低温诱导型启动子pcp1及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及低温诱导型启动子PCPl及应用。
技术背景
[0002]诱导型启动子(Inducible Promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。长期进化过程中，植物通过启动不同基因的表达可在一定范围内适应光、温、水等环境的变化。这些基因的启动子通常包含比较保守的顺式作用元件，利用这些保守元件可以推测新基因的可能功能，也可用这些环境应答基因的启动子与抗逆基因融合，从而使转基因植物更好地适应逆境。诱导型启动子包括光、温度、激素应答启动子等。光应答启动子中通常存在GT-l-motif，1-box, G-box和AT-rich sequence等顺式作用元件；温度应答启动子中多存在HSE_motif, CCAAT_box,CCGAC-motif等；激素应答启动子中则包含各种激素应答元件。G-box作为蛋白结合的一个高度保守的位点，是植物中通用的受信号诱导的顺式作用元件，在植物和动物中具高度保守的核心序列CACGT。G-box通常与另外一个顺式作用元件如1-box, H_box等协同作用，在细胞接受外界信号时调节转录起始的频率。这种机制可能是通过G-box及其结合蛋白相互作用产生一个内部环境，其他调节蛋白与启动子区域有效结合，使细胞准确而有选择地起始转录。有些诱导型启动子同时具有组织特异性，如RBCSl启动子，既包含叶特异表达元件，又带有几个光应答元件(LREs)，受光的诱导调节。当转基因烟草由光照转入黑暗时，该启动子驱动的GUS活性比在光下低许多，Northern杂交几乎检测不到GUS的表达。平菇是我国栽培量最大的食用菌，过低的生长温度对平菇的生长情况、菇型、产量都有非常重要的影响。而至今未有从平菇中鉴定出来的低温诱导型启动子，国内也没有关于其他食用菌低温诱导启动子的报道，这对食用菌耐逆育种具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种低温诱导型启动子序列PCP1。
[0004]低温诱导型启动子PCPl，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.1所示；
它来源于平菇品种“沈平35”；
低温诱导型启动子PCPl的制备方法，它包括:
提取平菇品种“沈平35”总RNA，经反转录合成cDNA的第一链，以其为模板，用引物: PCPlS:5’ CAGCATCTGCGACCACCCTAGCACG 3’ ；
PCPlAS:5’ AGTGAGTGCCGATGGAT 3’ ；
进行PCR扩增获得。
[0005]—种植物表达载体,它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID N0.1所不的基因。
[0006]低温诱导型启动子PCPl在培养转基因植物和食用菌品种中的应用。
[0007]低温诱导型启动子PCPl作为低温胁迫选择标记的应用。
[0008]本发明提供了低温诱导型启动子序列PCP1，是平菇中新发现的与低温胁迫相关诱导型启动子。经实验表明，将构建好的带有平菇低温诱导型启动子和GFP基因的植物表达载体转入烟草中，在低温胁迫下，GFP基因能够表达，而未低温胁迫时候GFP基因不能表达，本发明的基因来源于食用菌，具有适合于食用菌的优化密码子，其基因工程受体主要适合于食用菌的榆黄蘑、杏鲍菇、白灵菇等。培养转基因植物及食用菌品种中，低温胁迫性选择标记具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0009]图1为平菇低温诱导型启动子PCPl的PCR电泳检测图；
图2为平菇低温诱导型启动子PCPl连接到T载体后的PCR电泳检测图；
图3平菇低温诱导型启动子PCPl连T载酶切鉴定结果；
图4为平菇低温诱导型启动子PCPl连植物表达载体pCAMBIA1302-勺酶切鉴定结果;
图5为平菇低温诱导型启动子PCPl在植物表达载体pCAMBIA1302- PCP1-GFm綠菌菌液PCR鉴定结果；
图6、7为转基因烟草在低温4°C胁迫下GFP基因的表达鉴定结果；
图8为转基因烟草在常温25°C培养下GFP基因的表达鉴定结果。
【具体实施方式】
[0010]实施例1
通过对平菇品种“沈平35”(吉林农业大学菌物所提供，公开推广应用的品种)的凝集素基因Iec上游启动子序列的分析，发现启动子区域具有含多个脱水、低温响应和ABA逆境应答顺式作用元件。
[0011]选用平菇品种“沈平35”，接种在PDA培养基平板上生长一周后，4°C培养24h，取菌丝，用液氮研磨，加入含有裂解液的1.5ml的EP管中，震荡混匀后，使用试剂盒RNAisoPlus提取总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定RNA质量，然后用分光光度计测量RNA的浓度；按照美国FERMENTAS公司的反转录试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA第一链；根据平菇基因组数据库和转录组数据库序列设计引物:PCP1S:5’ CAGCATCTGCGACCACCCTAGCACG 3’，PCPlAS: 5’ AGTGAGTGCCGATGGAT 3’，采用 RT-PCR 的方法进行 cDNA 克隆，PCR 反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性40s，52°C复性40s，72°C延伸40s, 30个循环，72°C后延伸1min JfPCR产物克隆至pMD-18T载体上，进行PCR和酶切检测，电泳结果如图1、图2。产物回收测序后获得了平菇低温诱导启动子序列，全长cDNA为927bp，其碱基序cDNA如序列表 SEQ ID N0.1。
[0012]实施例2
根据平菇低温诱导启动子的cDNA序列，设计扩增完整编码阅读框的引物，在上游添加Xba I酶切位点，下游添加Nco I酶切位点，上游引物:CAGCATCTGCGACCACCCTAGCACG,下游引物:CAAGTGAGTGCCGATGGAT,以实施例1中获得的cDNA为模板进行PCR扩增，将低温启动子序列的cDNA克隆到pMD-18T载体上，进一步克隆到双元表达载体pCAMBIA1302，构建成PCAMBIA1302-载体，酶切电泳结果见图4，PCR检测图片见图5。将构建好的植物表达载体通过农杆菌侵染的方法转入烟草中，将在MS筛选培养基中的烟草幼苗4°C低温胁迫12h后，对照为常温25°C培养的转基因烟草，分别放入荧光观察装置，观察转基因烟草和对照的GFP基因表达情况。表明平菇低温诱导启动子能够在低温胁迫下诱导GFP基因的表达，在没有胁迫的时候没有诱导表达，说明这一启动子序列是低温诱导型启动子，见图6、7、8。
[0013]上述实验表明本发明中克隆的平菇启动子序列，为平菇中新发现的与低温相关的诱导型启动子序列。实施例2表明，该启动子能够在低温诱导下调控下游基因的表达，具有提高植物及食用菌耐逆性的功能。本发明的基因来源于平菇，具有适合于侧耳属的优化密码子，其基因工程受体主要适合于侧耳属食用菌的榆黄蘑、杏鲍菇、白灵菇等。
【主权项】
1.低温诱导型启动子，其碱基序列如序列表SEQID N0.1所示。
2.权利要求1所述的低温诱导型启动子，其特征在于:它来源于平菇品种“沈平35”。
3.低温诱导型启动子的制备方法，它包括: 提取平菇品种“沈平35”总RNA，经反转录合成cDNA的第一链，以其为模板，用引物: PCPlS:5’ CAGCATCTGCGACCACCCTAGCACG 3’ ； PCPlAS:5’ AGTGAGTGCCGATGGAT 3’ ； 进行PCR扩增获得。
4.一种植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID N0.1所示的基因。
5.权利要求1所述的低温诱导型启动子在培养转基因植物和食用菌新品种中的应用。
6.低温诱导型启动子作为低温胁迫选择标记的应用。
【专利摘要】本发明公开了低温诱导型启动子序列PCP1，是平菇中新发现的与低温胁迫相关诱导型启动子。经实验表明，将构建好的带有平菇低温诱导型启动子和GFP基因的植物表达载体转入烟草中，在低温胁迫下，GFP基因能够表达，而未低温胁迫时候GFP基因不能表达，本发明的基因来源于食用菌，具有适合于食用菌的优化密码子，其基因工程受体主要适合于食用菌的榆黄蘑、杏鲍菇、白灵菇等。培养转基因植物及食用菌品种中，低温胁迫性选择标记具有广泛的应用前景。
【IPC分类】C12N15-82, A01H5-00, A01H15-00, C12Q1-68, C12N15-113, C12N15-10
【公开号】CN104611337
【申请号】CN201510085874
【发明人】付永平, 盛立柱, 李玉, 宋冰, 李丹, 戴月婷, 王欣欣, 郭昱秀, 张春兰
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月21日