水稻苗期冷诱导表达启动子POscold7的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 苗期冷诱导表达启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是全球重要的粮食作物之一，低温会引起水稻减产，世界水稻主产区普遍存 在的问题便是低温冷害的问题。在水稻发育的不同时期发生冷害均会对水稻造成不同程度 的损害。在苗期发生冷害会造成秧苗失绿、发僵、分蘖减少、枯萎等现象，严重时会发生死 苗；孕穗期发生冷害会使花药发育不完全，造成水稻减产；开花盛期发生冷害会导致水稻 不能正常散粉或花粉管的正常萌发受到影响，从而导致结实率下降。每年全球因低温伤害 造成的农作物损失高达数千亿美元，因此如何克服低温伤害，培育抗低温的基因工程作物 是作物分子设计育种的关键。
[0003] 植物中存在着一个复杂的低温胁迫信号应答网络系统。植物在受到低温胁迫后能 通过该系统进行一系列的基因遗传修饰，对自身的代谢和生长进行调节以适应该不利因素 对其造成的影响。利用这一应答网络中关键基因，可以有效提高植物对低温的耐受性。仲 康等（2007)将锌指蛋白类似蛋白OsCOIN基因在水稻中过量表达使转基因水稻中脯氨酸含 量升高，提高植物的耐冷性。张红生等（2009)将水稻锌指蛋白ZFP245基因在水稻中过量 表达，发现超量表达ZFP245基因水稻在冷胁近下使脯氨酸积累相关基因0sP5CS和脯氨酸 转运基因 OsProT基因的表达量提高，促使脯氨酸的量增加，增强植物的耐冷性。余淑美等 (2010)发现MYBS3超量表达水稻能在4°C下处理以后可以存活，且不影响其主要农艺性状。 另外，对一些包括DREB/CBF、NAC等转录因子的过量表达可以提高水稻的耐冷性。
[0004] 我国水稻资源丰富，从水稻中发掘、定位、克隆耐冷相关基因及其冷诱导启动子， 将对水稻耐冷品种的选育具有重要的理论及实际意义，在农业领域将具有广阔的应用和市 场前景。但是，目前即便在世界范围内，这样的可利用遗传资源也并不是很多。
【发明内容】
[0005] 因此，针对上述问题，本发明的目的是提供一种驱动外源基因在冷诱导条件下特 异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所 涉及的"植物"是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0006] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻苗期冷诱导表达启动子 P0scold7,其特征在于，包含：
[0007] (a) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；或者
[0008] (b)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0009] (C)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0010] (d) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者
[0011] (e)与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有启动子功 能的核苷酸序列；或者
[0012] (f)在严格条件下与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的 核苷酸序列；
[0013] (g) SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列；或者
[0014] (h)与SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的且具有启动子功 能的核苷酸序列；或者
[0015] (i)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0016] (j)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0017] (k)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具 有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0018] (1)在严格条件下与SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的 核苷酸序列。
[0019] 序列表中SEQ ID No: 1和2所示的DNA序列为从日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)扩增并提取出的水稻冷诱导强表达启动子，本文中称为P0scold7 或启动子P〇scold7。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的1985bp的DNA序列，具有驱动目标基因 在寒冷条件下特异性表达的功能，该启动子可以在水稻苗期即发挥其作用，因此本发明的 发明人分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。
[0020] 另一方面，本发明提供一种扩增上述水稻苗期冷诱导表达启动子P〇SC〇ld7的全 长或其任意片段的引物对。
[0021] 另一方面，本发明还提供一种包含上述植物冷诱导强表达启动子的表达盒。
[0022] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻 苗期冷诱导表达启动子P0sc〇ld7,在所述重组表达载体中，所述水稻苗期冷诱导表达启动 子P0sc〇ld7连接于待表达的基因序列的上游。优选的，所述待表达的基因为Gus基因，所 述重组表达载体为pCAMBIA1391-P0scold7,该重组表达载体为将SEQ ID No:l所示的序列 即P0scold7或启动子P0scold7构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为 pCAMBIA1391-P0sc〇ld7。或者待表达基因可以为任何对作物的耐寒性具有改善功能的基 因。通过本发明的启动子驱动该耐寒基因在寒冷条件下表达，从而实现改善作物耐寒性状 的功能。
[0023] 再一方面，本发明提供上述植物冷诱导强表达启动子在培育转基因植物中的应 用。所述应用包括将本发明提供的上述植物冷诱导强表达启动子连接于载体的待表达的基 因序列上游（例如，将所述启动子序列插入目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所 述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0024] 并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如 水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0025] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，SEQ ID No :2中的序列为去除了 SEQ ID No :1中开头的22bp以及结尾的22bp后的序列，为获自日本晴水稻中的DNA序列。SEQ ID No :1中开头的22bp为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；SEQ ID No :1中结 尾的22bp为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相 应序列互补）。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以 指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的 基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0026] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻P0sc〇ld7基因上游包 括转录起始位点在内的1985bp的DNA序列，并将其命名为启动子P0sc〇ld7。将该序列经酶 切后连接到植物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体）， 利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化， 得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus表达定量检测发现，转基因植株在低 温诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平提高，从而证明该1985bp的序列具有驱动基因 表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻低温诱导处理后表达。
[0027] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在低 温诱导处理后可驱动靶标基因在植株中在水稻苗期时即可特异性表达，从而提高外源靶标 基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。
[0028] 技术效果
[0029] 本发明所克隆的水稻启动子P0scold7能够调控基因在植株中集中表达，在实际 应用中具有显著价值。利用该启动子能显著提高水稻的耐寒性能，这对于水稻耐冷性分子 机制的研宄以及培育耐寒性的水稻新品种具有重要的理论和现实意义。
【附图说明】
[0030] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0031] 图1为将P0scold7启动子构建于pCAMBIA391载体质粒中的示意图，其中图1中 A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-Poscold7示意图，其中示出了利用 P0scold7启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0032] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0033] 图3为7天苗龄的P0scold7::⑶S转基因植株组织染色图。在30°C条件下正常生 长的水稻植株，经24小时染色后，根、叶均无 Gus活性，而在4°C冷处理24小时后，再经过 30min染色后，在根、莖、叶中均有Gus强烈表达。（标尺=IOmm)
[0034] 图4为冷处理他、111、411、811、1211、1611、2011、2411后？〇8(3〇1(17的相对表达量的变化。
【具体实施方式】
[0035] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0036] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0037] 含有酶切位点的POscold7启动子的获得
[0038] 步骤1、引物的设计
[0039] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物 的酶切位点。
[0040] 本实验例中以水稻双元表达载体PCAMBIA1391 (来自于CAMBIA，公开使用载体， 安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶 标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID N〇:3)5'端带BamHI，酶切位点 (GGATCC)，反向引物（SEQ ID No:4