 本发明涉及的黄瓜靶斑病抗病基因 Cca是利用抗感遗传群体进行精细定位克隆 获得的。本发明选择经典抗病材料WF2757和重要骨干亲本感病材料新泰密刺，构建F2:3和F2遗传群体，对抗病基因进行初步定位和精细定位，抗靶斑病基因精细定位在6号染色 体的80kb区间范围内，该区间存在3个基因，第1个基因为NB-ARC类基因，第2个基因为 BIM2-like的转录因子相关基因，第三个基因为33-like肽重复序列结构蛋白相关基因。众 所周知，NB-ARC基因具有的保守结构域是典型的NBS-LRR类抗病基因，因此推测该NB-ARC 基因是抗靶斑病的重要候选基因 Cca，其DNA序列是通过对精细定位区间内的基因序列进 行测序获得的。
[0015] 上述SEQ IDN0:1所示的黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的遗传标记，感病基因的第1481 位的碱基T突变为碱基G。
[0016] 用于扩增上述SEQ IDN0:1所示黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的一对引物，分别具有序 列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0017] 本发明根据已公布的黄瓜基因组9930和GY14序列信息，结合利用Softberry在 线预测软件FGENESH(http://sunl. softberry. com/)预测基因结构，并根据预测结果的起 始和终止编码序列，设计基因全长扩增引物一对分别为：序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列，分别利用抗/感材料基因组DNA进行PCR扩增，获得抗/感材料中 基因 Cca的DNA全长序列SEQ IDN0:1(抗病材料）和SEQ ID NO: 2 (感病材料），全长3255bp， 并对抗感材料中的两个基因 DNA序列进行对比和分析，Cca的DNA序列在抗/感材料中存 在一个SNP位点，即在该基因的第1481位，感病材料的碱基为T，抗病材料的碱基为G，其可 以应用于开发抗黄瓜靶斑病分子标记。
[0018] 上述SEQ ID N0:1所示的黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的cDNA序列，具有序列表中SEQ IDN0:3所示的核苷酸序列。
[0019] 本发明涉及的黄瓜靶斑病抗病基因 Cca cDNA(mRNA)序列是利用全长引物SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8作为上下游引物以抗/感材料的总RNA反转录后第一链作为模板进行 PCR扩增获得的，在抗/感材料中基因 Cca的cDNA (mRNA)序列全长分别为SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO:4。利用Softberry在线预测Cca序列，获得cDNA结构，通过SEQ ID NO: 3和SEQ ID N0:4序列的对比，黄瓜抗靶斑病基因 Cca的cDNA (mRNA)在抗/感材料中均仅有一个外 显子，无内含子结构，但是在cDNA序列的981bp的位置抗病材料的碱基为G，感病材料的碱 基为T，正是由于在抗/感材料中这一处碱基的差别，从而导致氨基酸编码的差异，由此导 致功能不同，进而导致NB-ARC基因的抗病性发生变化。
[0020] 上述SEQ ID NO: 1所示黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的编码蛋白为序列表中的SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
[0021] 本发明涉及的黄瓜靶斑病抗病基因氨基酸序列是利用Cca基因在抗/感材料中的 cDNA(mRNA)序列SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4,分别经过softberry在线预测软件翻译获得 抗/感材料中Cca氨基酸（蛋白）序列SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6,并对抗/感材料中的 Cca氨基酸序列进行比对分析，Cca在抗/感病材料中存在1个氨基酸编码差异，表现在第 493位（K-N)。推测该差异导致抗病结构域发生改变，从而导致NB-ARC基因的抗病性发生 变化。
[0022] 上述黄瓜靶斑病抗病基因 Cca或者上述黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的cDNA在选育 黄瓜靶斑病抗病品种中的应用。
[0023] 上述遗传标记在选育黄瓜靶斑病抗病品种中的应用。
[0024] 本发明具有如下有益效果：
[0025] 本发明利用图位克隆和正向遗传学方法，对黄瓜靶斑病抗病基因 Cca进行精细定 位和克隆，获得黄瓜靶斑病抗病基因 Cca，并对该基因在抗/感病材料中的核酸序列和氨基 酸序列进行分析和比对，获得黄瓜靶斑病抗病基因 Cca在抗/感病材料中差异和多态性分 析。本发明通过对不同抗感材料进行序列分析试验以及与田间抗性鉴定结果的对比，验证 了该黄瓜靶斑病抗病基因 Cca的功能。本发明提供的抗病基因 Cca具有重要的应用价值，可 根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记，包括但不限于SNP (单 核苷酸多态）、InDel (插入缺失多态）、RFLP (限制性内切酶长度多态）、CAP (切割扩增片 段多态），用这些标记可鉴定黄瓜及后代植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而 提1?育种效率。
【附图说明】
[0026] 图1是黄瓜靶