粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物 的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
[0156] 2.电穿孔法
[0157] 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电 场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和 场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤 害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
[0158] 3. DEAE-葡聚糖和polybrene多聚体复合物
[0159] 带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。通过使用DMS0或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试 剂都已成功用于转染。
[0160] 4.阳离子脂质体试剂
[0161] 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的单层脂质体。 这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。 使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带 正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。
[0162] 在完成构建后，为确认转化植株构建是否成功，进行了如下工作，见实施例4。
[0163] 实施例3外源siRNA表达载体转化禾本科黑麦草
[0164] 转化植株采用的是农杆菌诱导法。
[0165] 按照常规采用的农杆菌浸染法，将无菌培养的黑麦草幼胚与实施例2中所述重组 农杆菌共培养，以将实施例1中构建的重组表达载体中的T-DNA分别转入到黑麦草染色体 中，获得了转入外源siRNA的黑麦草植株（正对照）；同时以野生型黑麦草作为负对照。
[0166] 对于农杆菌介导的黑麦草转化，简要地，从黑麦草中分离未成熟的幼胚，用农杆 菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞，所述 核酸构建体可操作地与黑麦草基因组相连接。在此步骤中，幼胚优选的浸入农杆菌悬浮液 (0D600 = 0. 4-0. 6,浸染培养基）。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择性的固体培养基上 培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。之后，经过选择利用选择培养基筛选出转基 因黑麦草愈伤组织。然后，愈伤组织再形成植物。
[0167] 最终获得6种转基因黑麦草，分别整合了以下六种重组质粒：pEASY-3M-01 (含 小菜蛾siRNA)、pEASY-3M-02(含亚洲玉米螟靶基因 siRNA)、pEASY-3M-03(含蚜虫靶基 因 siRNA)、pEASY-3M-04(含黑腹果蝇靶基因 siRNA)、pEASY-3M-05(含豆荚草盲蝽靶基因 siRNA)、pEASY-3M-06 (含二点委夜蛾基因 siRNA)。
[0168] 实施例4外源siRNA在转化植株中的检测实验
[0169] 利用Taqman法验证转基因黑麦草。具体操作步骤如下：
[0170] 取转入目标siRNA序列黑麦草、野生型黑麦草叶片各100mg，分别在研钵中用液氮 研磨成匀浆，每个样品取3个重复；
[0171] 用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，调整浓度至80- 100ng/ul ；
[0172] 采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，探针引物如下：
[0179] 以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，野生型作为负对照，每个样品取3个 重复，最终获得单拷贝转siRNA黑麦草。
[0180] 本实施例提供另一实现方式：
[0181] 1.提取待测植物的基因组DNA，采用CTAB等常规方法；
[0182] 2.以基因组DNA为模板进行多重PCR扩增；
[0183] 3. PCR产物的变、复性处理；
[0184] 4. PCR产物变、复性处理后的琼脂糖凝胶电泳检测；
[0185] 如果PCR产物经过变复性处理后，电泳条带比未经处理的迀移距离远，则表明经 过变复性处理后，PCR产物形成了发卡状的折叠结构，而发卡状结构是siRNA表达载体中为 形成基因沉默而设计的独特结构，据此可以推断此样品属于siRNA转基因植物；如果变复 性处理后，电泳条带迀移距离没有变化，则表明未形成新的折叠结构，可判断此样品不属于 转基因植物。经检测实施例2和3中构建的转基因生菜和转基因黑麦草均表达了目标外源 siRNA〇
[0186] 实施例5鳞翅目昆虫摄食基因工程植株后的生理状况变化
[0187] 鳞翅目（学名Lepidoptera)属有翅亚纲、全变态类。全世界已知约20万种，中国 已知约8000余种。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目。其中蛾类6000种，蝶类 2000种。同时也是农林害虫最多的一个目，如玉米螟、稻纵卷叶螟、小菜蛾等。本实施例针对 鳞翅目昆虫小菜蛾，亚洲玉米螟进行生测试验，以测定基因工程植株对靶标昆虫的杀死效 果。小菜蛾实验所用的转基因植株为实施例2所构建携带外源siRNA表达质粒pEASY-3M-01 的转基因生菜，亚洲玉米螟实验所用的转基因植株为实施例2所构建外源siRNA表达质粒 PEASY-3M-02转基因生菜。
[0188] 具体实施步骤如下：分别取已转入针对昆虫设计的siRNA重组表达载体的生菜叶 片、野生型生菜叶片和经Taqman鉴定为非转基因的生菜叶片，用无菌水冲洗干净并用纱布 将叶片上的水吸干，去除叶脉，研磨成粉末状，与昆虫饵料搅拌均匀，定时饲喂靶标昆虫。每 个培养皿中放10头人工饲养的靶标昆虫，虫试培养皿加盖后，在温度26-28°C、相对湿度 70% -80%、光周期（光/暗）16:8的条件下放置3天后统计幼虫死亡情况，计算各样品中 害虫的平均死亡率。转入siRNA重组表达载体的共3个株系（S1、S2和S3)，经Taqman鉴定 为非转基因的共2个株系（S4和S5)，I个野生型株系（CK);从每个株系选5株进行测试， 每株重复5次。具体结果见表1。
[0189] 表1.转siRNA生菜叶片对小菜蛾生测实验结果
[0190]
[0191] 由表1可以看出，转基因生菜叶片（Sl，S2, S3)喂食靶标害虫小菜蛾后，相对于非 转基因组（S4, S5)及野生型生菜组（CK)小菜蛾致死率明显增高。转基因组平均致死率为 79. 67%，非转基因组植物平均致死率为20. 5%，CK组致死率为8. 6%，通过数据可以看出， 转基因组平均致死率相较于非转基因植物组提高了 59. 17%，相较于CK组提高了 71. 09%， 以上数据证明实施例2所获得的转基因生菜能成功表达针对小菜蛾乙酰胆碱酯酶所述的 siRNA;发明提供的基因工程植物可以对小菜蛾有明显的杀死作用。
[0192] 表2.转siRNA生菜叶片对亚洲玉米螟生测实验结果
[0193]
[0194] 由表2可以看出，转基因基因工程植物组（Sl，S2, S3)喂食靶标害虫后，相对于 非转基因组（S4, S5)及野生型植物组（CK)亚洲玉米螟致死率明显增高。转基因组平均致 死率为79. 53 %，非转基因组植物平均致死率为20. 3 %，CK组致死率为9. 0 %，通过数据可 以看出，转基因组平均致死率相较于非转基因植物组提高了 59. 23%，相较于CK组提高了 70. 53%，以上数据证明实施例2所获得的转基因生菜能成功表达沉默所述的亚洲玉米螟 靶基因靶基因的siRNA ;发明提供的基因工程植物可以对亚洲玉米螟有明显的杀死作用。
[0195] 实施例6 :粉剂基因工程植物对鳞翅目昆虫致死作用
[0196] 取实施例3中所获得的含有pEASY-3M-01 (含小菜蛾siRNA)、pEASY-3M-06 (含二 点委夜蛾基因 siRNA)的转基因黑麦草分别研磨成粉剂；含有pEASY-3M-01的黑麦草粉剂喂 养小菜蛾，含有PEASY-3M-06的黑麦草粉剂喂养二点委夜蛾。每种昆虫30头分成两组：实 验组与对照组各15头，每组15头分三组对照，实验组（Sl，S2, S3)定时喂食转基因植物粉 剂，连续喂食两周，对照组（CK1，CK2, CK3)定时喂食非转基因黑麦草粉剂，连续喂食两周， 记录昆虫生理生化变化及计算实验组、对照组中害虫的平均死亡率。具体结果见表3。
[0197] 表3.粉剂基因工程植物对小菜蛾致死率
[0198]
[0199] 由表3可以看出，基因工程植物组（S1，S2，S3)粉剂对靶标昆虫小菜蛾有较高杀伤 率，平均杀伤率可以达到80% ;对照组（CK1，CK2, CK3)小菜蛾平均死亡率为6. 7%，转基因 工程植物粉剂相较于对照组对小菜蛾的死亡率提高了 73. 3%，通过本实施例可以看出将转 基因工程植物研磨成粉末制成生物农药不会影响其对靶标昆虫小菜蛾的致死效果，从另一 角度说明了利用转基因工程植物用作生物农药的可行性。
[0200] 表4.粉剂基因工程植物对二点委夜蛾致死率
[0201]
[0202] 由表4可以看出，基因工程植物组（Sl，S2, S3)粉剂对靶标昆虫二点委夜蛾有较 高杀伤率，平均杀伤率可以达到93. 3% ;对照组（CK1，CK2, CK3)二点委夜蛾平均死亡率为 16. 7%，转基因工程植物粉剂相较于对照组对二点委夜蛾的死亡率提高了 76. 6%，通过本 实施例可以看出将转基因工程植物研磨成粉末制成生物农药不会影响其对靶标昆虫的致 死效果，从另一角度说明了利用转基因工程植物用作生物农药的可行性。
[0203] 实施例7 j牙总科昆虫摄食基因工程植株后的生理状况变化
[0204] 姐总科昆虫隶属于同翅目Homoptera姐虫类Aphidinea，是同翅目中较大的一个 类群。食性杂、寄主范围广，是蔬菜生产十分重要的害虫，常年发生。它的身体虽然很小，但 对植物危害大。不但直接吸汁为害，影响产量降低品质，还诱发霉污病、传播病毒病等。它 们之中除五倍子蚜是益虫外，其余都可以说是毁灭性的害虫。本实施例针对蚜虫进行实验 设计及验证。
[0205] 具体实施步骤如下：取实施例3中所获得的含有pEASY-3M-03转基因黑麦草、野生 型杂草植株和经Taqman鉴定为非转基因的杂草植株的新鲜叶片，用无菌水冲洗干净并用 纱布将叶片上的水吸干，去除叶脉，研磨成粉末状，与昆虫饵料搅拌均匀，定时饲喂靶标昆 虫。每个培养皿中放10头人工饲养的革E标昆虫，虫试培养皿加盖后，在温度26_28°C、相对 湿度70 % -80 %、光周期（光/暗）16:8的条件下放置3天后统计幼虫死亡情况，计算各样 品中害虫的平均死亡率。转入siRN