一种利用siRNA以植物为发生器的生物农药的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种利用siRNA以植物为发生器的生物农药。
【背景技术】
[0002] 小干扰核糖核酸（siRNA)是一类由20多个核苷酸组成的双链RNA分子，可以通过 特异性降解革G基因的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA)起到沉默基因表达的作用，这一 过程被称为RNA干扰（RNA interference，RNAi)，在基因调控和生长发育等方面发挥着重 要作用。
[0003] RNA干扰（RNAi)是一种抗病毒机制。它是由dsRNA介导的序列特异性的同源基因 的转录后的基因沉默，在细胞内有效作用方式为siRNA。RNA干扰可以利用siRNA或siRNA 表达载体特异地沉默靶基因，此方式快速、经济、简便，且具有高度的序列专一性，可以获得 功能丧失或减低突变序列特异方式剔除目的基因表达，成为探索基因功能的重要研究手 段。大量实验证明，RNAi现象广泛存在于生物界中，是生物抵御病毒侵染和阻断转座子的 古老防御机制之一。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能 基因组和基因治疗研究中的有效工具，RNAi也越来越为人们所重视。有研究表明，siRNA可 以成功敲出棉铃虫、小菜蛾和豌豆芽的部分抗药基因，并且可以通过敲出昆虫的乙酰胆碱 酯酶起到防止虫害的作用，从而在害虫防治中的起到与农药相当的作用。
[0004] 目前，市场上的农药根据原料来源可分为有机农药、无机农药、植物性农药、微生 物农药。此外，还有昆虫激素。根据加工剂型可分为粉剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、乳剂、 乳油、浓乳剂、乳膏、糊剂、胶体剂、熏烟剂、熏蒸剂、烟雾剂、油剂、颗粒剂和微粒剂等。大多 数是液体或固体，少数是气体。农药流失到环境中，将造成严重的环境污染，有时甚至造成 极其危险的后果。
[0005] 传统农药会有以下缺点：1.污染大气、水环境，造成土壤板结。2.增强病菌、害虫 对农药的抗药性3.杀伤有益生物4.野生生物和畜禽中毒5.对人体健康的危害。为克服 上述缺点，高效、低毒、低残留是农药产业的发展方向。
[0006] 虽然研究人员针对RNA干扰用于防治虫害已有初步研究，但目前该技术仍有一些 难以解决的问题限制其商业化发展。其中，如何递送siRNA、如何对害虫进行大面积扑杀是 妨碍其应用的主要原因。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种用于制备生物农药的siRNA 表达载体和含有该载体的细胞。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种生物农药。
[0009] 本发明的又一目的是提供该生物农药的制备方法。
[0010] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0011] -种生物农药，所述的生物农药以表达针对害虫生命代谢关键基因的siRNA的植 物为原料。本发明中所述的siRNA是由转基因植物所表达，被害虫接触或取食后会通过 RNAi机制沉默其靶向的害虫生命代谢关键基因。
[0012] 其中，"生命代谢关键基因"是指在害虫生命代谢中起重要作用的基因，本发明生 物农药以表达针对害虫生命代谢关键基因的siRNA的植物为原料。可用于本发明的针对害 虫生命代谢关键基因没有特别限制，通常包括消化系统及神经系统特异性毒害基因、经过 表型筛选的影响昆虫生长发育基因如昆虫几丁质合成酶基因、蜕皮激素受体基因、谷胱甘 肽-s-转移酶基因等。
[0013] 针对害虫生命代谢关键基因包括鳞翅目、双翅目或半翅目害虫的乙酰胆碱酯酶基 因、AV2基因、GPCR基因、V-ATPase基因、Cathespin基因、IAP基因、APN基因，更优选地，在 一实施例中包含针对害虫生命代谢关键基因包括优选鳞翅目、双翅目或半翅目害虫的乙酰 胆碱酯酶基因。
[0014] 所述的生物农药，优选通过基因工程手段构建表达高靶向害虫生命代谢关键基因 的siRNA的转基因植物，种植此种转基因植物，将转基因植物或其提取物用于制造生物农 药。
[0015] 所述的生物农药，进一步优选将所述的转基因植物的叶片或其他器官制备成粉剂 作为生物农药；或者提取转基因植物中所述的SiRNA表达产物作为生物农药。
[0016] 在本发明中，可通过本领域常规技术手段将外源siRNA导入到载体，并在转基因 植物中表达。可用于本发明的植物种类没有特别限制，通常包括禾本科、香蒲科、菊科、唇 形科、百合科、石蒜科、紫草科、天南星科、伞形科、十字花科、报春花科、寥科、藜科、石竹科、 柳叶菜科、荨麻科、车前草科、杨梅科、桑科、大麻科、虎耳草科、豆科、蕨科、堇菜科、银齿莴 苣科、苋科、壳斗科、小球藻科、茶科、茜草科、梧桐科、松科、萌芦科、大风子科、罗汉松科、桦 木科、胡桃科、胡椒科、木兰科、齿菌科、木耳科、口蘑科、伞菌科、红燕科、杜鹊花科、蔷薇科、 猕猴桃科、番杏科、葡萄科、番荔枝科、秋海棠科、凤梨科、白花菜科、银杏科、八角茴香科、姜 科、石榴科、毛茛科、夹竹桃科、小檗科、芸香科、茄科、罂粟科、马鞭草科、鹿蹄草科、鸭跖草 科、瑞香科、桑寄生科、萝蘑科、三白草科、景天科、鳞始蕨科、马齿苋科、泽泻科、锦葵科、玄 参科、紫葳科、防已科、海金沙科、爵床科、旋花科、多孔菌科、无患子科、柏科、苦木科、大戟 科、楝科、使君子科、忍冬科、柽柳科、列当科、灯心草科、金缕梅科、龙胆科、椴树科、菖蒲科、 冬青科、车前科、漆树科、五味子科、五加科、木棉科、马兜铃科、木犀科、棕榈科、睡莲科、檀 香科植物中的一种、或几种的组合。
[0017] 优选地，转基因植物包括为生菜、水稻、小麦、玉米、花生、高粱、大豆、马铃薯、荞 麦、藜、蓟、胡椒、八角、茴香、桃、杏、梨、苹果、香蕉、猴头、木耳、山药、山楂、人参、当归、番 茄、辣椒、茄子、胡萝卜、甘蓝、花椰菜、大白菜、小白菜、油菜、菠菜、芥菜、豌豆、南瓜、黄瓜、 西瓜、甜瓜、石刁柏、洋葱、或其组合。
[0018] 更优选地，转基因植物包括生菜、苜蓿、黑麦草、大豆或水稻。
[0019] 所述的生物农药，也可优选将所述siRNA在同一株植物中与至少一种不同于该 siRNA革E1标基因表达广物的第二种杀虫蛋白质一起表达或者在不同的植物中进彳丁表达后混 合作为生物农药的原料。
[0020] 其中，所述第二种杀虫蛋白质为Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀 粉酶或过氧化物酶。
[0021] 所述siRNA在同一株植物中与至少一种不同于该siRNA靶标基因表达产物的第二 种杀虫蛋白质一起表达通过遗传工程使植物包含并表达siRNA以及第二种杀虫蛋白质来 实现；或者通过利用遗传工程操作使第1亲本植物表达siRNA和第2亲本植物表达第二种 杀虫蛋白质，再将第I亲本和第2亲本杂交获得表达引入第I亲本和第2亲本的所有基因 的后代植物。
[0022] -种用于制备生物农药的siRNA表达载体，将针对害虫生命代谢关键基因的 siRNA的模板序列插入双元表达载体所得；所述的针对害虫生命代谢关键基因选自对害虫 消化系统或神经系统具有特异性毒害的基因、或经过表型筛选的影响昆虫生长发育的基 因；优选鳞翅目、双翅目或半翅目害虫的乙酰胆碱酯酶基因、AV2基因、GPCR基因、V-ATPase 基因、Cathespin基因、IAP基因、APN基因，优选鳞翅目、双翅目或半翅目害虫的乙酰胆 碱酯酶基因；所述的双元表达载体选自pcambial301，pcambial300，pcambia2300或选自 pcambia系列的其他载体。本发明所用双元表达载体优选地为pCAMBIA2301 (购自北京鼎国 昌盛生物技术有限责任公司）
[0023] 所述的制备生物农药的siRNA表达载体，优选将针对SEQ ID NO. 1所示的乙 酰胆碱酯酶靶基因设计的SEQ ID N0. 19所示的siRNA的模板序列插入双元表达载体 PCAMBIA2301 所得。
[0024] 含有本发明所述的siRNA表达载体的细胞。
[0025] 本发明所述的siRNA表达载体、所述的含有所述siRNA表达载体的细胞在制备生 物农药中的应用。
[0026] -种用于控制害虫的方法，使侵袭这种植物的害虫与所述的生物农药或含有所述 的生物农药的组合物接触，从而控制害虫对这种植物的侵袭。
[0027] 术语"RNA干扰（RNA interference, RNAi) "是指一些RNA可以高效、特异地阻断 体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA 干预或者干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。
[0028] 术语"干扰RNA"或"dsRNA"是指一种RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为其 目标降解特定的mRNA,这个过程就是RNA干扰途径（RNAinterferencepathway)。
[0029] 有益效果：
[0030] 本发明针对设计特意靶向害虫生命代谢关键基因的siRNA，并创造性地将植物作 为siRNA载体生产生物农药。通过将高靶向害虫的siRNA模板序列转入植物中，使植物表达 相应的目标siRNA，大面积种植此种转基因植物，将其提取物用于制造生物农药，此种农药 对环境无危害、从基因层面上杀灭害虫，阻碍害虫发育，杀死效率高，不容易造成害虫抗性。
[0031] 作为本发明的一种优选方式，针对乙酰胆碱酯酶基因设计并筛选了多条可以靶向 性杀死害虫的siRNA序列，将其导入植物进行表达，粉碎后作为生物农药使用，对鳞翅目昆 虫具有理想的致死作用。
【附图说明】
[0032] 图1载体构建流程图。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1:构建在植物中稳定表达外源siRNA的质粒载体的方法
[0034] 本实施例提供了目的基因的筛选、获得及构建含有目的基因核酸构载体的具体方 法。通过筛选，获得多条可以靶向性杀死害虫的siRNA序列。
[0035] 以下为靶基因及相应siRNA序列：
[0054] 各小干扰RNA杀虫原理：
[0055] 小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因：用于产生dsRNA的靶标序列是以小菜蛾乙酰胆碱酯酶 基因，siRNA可以沉默乙酰胆碱酯酶基因1和2,从而影响昆虫正常的神经冲动传递，使昆虫 持续处于兴奋状态而死亡，进而实现了对昆虫的治理。
[0056] 蚜虫AV2基因：用于产生dsRNA的靶标序列是从棉蚜中分离的V-型质子栗ATPase 的A亚基基因的同源片段。但靶标序列可以不限于该基因以及棉蚜。本发明载体中，dsRNA 的转录是由特异性启动子驱动的，使dsRNA主要在筛管中积累。其潜在的害虫防治对象为 用刺吸式口器取食的蚜虫、粉虱、介壳