专利名称：：利用棉花基因GbF3H改变花瓣颜色的制作方法
技术领域：
：本发明属于棉花基因工程
技术领域：
。具体涉及一种分离、克隆的(ibF;3H基因，该基因被证实能够改变棉花花瓣颜色的。所述的基因(^bFIBH与植物类黄酮代谢及花青素的合成相关。通过RNAi抑制该基因的表达可以显著减少棉花花瓣的花青素含量，使花色变淡；而超量表达该基因可以提高棉花花瓣的花青素含量。利用本发明的基因渴望改变植物花瓣的颜色，改良花卉的颜色，同时可以开发出与花色相关的分子标记。
背景技术：
：植物的花色是植物的重要特征之一，在虫媒异花授粉植物中起到诱导传粉昆虫的作用，同时多彩的花色也增加了植物的观赏性，花色还是许多植物研究中的重要的选择标记和目标性状。丰富多彩的花色是自然进化和人为选择的结果。人们对花色的研究已有很久的历史了，花青素是大多数植物花瓣颜色的的主要决定因子(Grotewold等，TheGeneticsandBiochemistryofFloralPigments，Annu.Rev.PlantBiol.2006.57761-80)，而花青素是一种类黄酮类物质，类黄酮是植物体内主要的次生物质之一(D‘Auria等，ThesecondarymetabolismofArabidopsisthalianagrowinglikeaweed,Curr.Opin.PlantBiol.2005.8，308-316.)。随着生物学和化学的发展，对类黄酮的种类、化学性质以及其生物代谢路径都有了很大的研究进展。在一些模式植物中花青素的生物合成已经研究得非常清楚(L印iniec等，GeneticsandBiochemistryofSeedFlavonoids,Annu.Rev.PlantBiol.2006.57:405-30)，许多相关的基因也已经被克隆和验证。F3H(flavanone3-hydroXylase，黄烷酮3-羟化酶)基因是花青素生物合成上游的关键基因(Britsch等，Molecularcloning,sequenceanalysis,andinvitroexpressionofflavanone3beta-hydroxylasefromPetuniahybrida.JBiolChem.1992.2675380-5387)，它催化由黄烷酮到二氢黄酮醇的过程。在其他植物中的研究表明F!3H基因的缺失或抑制会直接影响到植物花色的表型(Martin等，ControlofanthocyaninbiosynthesisinflowersofAntirrhinummajus.1991.PlantJ.1,37-49·)。棉花是一种重要的经济作物，同时也是生物技术应用范围比较广的农作物。通过对棉花基因改造而得到的抗虫棉给传统的农业带来了很多希望和生机。棉花的生物成分和基因组都很复杂，对棉花的基因克隆和功能验证也是比较困难的。目前已有的几个功能基因的研究都是和纤维发育相关(Luo等，GhDET2，asteroid5α-reductase,playsanimportantroleincottonfibercellinitiationandelongation.2007.PlantJ.51:419-430)。而直接与棉花外部形态，特别是花色相关基因的克隆还未见报道。类黄酮类相关基因在棉花纤维发育时期都有表达，申请人本发明提出之前的研究就表明海岛棉GbF3H基因在棉花纤维发育时期高效表达(Tu等，Genesexpressionanalysesofsea-islandcotton(GossypiumbarbadenseL.)duringfiberdevelopment,2007.PlantCellRep.26:1309-1320)，而在陆地棉纤维发育的基因文库中，F3H基因的表达丰度也很高(Yang等Accumulationofgenome-specifictranscripts,transcriptionfactorsandphytohormonalregulatorsduringearlystagesoffibercelldevelopmentinallotetraploidcotton.PlantJ.2006.47:761-75.)，F3H也是彩棉色素合成的关键基因(Xiao等Cottonflavonoidstructuralgenesrelatedtothepigmentationinbrownfibers.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications.2007.35873-78)。在本发明提出之前申请人从纤维发育的文库中得到一条F!3H基因序列，通过转基因验证表明F!3H基因与棉花的花色合成有关，对棉花的花色合成的研究以及转基因棉花的分子标记开发都有很重要的意义。
发明内容本发明的目的是从海岛棉中分离克隆一个包含该功能蛋白同源基因完整编码区段的DNA片段(在本发明中所述“DNA片段”与“核苷酸序列”以及“DNA分子”同义，下同)，利用这个基因可以改变花色，该基因还可以作为转基因的形态标记应用。对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明它与拟南芥及其他植物的F!3H基因相似性很高，因此被命名为(MH基因。本发明涉及分离和应用一种包含(ibF3H基因的DNA片段，该片段赋予植物花青素合成的能力。其中，所述的(^bFIBH基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO1中第82-1188位所示的DNA序列；或2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。可以采用已经克隆的(ibF3H基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerasechainreaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的(ibF3H基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含(ibF3H基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得花瓣花青素含量较高的转基因植株；而将这一序列的一部分序列作为靶标构建的可在植物体内产生RNA干涉载体转化植物，可获得花青素含量降低的植物。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子、特异启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。本发明的基因中的任意一段都可以作为靶标设计基于发卡环结构的植物RNAi载体或基于miRNA的植物干涉载体来转化植物抑制该基因的表达从而改变花青素的含量而改变花色。本发明可以通过以上两种方式构建到植物的表达载体中，可以在其转录起始核苷酸前加上花瓣特异启动子来作为转基因的形态标记。携带有本发明(ibF3H基因的表达载体或含有其片段的RNAi载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,MethodforPlantMolecularBiologyVIILAcademyPressiNewYork，pp.411-463；GeisersonandCorey，1998，PlantMolecularBiology(2ndEdition)。可使用包括本发明的(ibF3H基因的表达载体转化的宿主是包括棉花在内多种植物，培育类黄酮和花青素含量高的植物品种；可使用包括本发明的(ibF3H基因片段为靶标的RNAi载体转化宿主棉花，可用于培育不同花色的棉花品种，或作为转基因的形态标记。或作为花卉颜色改良基因的应用等等。本发明基因与类黄酮的合成相关，因此可将本发明的基因应用于改变棉花的类黄酮代谢来开发新品种和开发新标记。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。序列表SEQIDNO:1显示的是本发明分离克隆的包含有(ibF3H基因的核苷酸序列。序列表SEQIDNO2是(ibF3H基因编码的氨基酸序列，它编码368个氨基酸。图1采用ClustalW软件(公开使用软件)对(AF3H基因序列分析结果。表明GbF3H与陆地棉中3条序列同源性很高。Ghl:GI74273629SequencesourceGossypiumhirsutum陆地棉(白色棉)；Gh2:GI121755803SequencesourceGossypiumhirsutum陆地棉(棕色棉T586)；Gh3=GI289470637SequencesourceGossypiumhirsutum陆地棉(绿色棉)；Gb:GI119657097SequencesourceGossypiumbarbadense海岛棉；Ipb:GI4512593SequencesourceIpomoeabatatas(sweetpotato)甘暮；Eg:GI50788697SequencesourceEustomagrandiflorum洋桔梗；Nt:GI164454783SequencesourceNicotianatabacum(commontobacco)烟草；Ac:GI219944305SequencesourceActinidiachinensis称猴桃；Cit:GI4126401SequencesourceCitrussinensis舌甘g；Ph:GI2465434SequencesourcePetuniaχhybridaM^Ψ;>1:GI134039064SequencesourceDimocarpuslongan龙目艮图2用Real-timePCR检测(ibF3H基因在棉花不同组织中的表达水平。基因在所选取的组织中均有一定量的表达，在花瓣的表达量相对较高，在开花后5天的胚珠和纤维中也有较高的表达，随着纤维的发育表达量下降。组织依次是1.根；2.子叶；3.真叶；4.茎；5.花瓣；6.-3DPA胚珠；7.ODPA胚珠；8.5DPA胚珠；9.5DPA纤维；10.IODPA纤维；11.15DPA纤维。各组织(ibF3H基因相对表达量以根组织为参照(即设定为1)，(ihUB7为内参基因。图3本发明的超量表达载体p3k_GbF3H的构建示意图。将(ibF3H全长基因经酶切链接反应插入CaMV35S启动子后的情况。图4本发明的RNAi载体pHellSgate4-F3Hi的构建示意图。将(ibF3H部分基因片段Q61-707bp)经重组反应插入pHellsgate4载体。图5转基因T2代棉花分析，RNAi的植株花瓣颜色明显变淡，而超表达株系与对照相比没有显著的变化，花青素定量分析表明对照的花青素含量是RNAi株系的3-4倍，而超表达株系的花青素含量比对照要高，但是差异不显著。图中a)转基因拷贝数分析；b)对应的表型和花青素含量分析。GN，为转基因阴性对照；Ril、Ri2、Ri3，分别为RNAi的3个T2株系；0x1、0x2、0x3，分别为3个超表达的株系。图6:GN，Ri2、Ri3和0xl、0x2中GbF3H的基因表达分析。图中GN为转基因阴性对照；Ri2、Ri3为RNAi的T2株系；0x1、0x2为超表达的株系。图7=RNAi植株与彩棉T586杂交后代分析，转基因阳性植株花青素含量明显降低，花色变浅。图中T，为彩棉Τ586；Ri为RNAi株系；TF1、TF2、TF3为Τ586与Ri杂交后代。图8:是本发明克隆的(ibF3H基因的核苷酸序列，下划线部分为该基因的编码区(82-1188bp).具体实施例方式以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有(ibF3H基因完整编码区段的DNA片段，以及验证(ibF3H基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。实施例1:(ibF3H基因分离克隆及其在棉花不同组织的表达特性本申请人的作物遗传改良国家重点实验室的前期工作中从建立的海岛棉纤维发育文库中分离出一条与其他植物F3H高度同源的表达序列标签EST(详细见Tu等Genesexpressionanalysesofsea-islandcotton(GossypiumbarbadenseL.)duringfiberdevelopment.PlantCellRep.2007,26:1309-1320)与其他物种F3H基因的进化分析(见图la)，生物信息学分析表明，该EST包含一个完整的0RF，将其命名为(ibF3H，其在NCBI基因库中的登录号为DQ912945，该基因在纤维发育时期高效表达，进一步分析表明(AF3H与陆地棉中3条序列同源性很高(见图lb)。从海岛棉3-79(其为国际通用的棉花海岛棉标准系，可以从中国农科院棉花研究所的种质资源库索取)中提取ODPA胚珠总RNA(提取方法t艮据Zhu等AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005，31.1657-1659.)，利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为65°C5min,50°C60min,70°ClOmin。用引物F3HF(5'AGGTTTAAGTTCAGAGTCATAAG3‘)和F3HR(5，TAAGGATTGAAGAATAGTTACAG3，)扩增出GbF3H基因的全长cDNA(1433bp)。PCR反应条件为94°C预变性3min;94°C30sec，56°C30sec,72°C2min，32个循环；72°C延伸lOmin。将扩增获得的PCR产物连入pGEM_T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因全长cDNA。以海岛棉3-79为材料，提取以下11个不同组织的RNA，用Rea-timePCR检测(ibF3H基因的表达水平。选取的11个组织分别是1.根；2.子叶；3.真叶；4.茎；5.花瓣；6.-3DPA胚珠；7.ODPA胚珠；8.OTPA胚珠；9.5DPA纤维；10.IODPA纤维；11.15DPA纤维。棉花总RNA提取方法根据上述Zhu等(AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31.1657-1659.)发表的文献，RNA提取完成后后用DNaseI(购自!Iomega公司)处理，RNA完整性通过1.2%(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)。核酸浓度的测定在BeckmanDU800spectrophotometer上进行。RNA260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.O的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与1μ1500μg/mloligo-dT(15)引物(购自Promega公司，美国)，1μIlOmMdNTP,DEPC_water混合，总体积为12μ1；然后65°C变性5min冰上骤冷；再加入8μ1含有4μ1RTbuffer,2μ10.IMdithiothreitol,40unitsofRNasinRibonucleaseInhibitor(Promega),禾口200unitsofSuperscriptIIIRT(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50°C温浴Ih合成第一链；反应结束后75°C处理15min使SuperscriptIIIRT失活。每份cDNA稀释到300μ1后-20°C保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物F3Hin-f(5‘TGGTTTCATCGTCTCCAGCC3‘)和F3Hin_r(5‘CATGGCCTCTGACAACACCTC3')对(ibF3H基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长204bp)。同时用引物UB7_f(5‘GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3‘)和UB7_R(5‘CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3‘)对棉花(iMbiquitin(GenBank登陆号DQ116441)基因做特异扩增(扩增产物长I^bp)，以作为内对照进行相对定量分析。定量PCR仪为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。PCR反应体系OOμ1)包括1μ1稀释后的cDNA(等于IOng起始总RNA)，10y12XPCRMasterMix，200nM的引物。反应条件为95°C30sec；95°C5sec，60°C!35sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明本发明克隆的基因(^bFIBH在所选取的组织中均有一定量的表达，但在花瓣的表达量相对较高，而且在开花后5天的胚珠和纤维中也有较高的表达，随着纤维的发育表达量下降(见图2)。实施例2超量表达载体及RNAi的构建和转化为了验证(ibF3H基因在棉花中的功能，申请人构建了超量表达和RNAi载体转化棉花。根据实施例1中得到(ibF3HcDNA设计超表达引物，在引物两端分别加上BamHI和^ilI的酶切位点及保护碱基，分别将该引物命名为引物F3Hoef和F3Hoer，再以(ibF3H基因的cDNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物通过酶切链接的方法连入超表达载体p3k-GbF3H(中间载体是pCAMBIA2300，澳大利亚CAMBIA实验室赠送，将该载体上的CaMV35S启动子通过酶切连接反向整合到pCAMBIA2300的多克隆位点上，即得到本发明的超表达载体p3k-GbF3H)。构建的超量表达载体p3k-GbF3H见(图2)。根据(ibF3H基因与陆地棉F3H的比对结果在同源区设计RNAi引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，分别将该引物命名为引物F3Hrif和引物F3Hrir，再以实施例1中得到(ibF3H基因cDNA为模板进行PCR扩增，得到的产物通过BP重组反应导入RNAi载体pHellsgate4(重组酶购自hvitrogen公司，美国；RNAi载体见Wesley等Constructdesignforefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants.PlantJ.2001.27,581-590.)，构建的RNAi载体pHellsgate4_F3Hi见(图4)。引物序列如下F3Hoef5'CTCGGATCCAGGTTTAAGTTCAGAGTCATAAG3‘；F3Hoer5'CTGGTCGACTAAGGATTGAAGAATAGTTACAG3‘；F3Hrif5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCTGTTGAGGCTTGTGAGGAT3‘；F3Hrir5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGGTTGAGGGCATTTAG3‘。将构建的载体转化农杆菌菌株LBA4404(OctopineTi-plasmiddeletionmutantsofAgrobacteriumtumefacienswithemphasisontherightsideoftheT-region,Plasmid,1982，7:15-)，再通过农杆菌介导的转化方法转化棉花，所采用的转化受体材料为YZ-1，此材料是本实验室经过大量的筛选发现的一个具有很高胚胎发生能力的材料，农杆菌介导的转化棉花的转化方法和程序参照Jin等建立的高效转化体系(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum，2006，50:519-524；Anefficientgraftingsystemfortransgenicplantrecoveryincotton(GossypiumhirsutumL.).PlantCelliTissueandOrganCulture,85:181-185,2006；FactorsaffectingstabletransformationandpIantregenerationduringtransformingembryogeniccallusofUplandcotton(GossypiumhirsutumL.)viaAgrobacteriumtumefaciens,PlantCell,TissueandOrganCulture,81:229-237,2005)，并作了相应的调整和修改，具体方法和流程如下1、无菌苗的培养将将棉花品系H-I(参见Jin等的文献(Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,2006，50:519-524)棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭菌IOmin,无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基上(配方如下1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L+植物胶phytagel(购自sigma公司，美国)2.5g/L)，在暗培养3-6天。2.农杆菌的活化和保存2.1准备农杆菌LBA4404，制备含卡那霉素50mg/L的MGL液体培养基(配方胰化蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，MgSO4.7H200.lg/L，KH2PO4O.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L，调pH至7.0)，无菌三角瓶，LB(固、液)培养基(含卡那霉素50mg/L)，灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.&nL离心管。2.2操作2.2.1活化，悬浮从超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，26.5°C暗培养36-4，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5°C暗培养36-4,待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，27°C、200rpm摇2h，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。2.2.2菌株的保存从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中48h，按菌液和甘油体积比为11加入1.5mL离心管混勻，-70°c保存。3.浸染，共培养3.1准备暗培养5天左右幼嫩健壮的TL-Y幼苗，经活化的农杆菌，无菌培养皿和无菌滤纸寸。3.2操作无菌条件下将YL-Y幼苗下胚轴用锋利的刀片切成0.5-lcm长的切段，转入到经活化的农杆菌菌液中，搅勻，静置5-lOmin，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5min使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基中(配方MS无机盐+有机物+2，4-D0.Img/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L,pH7.0)，20°C暗培养38_42h。4.愈伤组织的诱导将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上(配方如下MS无机盐+B5有机物+2,4-D0.lmg/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，pH5.8)。5、非胚性愈伤组织的增殖非胚性愈伤组织的增殖培养基如下所示MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减8半)+B5有机物+2,4-DO.05mg/L+KT0.lmg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g//L,pH5.8。6、愈伤组织的分化愈伤组织经继代(一个月继代一次)几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基上(配方MS基本培养基+B5有机物+激动素(KT)0.15mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，调pH至5.8)，进一步分化成胚状体。7、胚性愈伤组织的继代胚性愈伤组织的继代培养基如下所示MS无机盐(其中硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+ΚΤ0.15mg/L+IBA0.5mg/L+Gln(谷胺酰胺)1.Omg/L+天冬酰胺(Asn)O.5mg/L+葡萄糖30g/L+phytage12.5g/L，pH5.8。8、成苗生根培养将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中成苗生长培养基上(配方1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖15g/L+phytagel2.5g/L，pH5.8)。9、炼苗移栽将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜，炼苗2-3天，然后移栽到小土钵中，遮荫缓苗一周左右移栽大田。附MS培养基母液配制1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解再逐一加到容量瓶中(最后加入CaCl2否则容易产生沉淀)，定容到一升。2.配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温下IOh以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。3.配制铁盐时，两种盐用热水分别溶解，然后混合，放置于室温下IOh以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。4.各种生长激素一般可以用lmol/L的NaOH或HCl溶解后，再定容。5.配制&有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染6.各种母液配制好后应存放在4°C冰箱中，发现有沉淀后，不得使用。大量元素(20倍)母液(g/L)KN0338；NH3N0333；MgS04·7H20(无水MgS04)74(3.8)；KH2P043.4；CaCl2·2H20(无水CaCl2).8(6.6)。微量元素(100倍)母液(g/L)CoC12·6H200.0025；CuS04·5H200.0025；H3B030.62；KI0.083；MnS04·4H202.23；NaM04·2H20ZnS04·7H20铁盐(100倍)母液(g/L)FeSO4·7H20Na2EDTAB5有机物VBl(硫胺素)VB5(盐酸吡哆醇)VB6(烟酸)肌醇甘氨酸10mg/L；lmg/L；lmg/L；100mg/L；2mg/L。2.78；3.73。0.025；0.86。实施例4:GbF3H基因基因超量表达及RNAi转基因T2代家系的表型变化GbF3H基因超量表达及RNAi转基因各得3个T2代家系，Southern结果显示有两个RNAi和一个超表达家系为单拷贝(见图5a)。表型观察可见RNAi的植株花瓣颜色明显变淡，而超表达株系与对照相比没有显著的变化，花青素提取分析也显示了对应的结果，对花青素进行定量分析表明对照的花青素含量是RNAi株系的3-4倍，而超表达株系的花青素含量比对照要高，但是差异不显著(见图恥)。对T2家系都是取的家系混合样，结果显示花青素的含量与花瓣的表型是相关联的。选取转基因株系提取RNA，RT-PCR表明，本发明克隆的(ibF3H基因表达水平与花青素的含量也是相关的(操作与实施例3相关试验相同)(见图6)。实验表明(ibF3H基因是一个与花青素合成相关的基因，通过遗传操作(ibF3H基因基因可以改变花瓣的花青素含量和花色。对其进行RNAi抑制的效果更显著，而(ibFIBH基因本身在花瓣中高效表达的，所以对其超表达的结果不是很显著。DNA提取和Southern实验参照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版。花青素的提取和测量参照Mancinelli等(Mancinelli等Thephotoregulationofanthocyaninsynthesis.IX.Thephotosensitivityoftheresponseindarkandlightgrowntomatoseedlings.PlantCellPhysiol.1984,25:93-105)报道的方法。对T2家系都是取的家系混合样，每个株系至少取3-5个单株。称取开花当天或开花后一天的花瓣0.5g于液氮中，用研钵研磨成粉，加5ml冷的酸化甲醇(1%HC1，V/V)，于4°C振荡抽提48h。低温离心，取Iml上清用分光光度计(BaCkmanDU800)检测530nm的OD值即为花青素的相对含量值。实施例5:GbF3H基因构建的RNAi载体可以用于花色的改良抑制(ibF3H基因基因的表达可以明显改变花瓣的颜色，用(ibF3H基因基因干涉的植株与彩棉T586(陆地棉标准系TM-I的近等基因系，具有多个标志性状，从中国农科院棉花研究所棉花种质资源库索取)杂交，杂交后代的分离群体中，用PCR检测转基因标记NPTII基因，DNA提取同实施例4和PCR用的引物为NPTII-f(5'CGTAAAGCACGAGGAAGCG3')andNPTII-r(5'GGCACAACAGACAATCGGC3')。结果显示转基因棉花阳性植株与花瓣的表型及花青素的含量变化是共分离的(图7)，转基因棉花阳性植株花青素含量明显降低，花色变浅。由此可见本发明克隆的(^bFIBH基因及其构建的RNAi载体可以用于花色的改良ο10权利要求1.赋予植物花青素合成能力的(^bFIBH基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1中第82-1188位所示的DNA序列；或编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。2.赋予植物花青素合成能力的(AF3H基因，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO2所示，它编码368个氨基酸。3.一种RNAi表达载体pHellsgate4-F3Hi，其特征在于，将权利要求1或2所述的(ibF3H基因的第沈1_707位DNA片段经重组反应插入到载体pHellsgatM中而成，其包含有序列表SEQIDNO:1中第沈1-707位碱基对所示的核苷酸序列。4.权利要求1所述的基因在调控植物花色中的应用。5.权利要求4的应用，其中包括在调控棉花花色中的应用。全文摘要本发明属于植物基因工程
技术领域：
。具体涉及一种分离、克隆的GbF3H基因，功能验证表明该基因是一种能够改变棉花花瓣颜色的功能基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，它编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，编码368个氨基酸。所述的基因GbF3H与植物类黄酮代谢及花青素的合成相关。通过RNAi抑制该基因的表达可以显著减少棉花花瓣的花青素含量，使花色变淡；而超量表达该基因可以提高棉花花瓣的花青素含量。利用本发明克隆的通过转化可能改变植物花瓣的颜色，也可以应用于花卉颜色的改良，同时有望开发出花色相关的分子标记。文档编号C12N15/82GK102485897SQ201010582448公开日2012年6月6日申请日期2010年12月6日优先权日2010年12月6日发明者张献龙,朱龙付,涂礼莉,谭家福,邓锋林申请人:华中农业大学