运载Bcl-2siRNA的能力要略强于运载VEGF siRNA的能力，Q0、Ql和Q2都显示出了良好的细胞内吞效率，细胞内吞能力从小到大分别是Q0、Q1和Q2。
[0051 ] 实施例6
[0052]以恶性胶质瘤细胞(U87MG)为模型细胞来检验G5PAMAM、对比例I制备得到的AuDENPs和实施例1的方法制备得到的Au DENPs-P-CD(分别标记为QO、Ql和Q2)的基因传递途径。爬片之前，将已清洁灭菌的盖玻片置于24孔内，用ImL DMEM培养基浸润过夜。而后细胞的培养方法和复合物的制备方法如实施例5所示，按照每孔IyL 073-&1?^4/?比5:1制备10yL载体/Cy3-siRNA复合物加入细胞中转染4h。转染结束后，将培养基和材料弃去，并用PBS清洗1-2遍以除去残留物质。以300μ!7孔的量加入2.5%戊二醛，将细胞于4°C下固定15min。弃去戊二醛，用PBS洗1-2遍，然后加300yL已稀释的lyg/mL Hoescht 33342覆盖细胞，37°C下静置染色30min。将Hoescht 33342液弃去并用I3BS清洗，最后在载玻片上滴加一滴荧光封闭剂，盖玻片有细胞的一面压到载玻片上，直接在激光共聚焦显微镜下观察拍摄。附图7和8分别为各载体/Cy3-Bcl-2siRNA和各载体/Cy3-VEGF siRNA复合物在U87MG细胞内胞内定位情况，结果表明各载体/Cy3-siRNA复合物经过与细胞4h的转染之后，都能够成功转运至细胞质内与细胞核的周围，胞内的传递途径基本相似，并且相同转染时间条件下，QO、Ql和Q2的转染效率从低到高。这说明了实验过程中对G5PAMAM进行的例如表面修饰β-CD及内部包裹纳米金颗粒等不仅没有影响其基本的生物学特征，还能提高其基因转染效率。
[0053]实施例7
[0054 ] 以恶性胶质瘤细胞(U8 7MG)为模型细胞来检验G 5 PAMAM、对比例I制备得到的AuDENPs和实施例1的方法制备得到的Au DENPs-P-CD(分别标记为Q0、Q1和Q2)的基因转染效率。细胞的培养方法和复合物的制备方法如实施例5所示，按照每孔IyL siRNA，N/P比5:1制备10yL载体/siRNA复合物加入细胞中转染4h。转染结束后，更换含有FBS的新鲜DMEM培养基继续培养48h。将细胞在冰上进行裂解，并于4°C12000rpm离心5min，收集上清蛋白溶液。随后依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应、ECL化学发光显影及定影等实验，并对凝胶图像进行分析。实验结果显示(附图9和10)，对载体/siRNA复合物而言，裸SiRNA几乎没有显示出基因沉默的现象。而无论是对Bcl-2siRNA或者VEGF siRNA而言，Q2相较QO和Ql材料均显示出了显著的基因沉默现象，符合之前各项实验的结果。经过以上实验，结果证明Q2材料具有优秀的基因转染能力，在合适的N/P比条件下能在U87MG细胞中显示出优秀的抗癌活性。
[0055]对比例I
[0056]称取20mg的第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5PAMAM)溶解于5mL超纯水中，在剧烈搅拌下逐滴加入300yL 30mg/mL氯金酸水溶液(HAuCl4.4H20)，持续搅拌30min后，快速加入350yL 10mg/mL超纯水中的硼氢化钠(NaBH4)冰水溶液继续反应4h。最后将反应溶液转移至截留分子量为8000-14000Da的透析袋中在超纯水中透析3天以去除多余的反应物，冷冻干燥得到没有经过⑶修饰的最终产物Au DENPs。
【主权项】
1.一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物，其特征在于:所述复合物为β-环糊精β-CD与第五代聚酰胺-胺树状大分子表面氨基基团共价结合并负载金纳米颗粒。2.—种如权利要求1所述的β_环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方法，包括: (1)分别将N，N’-羰基二咪唑⑶1、β_环糊精β_⑶溶解于溶剂中后，混匀4-6h，得到混合液，然后向混合液中逐滴加入第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液，继续室温搅拌1-3天，经透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-P-CD ；其中CDI与β-CD的摩尔比为5:1-10:1, β-CD与G5.NH2的摩尔比为25:1; (2)在搅拌条件下，将G5.NH2-f3-⑶的水溶液中逐滴加入氯金酸水溶液，反应20-30min，然后加入硼氢化钠NaBH4的冰水溶液，继续反应2-4h，透析，冷冻干燥，得到β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物Au DENPs-β-⑶;其中G5.NH2与HAuCl4.4H20的摩尔比:25,HAuCl4.4出0与恥8!14的摩尔比为1:5?1:10。3.根据权利要求2所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方法，其特征在于:步骤(I)中的溶剂为二甲基亚砜DMSO。4.根据权利要求2所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方法，其特征在于:步骤(I)中N，N’ -羰基二咪唑⑶I溶解于溶剂后的浓度为111.36μmol/mL，i3-环糊精β-⑶溶解于溶剂后的浓度为11.Hymol/mL;第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液的浓度为0.44ymol/mL;第五代聚酰胺_胺树状大分子G5.NH2溶液的溶剂为二甲基亚讽DMSO。5.根据权利要求2所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方法，其特征在于:步骤(2)中氯金酸水溶液的浓度为30mg/mL;硼氢化钠NaBH4的冰水溶液浓度为10mg/mL。6.根据权利要求2所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方法，其特征在于:步骤(1)、(2)中透析均为:使用的透析袋截留分子量为8000-14000;用PBS缓冲溶液透析I天后更换超纯水透析2天，每天3次，每次2L。7.—种如权利要求1所述的β_环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的应用，其特征在于:环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物Au DENPS-13-CD作为非病毒载体负载siRNA进行基因转染的应用。8.根据权利要求7所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的应用，其特征在于:Au DENPs-f3-CD作为载体应用于恶性胶质瘤细胞U87MG基因转染，具体为:按照不同N/P比，取无菌水分别稀释Au DENPs-β-⑶及siRNA，而后均匀混合，于37°C条件孵育15-30min，得到不同N/P比的Au DENPsKD/siRNA复合物；将U87MG细胞于37 °C、5 %CO2培养24h，更换无血清的DMEM培养基，加入不同N/P比的AuDENPs-f3-CD/siRNA复合物溶液，37°C培养4h;其中N/P比为第五代聚酰胺-胺树状大分子的表面氨基基团与siRNA骨架上磷酸基团摩尔比。9.根据权利要求8所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的应用，其特征在于:所述siRNA为B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2) siRNA或血管内皮生长因子VEGFsiRNA。10.根据权利要求8所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的应用，其特征在于:不同N/P比分别为2.5:1、5:1和10:1。
【专利摘要】本发明涉及一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物及其制备和应用，复合物为β-环糊精β-CD与第五代聚酰胺-胺树状大分子表面氨基基团共价结合并负载金纳米颗粒。将制备的G5.NH2-β-CD的水溶液中逐滴加入氯金酸水溶液，反应，然后加入硼氢化钠NaBH4的冰水溶液，继续反应，透析，冷冻干燥，即得。复合物Au？DENPs-β-CD作为非病毒载体负载siRNA进行基因转染的应用。本发明转染过程易于操作，生物相容性好，转染效率高，生物医学方面具有良好的应用潜力。
【IPC分类】C08G83/00, C08L87/00, C08K3/08, C08B37/16, C12N15/87, C08G81/00
【公开号】CN105670303
【申请号】CN201610109012
【发明人】史向阳, 邱洁茹, 孔令丹, 李爱军, 曹雪雁
【申请人】东华大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月26日