一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米复合物及其制备和应用领域，特别涉及一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]RNA干扰(RNAi)是指由与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)弓丨发而导致特异性基因转录后出现基因沉默的现象。在细胞内，dsRNA特异性的核酸酶将其裂解成不超过21-25个核苷酸的小干扰RNA(s iRNA)，随后介导特异性的mRNA发生降解，导致相应基因表达被阻断而引起基因沉默。该技术已被广泛应用于基因治疗的研究中。
[0003]基因治疗作为一种现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术，是通过将外源正常基因导入靶细胞内，用以纠正或补偿基因缺失或异常引起的疾病，从而进行疾病治疗。然而，目前基因治疗最主要的障碍就是缺乏一种安全有效的载体。在基因载体系统中，主要借助病毒和非病毒载体将外源基因导入靶细胞。病毒载体转染效率高，但临床应用的安全隐患制约了其进一步的应用。而非病毒载体，由于其低细胞毒性、无免疫原性、易操作和高基因装载量等特点，越来越受到研究者们的关注。
[0004]非病毒载体中，聚酰胺胺树状大分子(PAMAM)是目前研究最深入的树状大分子之一，它独特的高度支化三维立体结构令其成为一种新型的高分子载体被广泛应用于基因传递中。研究表明，PAMAM的基因转染效率和细胞毒性会随着其代数的增加而增加。而第五代(G5)PAMAM虽然有一定的毒性，但可以通过内部包裹纳米金颗粒[Shan,Y.，Luo，T.，et al.，Gene delivery using dendrimer-entrapped gold nanoparticles as nonviralvectors[J].B1materials,2012,33(10):p.3025-3035]或进行表面修饰[史向阳，侯文秀，郭睿，孔令丹.包裹纳米金颗粒的PEG功能化的PAMAM树状大分子载体的基因转染方法[P].中国专利:201310728846.2，2014-04-09]等手段降低其细胞毒性并增强转染能力。
[0005]Wang等[Wang，H.，N.Shao，et al.,Host-guest chemistry of dendrimer-cyclodextrin conjugates: Selective encapsulat1ns of guests within dendrimeror cyclodextrin cavities revealed by NOE NMR techniques[J].J Phys Chem B,2012，116 (36): p.11217-11224.]证明，将环糊精分子共价连接到G5PAMAM表面，可以增强G5PAMAM的水溶性及细胞摄入率。检索国内外相关文献和专利结果表明:以β-CD修饰的树状大分子及其纳米金颗粒为载体，负载siRNA用于恶性胶质瘤细胞(U87MG)基因转染的方法，尚未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种β_环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物及其制备和应用，本发明制备过程简单，实验条件温和，易操作;本发明所得复合物具有较好的生物相容性及基因转染效率。
[0007]本发明的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物，所述复合物为β-环糊精β-CD与第五代聚酰胺-胺树状大分子表面氨基基团共价结合并负载金纳米颗粒。
[0008]本发明的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方法，包括:
[0009](I)分别将Ν，Ν’ -羰基二咪唑⑶I和β-环糊精β-⑶溶解于溶剂中，混匀4_6h，得到混合液，然后向混合液中逐滴加入第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液，继续室温搅拌1-3天，经透析，冷冻干燥，得到白色粉末G5.NH2KD;其中⑶I与β-⑶的摩尔比为5:1?10:1，β-CD与G5.NH2的摩尔比为25: I ；
[0010](2)在剧烈搅拌条件下，将G5.ΝΗ2-β_⑶的水溶液中逐滴加入氯金酸水溶液，反应20-30min，然后迅速加入硼氢化钠NaBH4的冰水溶液，继续反应2_4h，透析，冷冻干燥，得到
环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物Au DENPs-P-CD;其中G5.NH2与HAuCl4.4H20的摩尔比为 1:25，HAuC14.4H20与NaBH4的摩尔比为1:5?1:10。
[0011 ] 步骤(I)中溶液的溶剂均为二甲基亚砜DMS0。
[0012]步骤(I)中N，N’ -羰基二咪唑⑶I溶解于溶剂中的浓度为111.36ymol/mL，β-环糊精β-⑶溶解于溶剂中的浓度为11.14ymol/mL；(不是在混合液中的浓度，是溶解于DMSO溶剂中的浓度)
[0013]第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液的浓度为0.44ym0l/mL;第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液的溶剂为二甲基亚砜DMSO。
[O 014 ] 步骤(2)中氯金酸水溶液的浓度为3 O m g / m L;硼氢化钠N a B H 4的冰水溶液浓度为lOmg/mL。
[OO15 ]步骤(2)中溶液的溶剂均为超纯水。
[0016]步骤(I)、(2)中透析均为:使用的透析袋截留分子量为8000-14000 ；用I3BS缓冲溶液透析I天后更换超纯水透析2天，每天3次，每次2L。
[0017]本发明的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的应用，β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物Au DENPS-β-CD作为非病毒载体负载SiRNA进行基因转染的应用。
[0018]Au DENPs-β-⑶作为载体应用于恶性胶质瘤细胞U87MG基因转染，具体为:按照不同Ν/Ρ比，取无菌水分别稀释Au DENPs-f3-CD及siRNA，而后均匀混合，于37°C条件孵育15-30min，得到不同N/P比的Au DENPs-0-CD/siRNA复合物；将U87MG细胞于37 °C、5 %⑶2培养24h，更换无血清的DMEM培养基，加入不同N/P比的Au DENPs-f3_CD/siRNA复合物溶液，37°C培养4h进行基因转染;其中N/P比为第五代聚酰胺-胺树状大分子的表面氨基基团与siRNA骨架上磷酸基团摩尔比。
[0019]所述siRNA为B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)siRNA或血管内皮生长因子VEGF siRNA。
[0020]不同N/P比分别为2.5:1、5:1和10:1。
[0021]本发明将β-CD与G5PAMAM表面氨基基团共价结合，可以通过中和其部分表面氨基以降低材料的细胞毒性，并提高材料的生物相容性。
[0022]本发明将HAuCU.4H20加入到含G5PAMAM的溶液中，快速搅拌使HAuCU.4H20与G5PAMAM充分混合，后快速加入NaBH4还原得到纳米金颗粒，避免了纳米金颗粒的聚集。
[0023]本发明以β-CD修饰聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒复合物为载体，分别负载B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)siRNA及血管内皮生长因子(VEGF)siRNA并转染U87MG细胞。本发明通过凝胶阻滞实验对载体与siRNA形成复合物的能力进行表征;通过水动力学粒径与表面电势对载体/siRNA复合物的粒径和电势进行了分析;通过MTT法测试载体/siRNA复合物对细胞的毒性;通过流式细胞仪测定载体/siRNA复合物的细胞摄入率;通过激光共聚焦显微镜检测载体/s iRNA复合物在细胞内的运输途径;通过蛋白质印迹法研究载体对siRNA的基因传递能力。
[0024]有益效果
[0025](I)本发明制备过程简单，实验条件温和，易操作；
[0026](2)本发明制备的β-CD修饰的聚酰胺-胺树状大分子及其纳米金颗粒复合物具有良好的基因转染效果；
[0027](3)本发明的材料转染过程易于操作，生物相容性好，在基因治疗等生物医学方面具有良好的应用潜力。
【附图说明】
[0028]图1为实施例2中的载体/Bel_2s iRNA复合物的凝胶阻滞实验