A重组表达载体的共3个株系（S1、S2和S3)，经Taqman 鉴定为非转基因的共2个株系（S4和S5)，I个野生型株系（CK);从每个株系选5株进行测 试，每株重复5次。具体结果见表5。
[0206] 表5.转siRNA杂草对蚜虫生测实验结果
[0209] 由表5可以看出，转基因基因工程植物组（Sl，S2, S3)喂食靶标害虫后，相对于 非转基因组（S4, S5)及野生型植物组（CK)蚜虫致死率明显增高。转基因组平均致死率为 73. 86%，非转基因组植物平均致死率为16.88%，CK组致死率为9%，通过数据可以看出， 转基因组平均致死率相较于非转基因植物组提高了 56. 98%，相较于CK组提高了 67. 86%， 以上数据证明本发明siRNA重组表达载体可以成功转入植物形成基因工程植物，并表达针 对靶序列的siRNA对靶基因进行沉默；发明提供的基因工程植物可以对蚜虫有明显的杀死 作用。
[0210] 实施例8 :粉剂基因工程植物对蚜总科昆虫致死作用
[0211] 将取实施例3中所获得的含有pEASY-3M-03的转基因黑麦草研磨成粉剂；蚜虫30 头分成两组：实验组与对照组各15头，每组15头分三组对照，实验组（Sl，S2, S3)定时喂 食转基因植物粉剂，连续喂食两周，对照组（CK1，CK2, CK3)定时喂食非转基因杂草粉剂，连 续喂食两周，记录蚜虫生理生化变化及计算实验组、对照组中蚜虫的平均死亡率。具体结果 见表6。
[0212] 表6.粉剂基因工程植物对蚜虫致死率
[0213]
[0214] 由表6可以看出，基因工程植物组（Sl，S2, S3)粉剂对靶标昆虫有较高杀伤率，平 均杀伤率可以达到76. 7% ;对照组（CK1，CK2, CK3)昆虫平均死亡率为16. 7%，转基因工程 植物粉剂相较于对照组对昆虫的死亡率提高了 50%，通过本实施例可以看出将转基因工程 植物研磨成粉末制成生物农药不会影响其对蚜虫的致死效果，从另一角度说明了利用转基 因工程植物用作生物农药的可行性。
[0215] 实施例9 :双翅目昆虫摄食基因工程植株后的生理状况变化
[0216] 双翅目（Diptera)是昆虫第四大纲，目前有4000多种。双翅目某些类群如种蝇、 叶潜蝇、果实蝇、麦癭蚊等的幼虫，都是农业的重要害虫。花蝇科球果花蝇属的幼虫为害松 柏球果，严重影响中国北方地区的造林工作；泉蝇属为害竹笋、菠菜、甜菜等蔬菜作物；蝇 科芒蝇属为害稻、粟；潜蝇科为害多种豆科植物；实蝇科的许多种类为害柑橘、梨、桃等。本 实施例针对双翅目黑腹果蝇进行实验设计及验证。
[0217] 具体实施步骤如下：分别取实施例3中所获得的含有pEASY-3M-04的转基因黑 麦草、野生型杂草植株和经Taqman鉴定为非转基因的杂草植株的新鲜叶片，用无菌水冲 洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，去除叶脉，研磨成粉末状，与昆虫饵料搅拌均匀，定时 饲喂革E标昆虫。每个培养皿中放10头人工饲养的革E标昆虫，虫试培养皿加盖后，在温度 26-28Γ、相对湿度70% -80%、光周期（光/暗）16:8的条件下放置3天后统计幼虫死亡 情况，计算各样品中害虫的平均死亡率。转入siRNA重组表达载体的共3个株系（S1、S2和 S3)，经Taqman鉴定为非转基因的共2个株系（S4和S5)，I个野生型株系（CK);从每个株 系选5株进行测试，每株重复5次。具体结果见表7。
[0218] 表7.转siRNA杂草对黑腹果蝇生测实验结果
[0219]
[0220] 由表7可以看出，转基因基因工程植物组（S1，S2, S3)喂食靶标害虫后，相对于非 转基因组（S4，S5)及野生型植物组（CK)黑腹果蝇致死率明显增高。转基因组平均致死率为 82. 8%，非转基因组植物平均致死率为21. 5%，CK组致死率为9. 4%，通过数据可以看出， 转基因组平均致死率相较于非转基因植物组提高了 61. 3%，相较于CK组提高了 73. 4%，以 上数据证明本发明所获得的转基因黑麦草能成功表达所述的siRNA序列对靶基因进行沉 默；发明提供的基因工程植物可以对黑腹果蝇有明显的杀死作用。
[0221] 实施例10 :粉剂基因工程植物对双翅目昆虫致死作用
[0222] 将实施例3中所获得的含pEASY-3M-04的转基因黑麦草研磨成粉剂；黑腹果蝇30 头分成两组：实验组与对照组各15头，每组15头分三组对照，实验组（Sl，S2, S3)定时喂 食转基因植物粉剂，连续喂食两周，对照组（CK1，CK2, CK3)定时喂食非转基因杂草粉剂，连 续喂食两周，记录黑腹果蝇生理生化变化及计算实验组、对照组中黑腹果蝇的平均死亡率。 具体结果见表8。
[0223] 表8.粉剂基因工程植物对黑腹果蝇致死率
[0224]
[0225] 由表8可以看出，基因工程植物组（Sl，S2, S3)粉剂对靶标昆虫有较高杀伤率，平 均杀伤率可以达到80% ;对照组（CK1，CK2, CK3)昆虫平均死亡率为16. 7%，转基因工程植 物粉剂相较于对照组对昆虫的死亡率提高了 63. 3%，通过本实施例可以看出将转基因工程 植物研磨成粉末制成生物农药不会影响其对黑腹果蝇的致死效果，从另一角度说明了利用 转基因工程植物用作生物农药的可行性。
【主权项】
1. 一种生物农药，其特征在于所述的生物农药以表达针对害虫生命代谢关键基因的 siRNA的植物为原料。2. 根据权利要求1所述的生物农药，其特征在于所述的针对害虫生命代谢关键基因选 自对害虫消化系统或神经系统具有特异性毒害的基因、或经过表型筛选的影响昆虫生长发 育的基因。3. 根据权利要求1所述的生物农药，其特征在于所述的针对害虫生命代谢关键基因选 自鳞翅目、双翅目或半翅目害虫的乙酰胆碱酯酶基因、AV2基因、GPCR基因、V-ATPase基因、 Cathespin基因、IAP基因、APN基因，优选鳞翅目、双翅目或半翅目害虫的乙酰胆碱酯酶基 因。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的生物农药，其特征在于通过基因工程手段构建 表达高靶向害虫生命代谢关键基因的siRNA的转基因植物，种植此种转基因植物，将转基 因植物或其提取物用于制造生物农药。5. 根据权利要求4所述的生物农药，其特征在于将所述的转基因植物的叶片或其他 器官制备成粉剂作为生物农药；或者提取转基因植物中所述的siRNA表达产物作为生物农 药。6. 根据权利要求5所述的生物农药，其特征在于所述植物选自禾本科、香蒲科、菊科、 唇形科、百合科、石蒜科、紫草科、天南星科、伞形科、十字花科、报春花科、寥科、藜科、石竹 科、柳叶菜科、荨麻科、车前草科、杨梅科、桑科、大麻科、虎耳草科、豆科、蕨科、堇菜科、银齿 莴苣科、苋科、壳斗科、小球藻科、茶科、茜草科、梧桐科、松科、萌芦科、大风子科、罗汉松科、 桦木科、胡桃科、胡椒科、木兰科、齿菌科、木耳科、口蘑科、伞菌科、红菇科、杜鹃花科、蔷薇 科、猕猴桃科、番杏科、葡萄科、番荔枝科、秋海棠科、凤梨科、白花菜科、银杏科、八角茴香 科、姜科、石植科、毛茛科、夹竹桃科、小檗科、芸香科、前科、罂粟科、马鞭草科、鹿蹄草科、鸭 跖草科、瑞香科、桑寄生科、萝蘑科、三白草科、景天科、鳞始蕨科、马齿苋科、泽泻科、锦葵 科、玄参科、紫葳科、防已科、海金沙科、爵床科、旋花科、多孔菌科、无患子科、柏科、苦木科、 大戟科、楝科、使君子科、忍冬科、柽柳科、列当科、灯心草科、金缕梅科、龙胆科、椴树科、菖 蒲科、冬青科、车前科、漆树科、五味子科、五加科、木棉科、马兜铃科、木犀科、棕榈科、睡莲 科、檀香科植物中的任意一种，或几种的组合。7. 根据权利要求1~3中任一项所述的生物农药，其特征在于将所述siRNA在同一株 植物中与至少一种不同于该siRNA靶标基因表达产物的第二种杀虫蛋白质一起表达或者 在不同的植物中进行表达后混合作为生物农药的原料。8. 根据权利要求7所述的生物农药，其特征在于所述第二种杀虫蛋白质选自Vip类杀 虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素 、α -淀粉酶或过氧化物酶。9. 根据权利要求7所述的生物农药，其特征在于所述siRNA在同一株植物中与至少一 种不同于该siRNA靶标基因表达产物的第二种杀虫蛋白质一起表达通过遗传工程使植物 包含并表达siRNA以及第二种杀虫蛋白质来实现；或者通过利用遗传工程操作使第1亲本 植物表达siRNA和第2亲本植物表达第二种杀虫蛋白质，再将第I亲本和第2亲本杂交获 得表达引入第I亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。10. -种用于制备生物农药的siRNA表达载体，其特征在于将针对害虫生命代谢关键 基因的siRNA的模板序列插入双元表达载体所得；所述的针对害虫生命代谢关键基因选 自对害虫消化系统或神经系统具有特异性毒害的基因、或经过表型筛选的影响昆虫生长发 育的基因；优选鳞翅目、双翅目或半翅目害虫的乙酰胆碱酯酶基因、AV2基因、GPCR基因、 V-ATPase基因、Cathespin基因、IAP基因、APN基因，优选鳞翅目、双翅目或半翅目害虫的 乙酰胆碱酯酶基因。11. 根据权利要求10所述的siRNA表达载体，其特征在于将针对SEQ ID NO. 1所示的 乙酰胆碱酯酶靶基因设计的SEQ ID NO. 19所示的siRNA的模板序列插入双元表达载体所 得。12. 含有权利要求10或11所述的siRNA表达载体的细胞。13. 权利要求10或11所述的siRNA表达载体、权利要求12所述的细胞在制备生物农 药中的应用。14. 一种用于控制害虫的方法，其特征在于使侵袭这种植物的害虫与权利要求1所述 的生物农药或含有权利要求1所述的生物农药的组合物接触或用权利要求1所述的生物农 药饲喂对应的害虫，从而控制害虫对这种植物的侵袭。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，涉及一种利用siRNA以植物为发生器的生物农药。所述的生物农药以表达针对害虫生命代谢关键基因的siRNA的植物为原料。本发明中所述的siRNA是由转基因植物所表达，被害虫接触或取食后会通过RNAi机制沉默其靶向的害虫生命代谢关键基因。本发明针对设计特异靶向害虫生命代谢关键基因的siRNA，并创造性地将植物作为siRNA载体生产生物农药。通过将高靶向害虫的siRNA模板序列转入植物中，使植物表达相应的目标siRNA，大面积种植此种转基因植物，将其提取物用于制造生物农药，此种农药对环境无危害、从基因层面上杀灭害虫，阻碍害虫发育，杀死效率高，不容易造成害虫抗性。
【IPC分类】A01P7/04, C12N5/10, A01N57/16, C12N15/84
【公开号】CN105613568
【申请号】CN201410605894
【发明人】张辰宇, 洪治, 曾科
【申请人】江苏命码生物科技有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月30日