专利名称：棉花纤维发育中两个新的microRNA基因与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及与陆地棉纤维发育相关的两个未知miRNA (gAr-MflW和gA&M/及9)基因的克隆、鉴定和 用途。建立了野生型(WT)和无绒无絮纤维突变体(M)两个小分子RNA文库，采用了目前国际最先进 的高通量测序列技术，获得了上述两个新的miRNA基因序列。进一步分析了该miRNA的两个耙基因，分 别编码叶绿体omega 3-脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶，两者分别控制纤维的伸长发育及细胞壁的形成和加 厚。本发明属于生物技术领域。若以该miRNA及其靶基因作为目的基因对棉花进行深入的功能研究.在 一定程度上可有效地提高棉纤维的品质，具有一定的经济及社会效益。
二背景技术：
MicroRNAs (miRNAs)是一类新发现的非编码、长度约为21 nt的单链小分子RNA。近年来的大量研 究表明，miRNA在调节植物生长发育，细胞增值、胁迫响应等过程中发挥着重要的作用。棉花是一种重 要的经济作物，其纤维是天然纺织材料的主要来源。我国是世界上最大的棉花生产和消费国，也是一个重 要的棉花贸易国，因此，棉花作为经济作为在我国更是具有举足轻重的地位 (http://www.emergingtextiles.com)。棉花纤维的发育机理成为备受关注的热点，因为它关系到如何提高棉 纤维产量(提髙单位面积棉纤维伸长的数量)，改良纤维品质，而所有这些是与纺织工业和民生密切相关 的现实问题。
随着现代分子生物学技术的发展，国内外除了利用常规育种手段外，逐步运用基因工程技术对棉纤维 品质进行遗传改良。利用基因工程改良纤维品质依赖于对纤维发育相关基因及其调控元件的认识。因此， 开展分离、鉴定与棉花纤维发育相关的功能基因是培育优质棉纤维新品种，实现育种理论和关键技术新突 破的重要基础，也是提升我国棉花育种原始创新力的关键举措。
2007年我们实验室率先在已有的棉花基因组中挖掘出了 37miRNA。这也是国内外迄今为止从棉花植 物中发掘到最多的miRNA。这些重要的miRNA基因对调控棉花生长及纤维发育具有重要的生物学意义及 潜在的生产开发价值。虽然目前已经知道与棉纤维发育相关的基因有上千个，但对这些基因的表达机理及 网络调控知之甚少。因此，迫切需要对我国已有的特色棉花资源，通过大规模克隆方法充分挖掘和开发属 于本国知识产权的新的miRNA (包括其它sRNA)基因，为后期定向改良和培育优质性状的棉花种质奠定 基础。
本专利所克隆到的两个新的miRNA来自于陆地棉品种，而且只在突变体中表达，表明在野生型中这 两个miRNA不表达，因此它们不会对叶绿体co-3-脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶基因的转录产物mRNA进 行转录后的切割抑制。o-3-脂肪酸脱饱和酶在植物中催化脂肪酸脱饱和生成二烯脂肪酸，后者对维持细胞 膜的功能起着重要的作用。更重要的是三烯脂肪酸是茉莉酸合成的前体，而茉莉酸对细胞壁的形成有调节 作用。乙醇脱氢酶在细胞壁中以众多的代谢物为底物催化木质素的铰链，形成细胞壁的成分。因此，两者 可能对纤维细胞壁的合成有着重要的影响。
事实上，脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶是多功能酶，这两种酶参与植物对冷害胁迫反应的调节，基因突变导致植物对冷胁迫的高度敏感。两者可能在棉花植物开花吐丝后期由于气温较低调节棉纤维的生伸发 育。但是上述两个靶基因在调节棉花纤维合成中的具体功能还不清楚。因此，通过研究miRNA的调节功 能系统研究脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶在棉花纤维发育中的作用具有重要的生物学意义和潜在应用价值。
发明内容
技术问题本发明的目的是克隆陆地棉纤维发育过程中两个重要的miRNA (g/w-Affl 和g/zr-AfflWO， 分析和鉴定了二级结构，同时分析得到了两个靶基因，叶绿体0)-3-脂肪酸脱饱和酶和乙醇脱氢酶基因，分 析表明它们参与了棉纤维发育过程中细胞壁的合成。以此基因为基础，通过基因工程的方法改变目前棉纤 维的品质特性，获得一定的经济及社会效益，为棉花的品质育种提供基因资源，尽快提高我国棉花品种的 纤维品质。
技术方案
陆地棉/^-g/^-M/i (基因表达前体)，长度为205bp ，序列如下:
陆地棉;^-g/^-M/卵(基因表达前体)，长度为296bp ，序列如下:
AATGAATCAAAAGAGAAGAAA
1. 按照IUumina Sample Preparation Protocol文库构建方法，构建了陆地棉Xuzhou-142( WT)和Xuzhou-142 光籽突变体(M)开花后(0， 1， 2, 3, 4， 5， 6， 8， 10天，DPA)胚珠cDNA两个文库。
2. 从文库中挑取克隆，进行转化，将分析得到的高质量的长度为18-30 nt的RNA进行高通量测序。根据 测序结果，进一步进行BLAST比对分析，筛选符合miRNA标准的序列。生物信息学预测其靶基因。
有益效果
1. 目前常用的mRNA克隆分析技术效率低、不灵敏，有些表达丰度低的小分子RNA根本测不出来。 本研究采用目前国际上最先进的大规模高通量测序，其优点为
(1) 灵敏度高，准确性高，能够测出一个小分子RNA，测定的RNA分子的碱基准确率高；
(2) 高通量、规模大，能够测定所有基因组的转录子。两个文库的测序量高达到130万条碱基序列 以上，包涵所有的小分子RNA序列；
(3) 同时测定小分子RNA的表达丰度，因此可以比较两个基因文库中小分子RNA表达谱的差异。
2. 本发明所克隆到的两个miRNA (g/w-M/iW和g/w-M/i 0分别调控叶绿体co-3-脂肪酸脱饱和酶和 乙醇脱氢酶的耙基因，后者有研究表明参与细胞壁的合成，即与细胞壁的加厚有关，而细胞壁的此基因作为靶基因，对棉花进行转化理论上可直接有效地提高 其强度，打破产量品质的负相关，获得优质棉花，带来可观的经济社会效益。
3. 目前转基因的外源基因大部分来源于微生物，这类转基因作物对安全性评价要求严格。本专利报 道的基因来源于棉花，再导入棉花不存在安全性评价问题。同时，与棉纤维发育相关的miRNA 基因目前在国内外申请的专利甚少。
4. 通过该基因的功能预测和分析，表明上述两个靶基因参与棉纤维发育进程，通过农杆菌介导法将 该基因导入棉花，使其过量表达，获得的转基因植株将在棉纤维伸长或和加厚期大量表达，获得 一定的经济及社会效益，为棉花的品质育种提供基因资源，尽快提髙我国棉花品种的纤维品质。
四
图l.g^-Affi^和ghr-MJi 9前体二级结构图。miRNA从无绒无絮纤维突变体中克隆得到，并具有较 高的相对表达丰度。结构鉴定表明成熟miRNA片断位于5'端(红字黑线部分)。
五、 发明的具体实施例
1. 棉花胚珠采集棉花种植地为江苏省农科院试验田，开花期进行挂牌。胚珠釆集后立即液氮冷冻，-80°C
冰箱保存，备用。
2. 按照Illumina Sample Preparation Protocol文库构建方法，构建了陆地棉Xuzhou-142( WT)禾卩Xuzhou-142 光籽突变体(M)开花后0， 1， 2， 3, 4, 5， 6， 8， 10天(DPA)胚珠混合cDNA两个文库。
3. 从文库中挑取克隆，进行分离鉴定，将分析得到的高质量的长度为18-30 nt的RNA进行高通量测序。 根据测序结果，进一步进行BLAST比对分析，筛选符合miRNA标准的序列。生物信息学预测其耙基 因。
5SEQUENCE LISTING
<110>南京农业大学
<120>棉花纤维发育中两个新的microRNA基因与用途 <130>说明书
<160> 2
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 205
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum <220>
<221> ghr-MIR3前体基因
<222> (1)..(205) <223><400> 1
aactaatcct tgtacattag atcaaagagc aaacttatca tttctattaa aaactaacgt 60
gattgatgga ttaaccagac agttacacgt agcgtgccac atgtatctca tttgagaggt 120
aggcacaagt ttttagcaat agaaatagat gggatttcaa cagaaggacc aatttgctct 180 ttgatctagt atacaatgac taatt
205
<210>. 2 <211> 296 <212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<220>
<221> ghr-MIR9前体基因
<222> (1)"(296) <223>
<400> 2
ttcttctctt tagattcatt ggctgagtta aaacagcagc acaaatttcg gggtcaagaa 60
ttttatatgc. aggtgaaaaa accactttta acttaaaaat attctttttc cgeaaaaata 120 ccggaaaacg ctagtgtttt aaagttaaat atgcgattaa aaaaaccttt ctacccaaat 180 attgagaagt tggttaaaag aattttaaac tcgacatcga gtcaaagtca tcgagtttaa 240 gacctaaaac caaatatctg aatattaact cagctaatga atcaaaagag aagaaa 29权利要求
1.两个新发现的miRNA基因(ghr-MIR3和ghr-MIR9)的成熟片断分别为21和22碱基(表1)。
2. 根据权利要求l，这两个miRNA基因只在突变体(M)中表达，而在野生型(WT)中不表达(表2)， 表明这两个miRNA基因.对纤维发育功能有着不可缺少的作用。
3. 根据权利要求l，通过生物信息学预测到12个靶基因(表3)。表l.陆地棉(GoMj^MH7feVTOtom)新发现的miRNA成熟片断。M:突变体__Precursor Library_5p成熟片断(5'-3)_g/w-M/i 3 DR459348 M TGTACATTAGATCAAAGAGCAA(22) g/w-M/i 9 TA40540 M TAGATTCATTGGCTGAGTTAA (21)表2.陆地棉(GomwZww fe'rawtow)新的miRNA及表达丰度(Reads)。 5p禾B 3p分别指成熟miRNA在 5邻3'端。WT:野生型IDLibrary5p Reads3p Reads表达(相对于WT)M010 上调M120 上调表3. 和g/zr-Affl^的耙基因miRNAGene ID耙基因Ghr-MIR3DT455847叶绿体omega 3-脂肪酸脱饱和酶Chloroplast omega 3 fatty acid desaturaseGhr-MIR9TA20488乙醇脱氢酶TA20490Putative alcohol dehydrogenaseTA20491TA20492TA20493TA20494TA20495CD485586CD485902CD486113DN803191全文摘要
MicroRNAs(miRNAs)是一类新发现的非编码长度约为21nt的内源小分子RNA。它们可以与其特定的靶基因mRNA互补结合，通过引起靶基因的降解或翻译抑制来调节基因的表达。本发明建立了棉花野生型(Xuzhou-142)及其无绒无絮纤维突变体(光籽，Xuzhou 142 fuzzless-lintless)胚珠两个小分子RNA文库，采用了目前国际最先进的高通量测序技术(Solexa)，获得了2个未知的miRNAs基因，暂时命名为ghr-MIR3和ghr-MIR9，并研究其在棉花纤维初始发育过程中的不同表达丰度。通过生物信息学预测到了12个靶基因，其中ghr-MIR3靶基因编码叶绿体omega 3-脂肪酸脱饱和酶(omega 3-fatty acid desaturase)，而ghr-MIR9靶基因编码乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)。上述研究结果迄今为止尚未见有报道，通过基因工程手段与方法为深入研究调控棉纤维生长发育和改良纤维品质奠定了基础。
文档编号C12N15/11GK101565701SQ200910029480
公开日2009年10月28日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日 公开号200910029480.发明者杨志敏, 王芹芹, 陈旭升 申请人:南京农业大学 被以下专利引用 (1),