专利名称：葡萄病原菌诱导型启动子的分离方法及在抗病育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及两个来源于葡萄病原菌诱导型启动子的分离方法，重组表达载体构建 及在转基因葡萄中的应用，属于植物基因工程领域。
背景技术：
启动子是调控基因表达过程中转录因子结合的重要DNA序列，它与转录因子一起 决定下游基因表达的时间、类型、水平和组织器官特异性等。基因工程中按其作用方式及功 能，启动子通常被分为三类组织特异型启动子、组成型启动子和诱导型启动子。组织特异性启动子，这类启动子仅在特定器官或组织中启动转基因表达，在定向 改变组织器官性状的研究中，本类启动子应用比组成型启动子更有效。组成型启动子，这类启动子能在所有组织细胞、任何时空启动基因表达。组成型启 动子尽管能够不受时空及环境影响启动外源基因在转基因植株中高效表达，Kohli等在《植 物杂志》1999年17 =591-601 “转基因水稻转化质粒重组的分子鉴定揭示烟草花叶病毒35S 启动子中热点重组”中报道，正常环境下细胞内组成型表达抗逆蛋白不仅是一种能量浪费， 还会导致植物的正常代谢受阻，致转基因植物发育异常或造成其它负面影响。由于它的强 转录活性，能够组成型高效启动外源转基因表达，目前基因工程中广泛应用的烟草花叶病 毒35S启动子仍占总数的80%。诱导型启动子，诱导型启动子平时不启动基因表达或启动强度很低。在一定诱因 下，启动活性增强。Behnam等在《植物细胞报告》2007年沈1275-1282 “拟南芥rd29A启 动子整合DREBlA基因提高转基因马铃薯抗冷性”中报道，rd29A诱导型启动子驱动拟南芥 DRREBl在马铃薯中表达后，摄氏4度条件下，前半小时转基因马铃薯与野生型DREBl的表达 都未检测到，半小时后，转基因马铃薯中DREBl开始表达，而野生型依然没有检测到，rd29A 通过在低温条件下启动DREBl表达提高转基因马铃薯的抗寒性。其它干旱、盐碱、极端温度 等胁迫诱导型启动子近两年也开始被逐渐重视并用于植物抗逆基因工程。欧洲葡萄以其优良品质成为生产中的主载种，然而其本身并没有显著抗病性。传 统育种通过对杂交后代表现型进行筛选相当耗财费时，基因工程技术已成为加快定向培 育抗病葡萄品种的新趋势。病程相关蛋白基因是一类能有效提高葡萄抗病性的基因，被 广泛应用于葡萄抗病基因工程育种中。然而，Ferreira等在《生物技术趋势》2004年22 168-173 “不改变葡萄酒品质的情况下提高转基因葡萄抗病性”中指出，葡萄果实过多积累 病程相关蛋白导致葡萄酒品质严重下降，因此组成型启动子启动病程相关蛋白基因表达的 转基因葡萄果实可能将导致酒品质下降。截止到目前，还没有鉴定分离出有效的葡萄病原 菌诱导型启动子并应用于基因工程研究。因此，获得葡萄病原菌诱导型启动子对于葡萄抗 病基因工程建立一个高效、实用的表达系统是非常重要的。
发明内容
为克服组成型启动子给转基因抗病葡萄带来的负面影响，并避免染色体步移等方 法克隆启动子的繁琐，本发明公开了一种启动子快速克隆法，以克隆获得两个葡萄病原菌 诱导型启动子(GenBank登陆号分别为⑶565705及HQ174899)构建启动子报告基因融 合载体，两个启动子启动报告基因在葡萄叶片中的表达受白粉菌诱导，为葡萄抗病基因工 程提供病原菌诱导型启动子的克隆方法并成功应用于葡萄抗病育种中。本发明是通过以下方法实现的中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’葡萄抗病转录因子基因VpWRKYl 和VpWRKY2为白粉菌诱导表达型基因，其启动子具有受病原菌诱导启动基因上调表达的活 性，采用GenBank葡萄基因组序列及白粉菌诱导表达的转录因子基因VpWRKYl和VpWRKY2 序列设计引物，从中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’基因组DNA中进行启动子 片段的克隆，获得了病原菌诱导型启动子PvpWRKYl全长序列694bp与病原菌诱导型启动子 PvpffRKY2全长序列643bp，通过构建重组表达载体PvpWRKYl GUS和PvpWRKY2 ⑶S，并用 农杆菌介导的真空渗透法导入葡萄叶片，瞬时表达所克隆启动子启动的GUS报告基因，通 过对接种葡萄白粉菌前后瞬时表达叶片的GUS染色观察，及对接种葡萄白粉菌前后瞬时表 达叶片的GUS活性定量检测，验证了 PvpWRKYl和PvpWRKY2受葡萄白粉菌诱导启动报告基 因活性上调。本发明克隆的诱导型启动子是以GenBank数据库与转录因子基因序列为基础设 计引物直接克隆所得，避免了染色体步移等方法克隆启动子的繁琐，具有简便、快速等特 点，此方法也完全适用于克隆其它启动子。⑶S且未 接种白粉菌的叶片浅度着色，接种后叶片染色程度加深，阴性对照叶片接种前后均未着色， 阳性对照即转化35: :GUS载体的叶片深度着色，而转化无启动子的GUS载体叶片染色后仅 微弱变蓝。接种白粉菌前后转化叶片的GUS活性定量检测结果表明PvpWRKYl和PvpWRKY2 启动的GUS本底活性相对较弱，但两启动子活性受白粉菌诱导后上升，PvpffRKYl启动的GUS 在接种白粉菌后的活性是接种前3. 21倍，而PvpWRKY2启动的GUS在接种白粉菌后的活性 是接种前1. 63倍，即本发明克隆的两个诱导型启动子均能在病原菌侵染时以精准方式调 控转入外源基因，使转入基因仅在受病原菌诱导的条件下被启动表达。在葡萄抗病育种中， 仅需把重组载体中启动子所启动的报告基因换成任何感兴趣的抗病基因，即可转化葡萄获 得病原菌诱导表达外源抗病基因的转化植株，从而减少抗病基因工程育种中组成型启动子 对转基因葡萄造成的负面影响，最大限度发挥转基因优势。
附图1为本发明VpWRKYl和VpWRKY2表达模式图。图示VpWRKYl和VpWRKY2在葡萄叶片接种白粉菌前后不同时间表达模式的半定量 分析结果；VpWRKYl和VpWRKY2被白粉菌诱导先上调表达到最高，再逐渐下降至初始水平。附图2为本发明重组载体构建示意图。载体pCAMBIA1301的组成型35S启动子分别被置换成目标启动子或直接去掉，从 而构建成新的重组载体。附图3为本发明转化叶片⑶S染色结果图。
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w/o35S GUS、PvpffRKYl GUS、PvpffRKY2 GUS 禾口 35S GUS 分别为无启动子、 PvpffRKYU PvpWRKY2、35S启动⑶S表达载体的农杆菌菌液侵染过的叶片，上排为葡萄白粉 菌悬浮液接种12小时后各载体转化叶片的GUS染色结果，下排为水对照处理相同时间的染 色结果，WT为对照，即仅空农杆菌LBA4404侵染。附图4为本发明转化叶片⑶S活性定量图。不同启动子启动的GUS活性在葡萄叶片接种白粉菌前后的定量比较。灰色和柱子 黑色分别表示同一载体转化叶片接种前、后的GUS活性。
具体实施例方式以下结合实施例及附图对本发明做进一步详细描述实施例一葡萄VpWRKYl和VpWRKY2基因启动子的分离方法a.葡萄VpWRKYl和VpWRKY2基因半定量反转录PCR检测取样首先对葡萄叶片进行白粉菌接种处理，当新梢长至25-30cm长，新叶长至5-6cm宽 时，在每新梢上选取3片幼叶，压片前预先喷雾无菌水使叶片上有微小液滴，但无明显露点 出现，从田间发病葡萄上采摘白粉病发病症状一致的叶片对选取的叶进行压片接种，压片 时间超过&，压片后即套袋M小时保湿以利白粉菌孢子萌发，在接种后0、6、12、24、48、72、 96,120小时采集叶片在田间用液氮冻存，去离子水处理的叶片做为对照；b. RNA分离采用SDS/酚法，cDNA第一链合成参照Promega公司M-MMLV反转录酶 使用说明进行；c.引物设计及反转录PCR检测选择VpGAPDH为内参基因，根据目的基因及内参基因序列设计引物如下VpffRKYl 上游引物GCGTCCTCGTCGGAGGGGATVpffRKYl 下游引物ATCTGGACCTGTTTGGTTGCVpffRKY2 上游引物CAGAGAAGGCTGAACCGAACVpffRKY2 下游弓丨物AGCCTTTGGAAATGGTGATGVpGAPDH 上游弓丨物ATCCACGGGAGCAGCAAA
VpGAPDH 下游弓丨物AGAACGCGAAAATTAGAACAGG反转录PCR反应采用天根公司预混上样缓冲液的2 X PCR mix反应试剂盒，反应程 序94°C预变性3分钟，然后94°C变性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸30秒条件下扩增25 循环，最后72 °C延伸5分钟，中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’转录因子基因VpWRKYl和VpWRKY2 被葡萄白粉菌诱导12小时后先上调表达到最高，后随时间延长逐渐下降至初始水平，表 明这两个基因启动子为病原菌诱导型启动子，以‘白河-35-1’基因组DNA为模板，根据 VpffRKYl和VpWRKY2基因序列设计启动子下游引物，根据NCBI欧洲葡萄基因组同源序列设 计启动子上游引物，PCR先直接快速扩增出包含与基因重叠区域启动子片段，回收PCR产物 克隆、测序；d. PCR扩增启动子片段PvpffRKYl 上游引物CTATTAGGAGGAGTTGGTTGPvpffRKYl 下游引物CTCATGGTGGCGTCTGTG
PvpffRKY2 上游引物ATGGTCTCCGTTCCGTCTT
PvpffRKY2 下游引物ACTCGGGGTTCGGCTCAG ；
e.葡萄基因组按小量提取法进行
e.1采摘Icrn2左右叶片放入离心管中，
e.2加0.細1提取缓冲液，提取缓冲液配制200mM Tris PH 7. 5, 250mMNaCl, 25mMEDTA PH8..0,0. 5% SDS,
e.3用与离心管配套的小塑料研棒按顺、逆时针交替旋转法将样品在缓冲液中磨碎，
e.4在12000rpm，离心5分钟，
e.5上清液转移至新管，
e.6加入0.細1酚氯仿异戊醇溶液，其体积比为25 24 1，PH值为6. 5，
e.7加0.細1异丙醇，混勻，
e.8放置5分钟，
e.9全速离心5分钟，
e.10弃上清，管底剩下DNA，
e.11加Iml 70%乙醇上下轻柔颠倒至白色片状物悬浮，室温放置2分钟，
e.12在12000rpm，离心1分钟，弃上清，
e.13开放空间干燥10分钟以上，至乙醇挥发干净，
e.14 加 50ul 灭菌 ddH20,
e.15稀释5倍直接进行PCR扩增；
f.目地片段的TA连接测序方法按Promega载体使用说明进行。
实施例二 启动子重组载体的构建和应用
a.重组载体构建，为构建⑶S报告重组载体，重新设计带有酶切位点^CbaI和
Nco I的引物仅扩增不包含与基因重叠区域启动子片段部分，分别命名为PvpWRKYl和 PvpWRKY2，用目的启动子替换pCAMBIA1301的35S，使⑶S处于所克隆启动子控制下，构建成 promoter: GUS重组表达载体，此外，用BamHI和BglII酶切pCAMBIA1301的35S启动子，利 用同尾酶互补将载体重新连接成没有35S的⑶S载体，命名为w/o35S:⑶S，pCAMBIA1301 做为阳性对照，即35组成型启动GUS表达；PvpffRKYl ⑶S 上游引物gggtctagaCTATTAGGAGGAGTTGGTTGPvpffRKYl ⑶S 下游引物gggccatggACTCACCAAGTGAAGATCAAPvpffRKY2 ⑶S 上游引物gggtctagaTGGTCTCCGTTCCGTCTTTC
PvpffRKY2⑶S 下游引物gggccatggGGCCGATTCGGAGAGAAG以TA连接好的载体为模板进行PCR扩增，将PCR回收产物与pCAMBIA1301空载体 分别进行)(bal和NcoI双酶切后，PCR与载体酶切产物进行连接，转化后送测序保证重组载 体中启动子插入位置正确无误；b.电转化农杆菌感受态细胞的制备b. 1将LBA4404菌株接种于20ml含有40mg/L链霉素和50mg/L利福平终浓度的 LB液体培养基，培养M小时，b. 2将培养好的菌液加入IOOml新鲜LB中至OD值0. 2，继续振荡培养，至OD 值 0.6，
b. 3从摇床中取出菌液，冰浴15分钟，b. 4菌液转移至50ml离心管，4°C 5000rpm离心15分钟，弃上清，b. 5用冰浴的灭菌ddH20 35ml重悬细胞，离心，弃上清，重复用ddH20洗一次，b. 6用冰浴的灭菌10%甘油25ml轻柔重悬浮细胞，离心，沉淀会很松散，弃上清， 重复用10%甘油洗一次，b. 7用2ml冰浴后的10%甘油重悬细胞即成感受态细胞，b. 8将感受态细胞按100 μ 1分装到1. 5ml离心管，立即置于冰上准备电转化；c.农杆菌转化，c. 1 将测序正确的 promoter: :GUS 菌液及阴性对照 w/0;35S: :GUS 和 pCAMBIA1301 提取质粒后，用50ul无菌ddH20溶解备用，c. 2将电转化用的电极杯及盖子用ddH20洗净后，80%乙醇侵泡5分钟，用紫外交 联仪紫外线照射30分钟以除去残留DNA，并将温度设置为30°C烘干电极杯，c. 3将电极杯盖好与感受态细胞一起分别置于冰上预冷20分钟，c. 4加入ddH20溶解的质粒0. 2ul于感受态细胞中，轻轻吸打混勻继续冰浴30分 钟，c. 5将混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使均勻进入电极杯底部 且内部不产生气泡，c. 6打开电穿孔仪，选择细菌转化模式，调节电压至1. 8KV,c. 7将电极杯侧面用吸水纸完全拭干后按狭缝向前方向放入卡槽中，c. 8将卡槽推入电转化仪，按start键，听到两声轻微蜂鸣后，取出电极杯置于冰 上，待最后一个样品电击完毕，在超净台内向每个电极杯中加200 μ 1液体LB将细胞洗出并 移入1. 5ml离心管中，至于培养1. 5小时后涂布于筛选平板上，c. 9对筛选出的菌落进行PCR鉴定，并对阳性菌进行液体培养基培养获得工程菌；d.工程菌转化葡萄叶片，诱导启动转基因表达，用真空渗透法将工程菌转化入葡 萄叶片，并在接种前后染色，获得报告基因的瞬时表达，d. 1将含有目地质粒的农杆菌菌液接种到20ml含有40mg/L链霉素和50mg/L利福 平终浓度的LB液体培养基，28°C,200rpm振荡培养36小时，d. 2将5ml培养液加入200ml新鲜含有相同抗生素的LB在、200rpm振荡培养 16小时，d. 3在5000rpm离心10分钟，弃上清，用20ml重悬液重悬菌体至OD值0. 6，重悬 液配制10mM MES pH 5. 6, IOmM MgCL2, 2% (ff/V)蔗糖，150 μ M乙酰丁香酮，将配好的重悬 液高压灭菌15分钟，冷却备用，d. 4将大小薄厚一致的葡萄叶片均勻加入培养好的菌液中，菌液深度不超过 1. 5cm，在真空泵压力0. 085-0. 09MPa下抽真空45分钟，d. 5擦去叶片表面菌液，正面朝上将叶柄固定于湿润的脱脂棉内，放于托盘中，覆 盖带孔保鲜膜，于27°C培养箱暗培养16小时，再在弱光下培养至3天，期间喷雾保湿，d. 6每处理取出半数叶片，用去离子水冲洗，基中两片用于蛋白测定，其余放入 ⑶S染色液中再抽真空10分钟，37°C染色，d. 7对另半数叶片用压片法接种葡萄白粉菌，压片前预先喷雾无菌水使叶片上有微小液滴，但无明显露点出现，从田间采摘发病严重且一致的叶片对转化叶片进行压片接 种，压片时间5秒，压片后继续覆盖带孔保鲜膜保湿，12小时后取两片用于蛋白测定，其余 放入GUS染色液中染色；e.转基因葡萄叶片病原诱导GUS活性的定量检测⑶S活性检测方法按Jefferson经典方案，以4_甲基伞形酮酰-β -D-葡萄糖酸苷 (4-MUG)为底物，GUS催化使之水解为4-甲基伞形酮G-MU)与β-D-葡萄糖醛酸，4-MU分 子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，荧光值由荧光分光光度计测定。
权利要求
1.葡萄病原菌诱导型启动子的分离方法，中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白 河-35-1’葡萄抗病转录因子基因VpWRKYl和VpWRKY2为白粉菌诱导表达型基因，其启动 子具有受病原菌诱导启动基因上调表达的活性，采用GenBank葡萄基因组序列及白粉菌诱 导表达的转录因子基因VpWRKYl和VpWRKY2序列设计引物，从中国野生华东葡萄抗白粉 病株系‘白河-35-1’基因组DNA中进行启动子片段的克隆，获得了病原菌诱导型启动子 PvpffRKYl全长序列694bp与病原菌诱导型启动子PvpWRKY2全长序列64;3bp，其特征在于 通过构建重组表达载体PvpWRKYl:⑶S和PvpWRKY2:⑶S，并用农杆菌介导的真空渗透法 导入葡萄叶片，瞬时表达所克隆启动子启动的GUS报告基因，通过对接种葡萄白粉菌前后 瞬时表达叶片的GUS染色观察，及对接种葡萄白粉菌前后瞬时表达叶片的GUS活性定量检 测，验证了 PvpWRKYl和PvpWRKY2受葡萄白粉菌诱导启动报告基因活性上调。
2.如权利要求1所述的葡萄病原菌诱导型启动子的分离方法，其特征在于2. a葡萄VpWRKYl和VpWRKY2基因半定量反转录PCR检测取样，首先对葡萄叶片进行白 粉菌接种处理，当新梢长至25-30cm长，新叶长至5-6cm宽时，在每新梢上选取3片幼叶，压 片前预先喷雾无菌水使叶片上有微小液滴，但无明显露点出现，从田间发病葡萄上采摘白 粉病发病症状一致的叶片对选取的叶进行压片接种，压片时间超过^，压片后即套袋M小 时保湿以利白粉菌孢子萌发，在接种后0、6、12、24、48、72、96、120小时采集叶片在田间用 液氮冻存，去离子水处理的叶片做为对照；2. b RNA分离采用SDS/酚法，cDNA第一链合成参照Promega公司M-MMLV反转录酶使用说明进行；2. c引物设计及反转录PCR检测选择VpGAPDH为内参基因，根据目的基因及内参基因序列设计引物如下VpffRKYl 上游引物GCGTCCTCGTCGGAGGGGATVpffRKYl 下游引物ATCTGGACCTGTTTGGTTGCVpffRKY2 上游引物CAGAGAAGGCTGAACCGAACVpffRKY2 下游引物AGCCTTTGGAAATGGTGATGVpGAPDH 上游引物ATCCACGGGAGCAGCAAAVpGAPDH 下游引物AGAACGCGAAAATTAGAACAGG反转录PCR反应采用天根公司预混上样缓冲液的2XPCR mix反应试剂盒，反应程序 94°C预变性3分钟，然后94°C变性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸30秒条件下扩增25循 环，最后72°C延伸5分钟，中国野生华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’转录因子基因VpWRKYl和VpWRKY2被葡 萄白粉菌诱导12小时后先上调表达到最高，后随时间延长逐渐下降至初始水平，表明这两 个基因启动子为病原菌诱导型启动子，以‘白河-35-1’基因组DNA为模板，根据VpWRKYl和 VpffRKY2基因序列设计启动子下游引物，根据NCBI欧洲葡萄基因组同源序列设计启动子上 游引物，PCR先直接快速扩增出包含与基因重叠区域启动子片段，回收PCR产物克隆、测序； 2.d PCR扩增启动子片段 PvpffRKYl 上游引物CTATTAGGAGGAGTTGGTTG PvpffRKYl 下游引物CTCATGGTGGCGTCTGTG PvpffRKY2 上游引物ATGGTCTCCGTTCCGTCTTPvpffRKY2 下游引物ACTCGGGGTTCGGCTCAG ；2. e葡萄基因组按小量提取法进行 2. e. 1采摘Icm2左右叶片放入离心管中，2. e. 2 加 0. 4ml 提取缓冲液，提取缓冲液配制200mM Tris PH 7. 5,250mM NaCl, 25mM EDTA PH :8. 0,0. 5% SDS,2. e. 3用与离心管配套的小塑料研棒按顺、逆时针交替旋转法将样品在缓冲液中磨碎， 2. e. 4 在 12000rpm，离心 5 分钟， 2. e. 5上清液转移至新管，2. e. 6加入0.細1酚氯仿异戊醇溶液，其体积比为25 24 1，PH值为6. 5，2. e. 7加0. 4ml异丙醇，混勻，2. e. 8放置5分钟，2. e. 9全速离心5分钟，2. e. 10弃上清，管底剩下DNA，2. e. 11加Iml 70%乙醇上下轻柔颠倒至白色片状物悬浮，室温放置2分钟，2. e. 12在12000rpm，离心1分钟，弃上清，2. e. 13开放空间干燥10分钟以上，至乙醇挥发干净，2. e. 14 加 50ul 灭菌 ddH20,2. e. 15稀释5倍直接进行PCR扩增；2.f.目地片段的TA连接测序方法按Promega载体使用说明进行。
3.如权利要求1所述的葡萄病原菌诱导型启动子在抗病育种中的应用，其特征在于 3. a重组载体构建，为构建⑶S报告重组载体，重新设计带有酶切位点)(ba I和Nco I的引物仅扩增不包含与基因重叠区域启动子片段部分，分别命名为PvpWRKYl和PvpWRKY2， 用目的启动子替换PCAMBIA1301的35S，使GUS处于克隆所克隆启动子控制下，构建成 promoter: :GUS重组表达载体，此外，用BamHI和BglII酶切pCAMBIA1301的35S启动子，利 用同尾酶互补将载体重新连接成没有35S的⑶S载体，命名为w/o35S:⑶S，pCAMBIA1301 做为阳性对照，即35组成型启动GUS表达；PvpffRKYl: GUS 上游引物gggtctagaCTATTAGGAGGAGTTGGTTG PvpffRKYl: GUS 下游引物gggccatggACTCACCAAGTGAAGATCAA PvpffRKY2 :GUS 上游引物gggtctagaTGGTCTCCGTTCCGTCTTTC PvpffRKY2 :GUS 下游引物gggccatggGGCCGATTCGGAGAGAAG以TA连接好的载体为模板进行PCR扩增，将PCR回收产物与PCAMBIA1301空载体分别 进行^CbaI和NcoI双酶切后，PCR与载体酶切产物进行连接，转化后送测序保证重组载体中 启动子插入位置正确无误；3. b电转化农杆菌感受态细胞的制备3. b. 1将LBA4404菌株接种于20ml含有40mg/L链霉素和50mg/L利福平终浓度的LB 液体培养基，28°C培养M小时，3. b. 2将培养好的菌液加入IOOml新鲜LB中至OD值0. 2，继续振荡培养，至OD值0. 6，3. b. 3从摇床中取出菌液，冰浴15分钟，· 3. b. 4菌液转移至50ml离心管，4°C 5000rpm离心15分钟，弃上清， 3. b. 5用冰浴的灭菌ddH20 35ml重悬细胞，离心，弃上清，重复用ddH20洗一次， 3. b. 6用冰浴的灭菌10%甘油25ml轻柔重悬浮细胞，离心，沉淀会很松散，弃上清，重 复用10%甘油洗一次，·3. b. 7用2ml冰浴后的10%甘油重悬细胞即成感受态细胞，·3. b. 8将感受态细胞按100 μ 1分装到1. 5ml离心管，立即置于冰上准备电转化；·3. c农杆菌转化，·3. c. 1将测序正确的promoter: :GUS菌液及阴性对照w/0;35S: :GUS和pCAMBIA1301提 取质粒后，用50ul无菌ddH20溶解备用，·3. c. 2将电转化用的电极杯及盖子用ddH20洗净后，80%乙醇侵泡5分钟，用紫外交联 仪紫外线照射30分钟以除去残留DNA，并将温度设置为30°C烘干电极杯， 3. c. 3将电极杯盖好与感受态细胞一起分别置于冰上预冷20分钟， 3. c. 4加入ddH20溶解的质粒0. 2ul于感受态细胞中，轻轻吸打混勻继续冰浴30分钟， 3. c. 5将混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使均勻进入电极杯底部且 内部不产生气泡，·3. c. 6打开电穿孔仪，选择细菌转化模式，调节电压至1. 8KV， 3. c. 7将电极杯侧面用吸水纸完全拭干后按狭缝向前方向放入卡槽中， 3. c. 8将卡槽推入电转化仪，按start键，听到两声轻微蜂鸣后，取出电极杯置于冰上， 待最后一个样品电击完毕，在超净台内向每个电极杯中加200 μ 1液体LB将细胞洗出并移 入1. 5ml离心管中，至于培养1. 5小时后涂布于筛选平板上，·3. c. 9对筛选出的菌落进行PCR鉴定，并对阳性菌进行液体培养基培养获得工程菌； 3. d工程菌转化葡萄叶片，诱导启动转基因表达，用真空渗透法将工程菌转化入葡萄叶 片，并在接种前后染色，获得报告基因的瞬时表达，·3. d. 1将含有目地质粒的农杆菌菌液接种到20ml含有40mg/L链霉素和50mg/L利福平 终浓度的LB液体培养基，28°C,200rpm振荡培养36小时，·3. d. 2将5ml培养液加入200ml新鲜含有相同抗生素的LB在^°C、200rpm振荡培养 16小时，·3. d. 3在5000rpm离心10分钟，弃上清，用20ml重悬液重悬菌体至OD值0. 6，重悬液 配制10mM MES pH 5. 6, IOmM MgCL2, 2% (ff/V)蔗糖，150 μ M乙酰丁香酮，将配好的重悬液 高压灭菌15分钟，冷却备用，·3. d. 4将大小薄厚一致的葡萄叶片均勻加入培养好的菌液中，菌液深度不超过1. 5cm, 在真空泵压力0. 085-0. 09MPa下抽真空45分钟，·3. d. 5擦去叶片表面菌液，正面朝上将叶柄固定于湿润的脱脂棉内，放于托盘中，覆盖 带孔保鲜膜，于27°C培养箱暗培养16小时，再在弱光下培养至3天，期间喷雾保湿，·3. d. 6每处理取出半数叶片，用去离子水冲洗，基中两片用于蛋白测定，其余放入GUS 染色液中再抽真空10分钟，37°C染色，·3. d. 7对另半数叶片用压片法接种葡萄白粉菌，压片前预先喷雾无菌水使叶片上有微 小液滴，但无明显露点出现，从田间采摘发病严重且一致的叶片对转化叶片进行压片接种， 压片时间5秒，压片后继续覆盖带孔保鲜膜保湿，12小时后取两片用于蛋白测定，其余放入GUS染色液中染色；3. e转基因葡萄叶片病原诱导GUS活性的定量检测⑶S活性检测方法按Jefferson经典方案，以4_甲基伞形酮酰-β -D-葡萄糖酸苷 (4-MUG)为底物，GUS催化使之水解为4-甲基伞形酮G-MU)与β-D-葡萄糖醛酸，4-MU分 子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，荧光值由荧光分光光度计测定。
全文摘要
本发明公开了一种启动子快速克隆法，以克隆获得两个葡萄病原菌诱导型启动子构建启动子::报告基因融合载体，两个启动子启动报告基因在葡萄叶片中的表达受白粉菌诱导，为葡萄抗病基因工程提供病原菌诱导型启动子的克隆方法并成功应用于葡萄抗病育种中。克隆的两个诱导型启动子均能在病原菌侵染时以精准方式调控转入外源基因，使转入基因仅在受病原菌诱导的条件下被启动表达，在葡萄抗病育种中，仅需把重组载体中启动子所启动的报告基因换成任何抗病基因，即可转化葡萄获得病原菌诱导表达外源抗病基因的转化植株，减少抗病基因工程育种中组成型启动子对转基因葡萄造成的负面影响，最大限度发挥转基因优势。
文档编号C12N15/113GK102121004SQ20101058255
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者周起, 朱自果, 李慧娥, 王跃进, 谢小青 申请人:西北农林科技大学