利用SPR基因dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用SPR基因 dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖的方法，属昆 虫生理和植物害虫防治技术领域。
【背景技术】
[0002] 斜纹夜蛾 (Fabricius) (Lepidoptera :Noctuidae)，是我国 粮、棉、烟草、蔬菜等作物的重要害虫，且具有很强的耐药性。对于该种的防治目前主要还是 采用化学防治，由于该虫的适应性及耐药性极强，在防治该虫时化学农药用量越来越高，给 食品安全及环境污染问题带来严峻考验。探索绿色防治该害虫的新技术新手段已成为当前 必须重视的问题。
[0003] 近年来兴起的RNA干扰（RNAi)技术除了在基因功能研宄上取得了骄人的成绩， 同时也在病虫害防治上显示出了巨大的潜力。选择合适的靶基因和适当的导入方法是RNAi 技术成功应用于害虫防治的关键。与害虫生存(如生长发育）与生殖(如交配产卵）等有关 的关键基因是RNAi的理想靶基因。基于注射dsRNA的RNAi技术常用于基因功能研宄，在 害虫防治研宄和实践中，害虫通过取食dsRNA (人为喷施、菌体或转基因植物产生）是较为 可行的导入手段，其关键点是要明确害虫是否可通过取食dsRNA而导致靶基因沉默并影响 其生存和生殖。
[0004] Yapici等（2008)最先从果幡Λ 获得一个性肽受体（sex peptide receptor, SPR)，交配过的SPR基因缺失的雌幡与野生处女雌幡一样只产少量卵 且容易对雄性求爱产生应答，而交配过的野生雌蝇却不容易接受雄性的求爱及产卵数量开 始成倍增加。随后SPR基因也在棉铃虫/fe/icoFerjDa arffiigera (Hanin et al. 2012)及 斜纹夜蛾5： /itora (Li et al. 2014)中被发现，注射RNAi表明该基因在这两种蛾类中 同样调控雌性的生殖，并可能影响性信息素的合成与释放。另有研宄还发现，SPR也可能是 幼虫蜕皮和生长发育调节的重要基因 （Yamanaka et al. 2010)，因此，如果在幼虫中沉默 SPR基因，有可能导致其生长发育受到抑制，进而死亡。上述这些研宄中SPR的RNAi只在 成虫中做过，没有在幼虫中开展过，采用的是体内表达和注射dsRNA法，并没有采用过取食 dsRNA法。因此，本发明通过斜纹夜蛾幼虫和成虫取食SPR基因的dsRNA，导致SPR基因表 达沉默，从而致使斜纹夜蛾幼虫生长发育受到抑制，进而死亡，也能够导致雌性成虫交配后 不产卵或只产少量卵。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种利用SPR基因 dsRNA抑制斜 纹夜蛾生长发育和生殖的方法。
[0006] 本发明通过斜纹夜蛾幼虫和成虫取食SPR基因的dsRNA，导致SPR基因表达沉默， 从而致使斜纹夜蛾幼虫生长发育受到抑制，进而死亡，也能够导致雌性成虫交配后不产卵 或只产少量卵。进而抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖，也为绿色防治该害虫提供新思路和技 术。
[0007] 本发明的利用SPR基因 dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖的方法，其具体步骤 如下： (1 )、SPR基因 RNAi目标片段选择及dsRNA制备 根据NCBI数据库中登陆号为JX070670的斜纹夜蛾SPR基因的cDNA序列，通过 siDirect version 2. 0软件进行分析，找到一段最优RNAi目标片段，即JX070670的cDNA 序列的1564 -1792碱基，长229bp，具体序列为： 5' -TAATTTCAAGCACTATAGTCGAAATTTTAGATTACTATATAGCAAACATTTTGATTCTTATAACCAAT TTCTTTATCTTGGTCTCTTATCCTATTAATTTTGCTATTTACTGTGGTATGTCGAGGCAGTTTAGGGAGACGTTTA AAGAACTGTTCATTCGAGGAGCTGTTACTAGCCGTAAGAATGGCGGCTCTAGTAGATACTCCCTGGTCAACGGTCCA AGGACATG-3' 再根据这段长229bp的序列设计dsRNA制备引物一对:ιΗ向引物5' -TAATACGACTCACTA TAGGGCATAATTTCAAGCACTATAGTC-3 '反向引物 5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGCATGTCCTTGGACCG TTGAC-3'，其中下划线部分序列为T7启动子； 用这段引物，以斜纹夜蛾总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR获得目标基因片 段，再以这一片段为模板采用试剂盒合成dsRNA ; (2)、用SPR基因 dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖 a，斜纹夜蛾的人工饲养 斜纹夜蛾幼虫采用人工饲料在24~27°C，60~80%RH，光照：黑暗=14:10的条件下 饲养；在蛹期将雌雄分开单独关养，羽化的成虫用10%蔗糖水喂养；在上述条件下幼虫期为 15天，蛹期11天，成虫期12天；人工饲料为：玉米粉100g，黄豆粉100g，胡萝卜粉50g，酵 母粉3(^，干酪素2(^，蔗糖2(^，琼脂粉2(^，水100〇1111，100°0蒸111; b. dsRNA 喂食 将dsRNA拌入人工饲料中，从0日龄幼虫开始，每天喂食一次，即：0-2日龄每天每只喂 O.lyg dsRNA, 3-6日龄每天每只喂0.5yg dsRNA, 7-15日龄每天每只喂2yg dsRNA;给 0-3日龄的成虫每天每只喂食约2 yg dsRNA，即将dsRNA加入到10%蔗糖水中以供取食； 以喂食不添加 dsRNA的饲料和糖水的幼虫和成虫为对照，通过各期生长发育、致死率、及产 卵分析抑制生长发育和生殖。
[0008] c. dsRNA喂食抑制生长发育和生殖分析 通过各期生长发育、致死率、及产卵分析，结果表明喂食dsRNA的幼虫生长缓慢，幼虫 期达20天以上，幼虫期死亡率在40%以上，蛹期在15天以上，羽化率不足50%，雌虫交配后 产卵量只有400个。而喂食不添加 dsRNA的饲料和糖水的斜纹夜蛾，幼虫期约为15天，幼 虫期死亡率在10%以下，蛹期11天，羽化率在80%以上，成虫期12天，交配后雌虫产卵量平 均在1000个以上。
[0009] 本发明通过人工合成上述dsRNA进行田间喷施，或通过转基因技术将该目标片段 的dsRNA表达载体转化到菌体或植物中产生相应的dsRNA，斜纹夜蛾通过感染菌体或取食 植物组织或花蜜，间接获得SPR基因的dsRNA，引起SPR基因表达沉默，进而抑制斜纹夜蛾 生长发育和生殖，从而达到防治该害虫的目的。
[0010] 本发明的有益效果在于：利用取食SPR基因 dsRNA的基因沉默技术来防治农业重 要害虫斜纹夜蛾，能够显著抑制斜纹夜蛾的生长发育和生殖，为绿色防治该害虫提供了一 个新的思路和技术。
[0011]
【具体实施方式】： 本实施例的利用SPR基因 dsRNA抑制斜纹夜蛾生长发育和生殖的方法同
【发明内容】
部分 所述。
[0012] 下面通过实施例对本发明作详细的描述，具体步骤如下： (一) 、人工饲料配制所用原料来源：
(二) 、饲料配制 取玉米粉100g，黄豆粉100g，胡萝卜粉50g，酵母粉30g，干酪素20g，蔗糖20g，琼脂 粉20g，水1000ml，混匀，置于蒸锅内蒸lh。