一种茶树低温诱导型启动子的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，提供一种来源于茶树的诱导型启动子CsPE1α及其表达。本发明提供的诱导型启动子为如下1)-2)中任一种DNA分子：1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有启动子功能的DNA分子。本发明提供的启动子可驱动目的基因在植物中表达，有助于人们对茶树生长发育的研究，且为植物特别是山茶科的遗传改造提供帮助，本发明提供的启动子在低温胁迫下诱导启动抗寒基因来有效防治冻害。同时，茶树耐寒性提高，适应气候的能力提升，就能够使纬度更高的地方生产茶叶。
【专利说明】一种茶树低温诱导型启动子 一、
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种低温诱导型启动子，包括含有该启动子的结 构和载体，以及含有该启动子或者所述结构或者载体的宿主细胞、转基因植物。 二、 技术背景
[0002] 在细胞代谢过程中，丙酮酸脱氢酶系（pyruvate dehydrogenase complex, FOC)占 据关键的代谢位置，对能量代谢的影响意义重大。而roC-ΕΙα基因是连接能量代谢途径的 闸门，该基因如果出现异常势必影响整个能量代谢途径。
[0003] 植物基因工程中常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类：组成型启动子 (constitutive promoter)、组织特异型启动子（tissue-specific promoter)和诱导型启动 子（inducible promoter)。本发明所提供的启动子CsPEla属于诱导型启动子。诱导型启 动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。低温作为最常见的逆境胁迫之一，对 植物尤其是茶树的生长发育影响深远，但对其相关启动子的鉴定分离表达研究少之又少。 因此，对茶树低温诱导型启动子的克隆与研究具有十分重要的意义。 三、
【发明内容】
[0004] 1、技术问题
[0005] 本发明目的是提供一种低温诱导型启动子，为植物生长发育和生理代谢的研究提 供基础，尤其是在茶树的遗传育种中提供一条快速、经济、有效的途径。
[0006] 2、技术方案
[0007] 本发明的发明人首先采集中山陵茶场茶树花粉，使用改良的CTAB法提取DNA。 然后根据本课题组克隆得到的茶树花粉CsEla基因的cDNA序列（GenBank登录号 ： JQ999982)设计引物，使用TAIL-PCR方法扩增其启动子。验证之后，引入酶切位点，构建瞬 时表达载体（PBI121-CSPE1 a -GFP)。基因枪轰击法对低温诱导性启动子CsPEl α进行瞬时 表达分析。
[0008] 3、有益效果
[0009] 本发明针对上述现有技术的情况，首次提供了一个茶树低温诱导型启动子。该启 动子能够有效响应低温胁迫，调节下游基因表达量。对茶树低温诱导性启动子的研究有助 于认识Ε?α基因的功能及丙酮酸脱氢酶系在茶树中的作用机理。可以利用本发明启动子 构建成各种植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物品质和其他有益生产性 状。
[0010] 本发明所提供的低温诱导型启动子，可接受低温刺激而使下游基因高效表达，克 服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪 费，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。将该启动子应用于转基因植物中，可以提 高转基因植物的耐寒性，更好的抵御寒害、冻害，扩大种植范围。本发明在农业领域具有广 阔的应用空间和市场前景。 toon] 本发明提供的低温诱导型启动子来源于茶树，有助于茶树生长发育的研究。众所 周知，明前茶品质优良，市场前景广阔。提高茶树抗寒能力可以提前茶树发芽时间，延长明 前茶采摘时间，提高产量。同时，茶树耐寒性提高，适应气候的能力提升，就能够使纬度更高 的地方生产茶叶，进而能够扩大茶叶的生产区域，提高茶叶产量。另外，控制好茶树的能量 代谢，就能够更好的调节茶树生长周期。通过合理灌溉，适时增肥，可以提高鲜叶品质，从而 获得显著的经济效益。
[0012] 茶叶是最重要的经济作物之一，寒害、冻害等低温胁迫会造成茶叶产量减少以及 品质下降。茶树抗寒基因的克隆以及启动子的分离可以使我们更好地了解植物体响应低温 胁迫的机理，并为基因工程改良奠定基础。 四、
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1从茶树花粉基因组DNA中TAIL-PCR扩增CsEl α的启动子的电泳图谱。
[0014] 其中，Μ泳道为DL2000Marker，从上到下片段依次为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp ;箭头处即为切胶回收的目的基因。
[0015] 图2启动子CsPEl α中预测到的顺式表达元件，除了基本转录元件：CAAT_框 和TATA-框等外，该启动子含有2个GATA-框，1个LTR，1个G-框，1个ARR1AT，1个 TGA-element等顺式元件。
[0016] 图3重组载体pBI121-CsPEl a -GFP的PCR鉴定图谱。
[0017] 其中，Μ泳道为DL2000Marker，从上到下片段依次为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp，泳道2为PCR所得产物的结果。
[0018] 图4荧光体式显微镜下经基因枪轰击转入重组载体pBI121-CsPEl a -GFP的洋葱 内表皮细胞的GFP荧光表达结果。
[0019] 图5激光共聚焦显微镜下经基因枪轰击转入重组载体pBI121-CSPEl a -GFP的洋 葱内表皮细胞的GFP荧光表达结果。 五、
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例中所用方法若无特殊说明均为本领域惯用的技术手段，所用的试剂、 材料，如无特殊说明均可通过商业途径得到。
[0021] 下面结合附图对本发明的方法进行详细的描述，但是以下描述的目的是示例性 的，而不是限制本发明的范围。
[0022] 实施例1、植物逆境胁迫诱导表达型启动子CsPEla的获得
[0023] 1.引物设计
[0024] 根据茶树花粉CsEl a基因的cDNA序列，设计引物扩增其启动子，具体引物序列如 下：
[0025] 特异性引物序列：
[0026] GSP1 :如 SEQ ID N0. 2 所示；
[0027] GSP2 :如 SEQ ID NO. 3 所示；
[0028] GSP3 :如 SEQ ID NO. 4 所示；
[0029] 随机引物：
[0030] ADI :如 SEQ ID NO. 5 所不：5' -tgwgnagwan casaga-3'，其中，w = a 或 t ;n = a或g或c或t;s = g或c;
[0031] AD2 :如 SEQ ID NO. 6 所不：5' -cawcgicnga iasgaa-3'，其中，w = a 或 t ;i = a或g或c或t;n = a或g或c或t;s = g或c;
[0032] AD3 :如 SEQ ID NO. 7 所示：5' -ntcgastwts gwgtt-3'，其中，n = a 或 g 或 c 或 t ；s = g c ；w = a t ；
[0033] AD4 :如 SEQ ID NO. 8 所示：5' -ntcgastwts gwgtt-3'，其中，n = a 或 g 或 c 或 t ；s = g c ；w = a t ；
[0034] AD5 :如 SEQ ID NO. 9 所不：5 ' -gtcgaswgan awgaa-3 '，其中，s = g 或 c;w = a 或t;n = a或g或c或t;
[0035] AD6 :如 SEQ ID NO. 10 所不：5' -wgtgnagwan canaga-3'，其中，w = a 或 t ;n = a或g或c或t ; 〇
[0036] 2. TAIL-PCR 扩增
[0037] 以茶树花粉基因组DNA为模板，以AD和GSP1为引物进行PCR扩增反应， 反应体系为：模板 DNA 1 μ L，dNTP Mixture (每种 2. 5mm) 8 μ L，10 X LA PCR Buffer II (Mg2+plus)5 μ L, TaKaRa LA Taq (5U/μ 1) 0. 5 μ L, AD Primer (lOOpmol/μ 1) 1 μ L, GSP1 (lOpmol/ μ 1)，ddH20 33. 5 μ L，总体积 50 μ L。反应程序为：94 °C 变性 lmin， 再 98 °C lmin ;紧接着 5 个循环为 94 °C 30s，68 °C lmin，72 °C 2min ;接着 94 °C 30s， 25°C 3min，72°C 2min ;然后按照（94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min)-(94°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min)-(94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min)方向进行 15 个循环；最后 72°C延伸 10min。
[0038] 反应完成后，将上述PCR反应液稀释50倍作为第二轮PCR扩增模板。第二 轮PCR反应：以AD和GSP2引物进行PCR扩增，反应程序为：按照（94°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min)-(94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min)-(94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min)方向进行 15个循环；最后72°C延伸10min。
[0039] 反应完成后，将上述PCR反应液稀释50倍作为第三轮PCR扩增模板。第三 轮PCR反应：以AD和GSP3引物进行PCR扩增，反应程序为：按照（94°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min)-(94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min)-(94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min)方向进行 15个循环；最后72°C延伸10min。
[0040] 将三级PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（图1)，回收纯化0. 8kb的目的条带，将其连 接到PMD18-T载体（购自TAKARA公司），回收的目的片段与pMD-18T载体于16°C进行连接 2-6h，形成连接产物，连接反应体系如下：
[0041]
【权利要求】
1. 一种茶树低温诱导型启动子，其特征在于：如SEQ ID NO. 1所示的DNA分子序列。
【文档编号】C12N15/113GK104232642SQ201410359224
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】黎星辉, 杜昱林, 王玉花 申请人:南京农业大学