专利名称：：表达cry1ab的杀昆虫转基因棉ce43-67b的制作方法表达CRY1AB的杀昆虫转基因棉CE43-67B本发明涉及，尤其是，多核苷酸及其使用方法，尤其涉及含有所述多核苷酸的棉花植物。更具体地说，本发明涉及命名为CE43-67B的棉花事件(event),所述棉花事件含有CrylAb基因。本发明还涉及鉴定特定棉花事件的方法，所述棉花事件包含能够赋予所述棉花植物以昆虫抗性的基因。植物害虫是导致世界重要农业作物损失的一个主要因素。美国每年由包括昆虫在内的非哺乳动物害虫侵袭导致的损失约为80亿美元。除田地作物损失外，昆虫害虫也为果蔬种植者、观赏花卉生产者和家庭园艺师造成负担。昆虫害虫主要通过广泛应用化学杀虫剂来控制，所述化学杀虫剂通过抑制昆虫生长、防止昆虫进食或繁育或导致昆虫死亡来发挥活性。由此可以实现对昆虫害虫的良好控制，但是这些化学物质有时也会影响其它有益昆虫。广泛使用化学杀虫剂所导致的另一个问题是抗性昆虫种的出现。通过各种抗性管理实践，已经使这一问题得到了緩解，但是对于害虫控制剂替代品的需要仍不断增长。生物害虫控制剂，比如表达象5-内毒素这样的杀虫毒素的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌林，也已被用于作物植物并取得了令人满意的结果，这为化学杀虫剂提供了一种替代品或者补充。编码某些5-内毒素的基因已被分离，并且它们在异源宿主中的表达已经显示为控制经济重要昆虫害虫提供了另一工具。尤其是，来自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫毒素CrylAc在转基因植物中的表达已经为对抗所选择昆虫害虫提供了有效保护，并且表达该毒素的转基因植物已经被商业化，这使得农民能够减少化学昆虫控制剂的使用。CrylAc是一个由不同的苏云金芽孢杆菌菌林产生的杀昆虫毒素大家族中的一员。该家族中的各毒素都具有独特的杀昆虫活性镨。才帛类&物才帛属(Gossypium)《4帛，#(Malvaceae)的一个成员，由39个种组成，其中陆地棉(Gossypiumhirsutum)是最常见的栽培种。三个其它的种也有种植树棉(G.arboreum)、海岛棉(G.barbadense)和草棉(G.herbaceum)。种植这些栽培种主要用于获得制成纺织品的种子纤维。由于棉花的成熟干纤维以一种能够由其纺成细而结实的线的方式捻在一起，因而棉花适于作为纺织纤维。其它产品，比如棉籽油、油饼和棉籽绒是纤维生产的副产品。每年全世界昆虫害虫对棉花作物的损害导致显著的产量下降。对这些害虫的有效控制从而使产量下降减少到最低程度具有重要的经济意义。棉花昆虫害虫的例子包括甜菜夜蛾(&^/o;^eraei/^;a)，棉铃象U/^力o/7cwz/s^ra/7^/s^ra/7tf/s)，粉紋夜械(rr2'c力op/i/s/a/22.)，云纟丈盲棒(Afewroco7/7iAy/"6/7i/s")，才帛坊(J;7力/'sgossy;7//),谷实夜織(^e72.ocore,;a,"t刀才艮虫(丰立肤地虎(尸e/〃asy6fei"rs/7ea/)，豆杂色夜蛾(尸er他o鹏sai/c/a)，小地老虎(^r"/、//7"7o")),欧洲玉米螟(<^r/"/a/7w627a//'s)，草地贪夜蛾(5^油/^era/Vw^7;e油)，Pinkbollworm(户ec〃刀o/7力era)，花蓟马属(尸/^/^///^//<3s卯.),大豆夜蛾(/^ei/c^7ys/a//7c/uf/e/251)，蝽象(稻绿蝽(yVezarar/Wc^/7a),喜绿蝽(Jcrc^ei77咖力2'/are),褐臭蝽(五i/sc/n'"wsser,))，牧草盲蝽U/^""eo/ar/力,烟蜂夜蛾07e/io^/sF2'resce/2S)和粉氛(结翅粉氛(rr7a7ewrof/esa6i/f2'/o/2ea),甘薯粉虱(to7/s/afa6sc/))。如今，棉花植物的转化和再生已经是一个建立得很完善的流程，主要基于根癌农杆菌介导的外源DNA向棉花植物部分的转化以及所述棉花植物部分在组织培养中再生成完全能育性转基因棉花植林。需要产生一种新的抗昆虫棉花植物，由此减少由昆虫害虫对棉花作物的损害导致的产量下降。抗昆虫棉植物可减少可能对其它有益昆虫以及环境有害的化学杀虫剂的应用需求。尤其是，想要提供一种替代含有来自苏云金芽孢杆菌的CrylAc基因的转基因植物的抗昆虫植物。本发明提供，尤其是，一种特定的棉花事件(下文中称作"CE43-67B")及其鉴定方法。该特定的事件是主要是基于其农艺表现、功效和分子特征选择出的。据信，主要根据转化过程中的转基因整合位点，该事件的特征远远优于类似的转化体。本申请上下文中的"CE43-67B事件"指本文所述的原始杀昆虫转基因棉花植物以及任何由其衍生的植物材料，包括种子。本文中所指的"杀昆虫"指对昆虫的任何抑制效果，包括但不限于降低摄食、生长迟緩、生殖力下降、麻痹或死亡。"生殖力"包括涉及繁殖的所有方面，比如繁殖能力、繁殖频率和后代数量。本发明中还包括衍生自CE43-67B事件的任何植物材料，包括种子。CE43_67B事件表现出包含至少一个表达盒的新基因型。该表达盒包含与编码CrylAb杀昆虫毒素的基因可操作性相连的用于在植物中表达的适当启动子(所述毒素可用于控制广谱鳞翅类昆虫害虫)以及适宜的多腺苷酸化信号。适宜的启动子可分离自，尤其是，植物。许多植物启动子已被分离并分析特征，包括组成型的、可转换的和/或组织特异性的启动子。适宜的启动子可选择下述，但不限于此CaMV35S、FMV35S、UbiquiUn(遍在蛋白)、Act2、N0S、0CS、夜香树属黄叶巻曲病毒(Cestrumyellowleafcurlvirus)启动子、Patatin、E9、alcA/alcR开关、GST开关、RMS开关、油质蛋白、Gelvin、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基、肌动蛋白7、MR7启动子(玉米)、Gos9(水稻)、G0S2启动子、Mas0cs(或超启动子)、RolD启动子(毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes))、SuperMAS启动子和Suc2启动子(拟南芥属(Arabidopsis))。在本发明的一种实施方案中，该启动子是来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的肌动蛋白启动子，ACT2。为提高基因表达水平，该表达盒中还可以整合进比如增强子序列这样的其它元件，例如转录或翻译增强子，比如烟草蚀刻病毒(TEV)翻译激活子，CaMV35S增强子和FMV35S增强子。或者，也可能希望包括靶向序列，例如，以指导CrylAb毒素转运至特定细胞区室。例如，想要提供提供胞外蛋白的话，则可将胞外靶向序列与编码CrylAb蛋白的多核苷酸连接。粑向的另一个例子包括，靶向特定的胞内细胞器或区室，例如用"KDEL"保持序列靶向内质网。许多多腺苷酸化信号已被分离并分析特征。在植物中发挥功能的适当多腺苷酸化信号的例子包括来自根癌农杆菌胭脂碱合酶基因(nos)的、来自蛋白酶抑制剂II基因和来自oc-微管蛋白基因的那些(EP-A652,286)。在本发明的一种实施方案中，多腺苷酸化信号是来自根癌农杆菌的NO基因的多腺苷酸化信号。编码CrylAb蛋白的多核苷酸可以是经过密码子优化的或者在其它方面经过改变的从而一旦引入植物材料中后增强例如翻译。这样的密码子优化也可用于改变在任何转化细胞中产生的RM转录体预计的二级结构，或者破坏存在于未改变转录体中的隐秘的RNA不稳定性元件，由此提高转化细胞中转录体的稳定性和/或可利用性(AblerandGreen(1996)PlantMolecularBiology(32)第63—78页)。密码子优化还可用于改变异源DM编码序列，由此更接近地类似于宿主基因的编码序列。例如，可以对细菌基因做密码子优化以提高胞嗜咬和鸟嘌呤碱基对腺噤呤和胸腺嘧咬碱基的比例，由此它更接近地类似于植物(例如棉花或玉米)基因，但仍然编码相同的蛋白。这样的密码子优化可根据标准密码子使用表来完成。在CE43-67B事件的一个前体中，存在包含在表达时可用作选择标记的基因的第二盒。许多选择标记已被表征，包括一些赋予抗生素耐受性的以及其它一些赋予除草剂耐受性的。适宜的选择标记基因的例子包括那些赋予潮霉素、卡那霉素和庆大霉素耐受性的基因。其它适宜的选择标记包括赋予除草剂(比如基于草甘膦的除草剂)抗性的基因或者赋予毒素(比如eutypine)抗性的基因。还可得到其它选择形式，比如基于激素的选择系统，比如HiroyrasuEbinuma等人(1997)PNASVol.94pp.2117-2121的MultiAutoTransformation(MAT)系统；^使用已知绿色荧光蛋白，Pglucoronidase的可视化选择系统；以及任何其它选择系统，比如甘露糖异构酶(Positech)、木糖异构酶和2-脱氧葡萄糖(2-DOG)。在本发明的一种实施方案中，选择标记基因是一种赋予潮霉素耐性的基因。这第二个表达盒可用于在植物转化过程中或之后选择转化体。可选地，可以在转化后将其从CE43-67B事件前体中分离出来而仅保留CE43-67B事件本身。CE43-67B事件本身不含选择标记盒。其它的表达盒可选地包括在CE43-67B事件中。例如，这些表达盒可以提供编码不同杀昆虫毒素比如VIP3A的基因。作为替代方案，这些表达盒可提供其它令人满意的效果，比如除草剂抗性。这些表达盒可以在相同或不同的质粒上被导入植物。如果表达盒存在于同一质粒上并经农杆菌介导的转化方法被导入植物中，则它们可以存在于相同或不同的T-DNA区域内。在本发明的一种实施方案中，两个表达盒存在于不同质粒内的不同T-DNA区域上。根据本发明，提供了一种含有含如SEQIDN0:l所示序列的笫一区和含如SEQIDNO:2所示序列的第二区的多核普酸。在又一种实施方案中，所述多核苷酸含有可以通过扩增反应扩增出来的区域，所述扩增反应使用如SEQIDNO:5和6或SEQIDNO:ll和U所示的引物。在又一种实施方案中，所迷多核苷酸还含有编码来自苏云金芽孢杆菌的CrylAb基因的区域。在又一种实施方案中，所述多核苷酸含有提供与所述CrylAb基因可操作性相连的拟南芥属肌动蛋白启动子。在本发明的又一个方面提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:3所示序列中至少18个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:3所示序列中至少20个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:3所示序列中至少25个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:3所示序列。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少35个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少40个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少50个连续核苦酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列。还提供了一种多核苷酸，其含有SEQIDNO:1的至少50、100、150、200、300、400或500个连续核苷酸，所述多核苦酸包含SEQIDNO:1第275和276位核苷酸之间的核苷酸连接点(junction)。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:l所示序列。还提供了与上述序列互补的序列。在本发明的又一个方面提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:4所示序列中至少18个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:4所示序列中至少20个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:4所示序列中至少25个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:4所示序列。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少35个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少40个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDN0:2第104~163位核苷酸所示序列中至少50个连续核苷酸。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列。还提供了一种多核苷酸，其含有SEQIDNO:2的至少50、100、150、200、300、400或500个连续核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:2第133和134位核苷酸之间的核苷酸连接点。还提供了一种多核苷酸，其含有如SEQIDNO:2所示序列。还提供了与上述序列互补的序列。在又一种实施方案中，提供了含有上述多核苷酸的棉花植物。在又一种实施方案中，提供了含有上述多核苷酸的棉花种子。在又一种实施方案中，所述植物是作为CE43-67B事件前体的杀昆虫棉花植物，CE43-67B事件本身，或者是从其衍生的仍然包含上述多核普酸的植物。在又一种实施方案中，所述植物含有第二表达盒。在一种实施方案中，所述第二表达盒编码VIP3A杀昆虫毒素。在另一种实施方案中，所述第二表达盒编码提供除草剂抗性的蛋白质，所述除草剂包括草甘膦酸或其农业可接受盐。本领域技术人员熟悉植物转化方法。尤其是，已在广泛植物种中表征过两种主要技术农杆菌转化和通过直接DM转移的转化。农杆菌介导的转化是一种双子叶植物常用转化方法。将欲导入植物的外源DNA克隆进二元载体的左右边界共有序列之间。此为T-DNA区。将二元载体转移进农杆菌细胞，其随后用于感染植物组织。含有外源DM的载体T-DNA区被插入植物基因组。标记基因盒和性状基因盒可存在于相同载体的同一T-DM区、不同T-DNA区，或者甚至是不同载体的不同T-DNA区。在本发明的一种实施方案中，该盒存在于不同载体的不同T-DNA区。作为替代方案，直接DNA转移可用于将DNA直接导入植物细胞。一种适宜的直接转移方法可以是借助粒子枪用含有待插入DNA的载体对植物细胞进行轰击(粒子介导的生物射弹转化)；另一种已经建立的方法，"whiskers"，涉及将DM包被到将刺入细胞的碳化硅纤维上。其它转化植物细胞的方法包括原生质体转化(可选地在聚乙二醇存在下)；在含有多核苷酸或载体的介质中对植物组织、细胞或原生质体进行超声波；多核苷酸或栽体显微插入植物材料(可选地使用已知的碳化硅"whiskers"技术)、电穿孔法等。转化后，从转化植物组织再生出转基因植物，利用比如潮霉素抗性这样的适宜标记来选择带有外源DNA的后代。技术人员熟悉适宜的再生培养基组成。可通过常规的植物育种方法将可选择标记与转基因事件中分离，由此得到例如CE43-67B事件。如本文所述，本发明的植物对可能侵袭它的来自选自实夜蛾属(Heliothissp.)和Helicoverpasp.的一个或多个种的昆虫有杀昆虫作用。本文所使用的"侵袭，，指被一或多种昆虫以任何方式攻击、定居、进食或损害。这样，例如，本发明的植物将提供对抗比如谷实夜蛾(Helicoverpazea)这样的昆虫害虫侵袭的自我防御机制。因此，与相同品种的非转基因棉花植物相比，在栽种所述植物过程中将需要喷洒更少的杀虫剂，并将由昆虫害虫导致的产量损失控制在一个最低的水平。本发明不限于CE43-67B事件本身，而是还延伸至包括由其衍生的任何植物材料，包括种子，只要它们包含至少一种本发明的多核苷酸。本发明包括，但不限于源自与CE43-67B事件育种杂交的植物，或通过常规育种或其它方法得到的衍生物。本发明还包括衍生自CE43-67B的植物材料，其与CE43-67B事件相比可含有额外的、经修饰的或更少的多核苷酸序列或表现出其它的表型特征。例如，可能期望对衍生自CE43-67B事件的植物材料进行转化从而产生一种具有另外的性状，比如第二种抗昆虫基因，的新事件。这一过程称为基因堆积(genestacking)。第二种昆虫抗性基因可编码，例如抗昆虫凝集素、抗昆虫蛋白酶抑制剂和源自苏云金芽孢杆菌、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdusnematophilus)或发光光杆状菌(Photorabdusluminescens)物种的杀昆虫蛋白质。在一个方面，第二种昆虫抗性基因编码来自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫基因。优选地，第二种昆虫抗性基因编码来自细菌苏云金芽孢杆菌的VIP基因，该VIP基因产生具有与CrylAb不同的作用方式或在昆虫肠道内不同的结合位点的毒素以控制不同的昆虫种。该VIP基因可以是，例如VIP3A。本发明还提供衍生自CE43-67B事件的植物材料，其具有比如除草剂抗性、线虫抗性或真菌抗性这样的其它性状。在一种实施方案中，所述性状是除草剂抗性。除草剂抗性性状可通过，例如，除草剂降解酶、或靶位点特异性抗性酶来提供。在又一种实施方案中，所述除草剂抗性性状提供对包括草甘膦酸或其农业可接受盐的除草剂的抗性。在又一种实施方案中，所述除草剂抗性性状由编码EPSP合酶或其突变体的基因提供。本发明还提供一种控制昆虫的方法，包括在所述昆虫取食的场所提供CE43-67B事件或衍生自CE43-67B事件的植物材料。本发明还提高一种控制昆虫的方法，包括在所述昆虫取食的场所提供CE43-67B事件或衍生自CE43-67B事件的植物材料，并向所述植物材料应用其它的农业化学物质，比如除草剂、杀真菌剂和其它的包括其它杀昆虫蛋白在内的杀昆虫化合物。可能的杀昆虫化合物的例子包括杀昆虫凝集素、杀衍生虫蛋白酶抑制剂和来自苏云金芽孢杆菌、嗜线虫致病杆菌或发光光杆状菌的杀昆虫蛋白。可能的化合物的例子包括除虫菊酯类、氨基甲酸醌类、吡虫啉、有机氯制剂和比如多杀菌素、阿维菌素或依马菌素这样的大分子。本发明还提供检测衍生自CE43-67B事件的植物材料的方法，所述方法包括(a)制备含待测植物材料基因组DM的样品；(b)获得适用于扩增反应以扩增选自以下的序列的引物对(i)含如SEQIDNO:3所示序列中至少18个连续核苷酸的序列及其互补序列和(ii)含如SEQIDNO:4所示序列中至少18个连续核苷酸的序列及其互补序列；(c)将所述引物对加入到所述样品以及用于实施扩增反应的工具中；(d)实施扩增反应；和(e)将扩增得到的序列可视化。根据本发明的方法，有许多扩增方法可以使用。基本原理，本领域技术人员的一项已知技术，是聚合酶链式反应(PCR)。PCR反应的是在用琼脂糖凝胶电泳进行大小分离之后。在本发明的一种特定实施方案中，可以使用比如TaqManTM这样的PCR变化方法。这样的技术涉及用荧光染料对扩增过程中的至少一种引物进行标记。如果未结合，则引物会采取一种导致无法检测到萸光的构象。然而，当引物结合到一段DNA上时，则构象发生变化，能够检测到焚光。通过这种方式，可以对扩增过程进行实时控制，荧光强度直接对应于扩增水平。TaqManTM分析可用于例如检测野生型棉花背景中CE43-67B事件的存在，或者在其它种质中检测CE43-67B的偶然存在。本发明的其它实施方案包括但不限于RACEPCR。本发明的又一实施方案涉及用多重PCR(multiplexPCR)来区分纯合CE43-67B植物材料和杂合CE43-67B植物材料。这是本领域技术人员已知的合子型测试(zygositytest)，涉及使用与棉花基因组和/或插入DNA的特定部分结合的三种PCR引物。特定大小的两种扩增产物每一种的存在或缺少表示测试样品是否为CE43-67B纯合或杂合。适宜在这样的合子型测试中使用的引物如SEQIDN05、6和8所示。可以在这样的合子型测试中使用的替代适宜引物如SEQIDNO10、11和12所示。也可以利用用不同的荧光探针标记的引物来设计合子型测试，由此扩增产物的焚光颜色表示测试样品是否为CE43-67B纯合或杂合。本发明还提供检测包含如SEQIDNO:1所示的多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制备含有待测植物基因组DNA的样品；(b)获得适用于在扩增反应中扩增出含有如SEQIDNO:3所示序列中至少18个连续核苷酸的序列及其互补序列的引物对；(c)将所述引物对加入到所述样品和用于实施扩增反应的工具中；(d)实施扩增反应；和(e)将扩增到的序列可视化。本发明还提供一种如上所述的方法，其中所述引物适用于在扩增反应中扩增出含如SEQIDNO:3所示序列中至少20个连续核苷酸的序列及其互补序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增出含如SEQIDNO:3所示序列中至少25个连续核苷酸的序列及其互补序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增出含如SEQIDNO:3所示序列的序列及其互补序列。本发明还提供一种如上所述的方法，其中将被所述扩增反应扩增出的序列含有包含如SEQIDNO:l核苷酸275/276提供的基因組序歹'J-转基因盒插入物的核苷酸连接点(g-g)的序列。本领域技术人员将理解，该连接点可用于表征并由此鉴定该事件，并且设计和产生适用于在扩增反应中扩增含有前述连接点的序列的寡核苷酸引物序列，是在所述技术人员熟练掌握范围内的。本领域技术人员还可以理解，可以根据位于SEQIDNO:1的第一位核苷酸5，(也即上游)的基因组序列和位于SEQIDNO:1的第545位核苷酸3，(也即下游)的插入物或基因组序列来设计适用于扩增反应的引物序列。本发明还提供一种检测含有如SEQIDNO:1所示的多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制备含待测植物基因组DNA的样品；(b)获得适用于扩增反应以扩增含如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少35个连续核苷酸的序列及其互补序列的引物对；(c)将所述引物对加入到所述样品以及用于实施扩增反应的工具中；(d)实施扩增反应；和(e)将扩增得到的序列可视化。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少40个连续核苷酸的序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列中至少50个连续核苷酸的序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含如SEQIDNO:1第246~305位核苷酸所示序列的序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含如SEQIDNO:1中至少50、100、150、200、300、400或500个连续核苷酸的序列，所述序列包含SEQIDNO:1笫275和276之间的核苷酸连接点。以上所提及的引物适用于在扩增反应中扩增以上提到的序列及其互补序列。本发明还提供作为上述方法的扩增产物的序列。本发明还提供所述序列的互补序列。本发明还提供一种上述方法，其中的扩增产物包含上述序列。本发明还提供一种上述方法，其中所述引物对包含正向引物，其含有当以5，^3，方向读取时与如SEQIDNO:1核苷酸1275所示序列的区域相同的序列，和反向引物，其含有当以5，+3，方向读取时与如SEQIDNO:1核苷酸276~545所示序列的反向互补序列的区域相同的序列。本领域技术人员将认识到，可以根据本文所提供的序列及其互补序列创造出许多适用于本发明方法的引物。此外，如以上所提到的，这样的引物序列可以基于如SEQIDN0:1所示序列5，和3，(上游和下游)的序列，而且鉴定这样的5，和3，序列是在本领域技术人员熟练能力范围内的。在本发明的一种特定实施方案中，所述引物对含有SEQIDNO:5和6所示的序列。在本发明的又一种实施方案中，所述引物对含有如SEQIDNO:9和10所示的序列。在本发明的又一种实施方案中，所述引物对含有如SEQIDNO:11和12所示的序列。本发明还提供一种检测包含如SEQIDNO:2所示的多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制备包含待测植物基因组DNA的样品；(b)获得适用于在扩增反应中扩增含有如SEQIDNO:4所示序列中至少18个连续核苷酸的序列及其互补序列；(c)将所述引物对加入到所述样品和实施扩增反应的工具中；(d)实施扩增反应；和(e)将扩增到的序列可视化。本发明还提供一种如上所述的方法，所述引物适用于在扩增反应中扩增含有如SEQIDNO:4所示序列中至少20个连续核苷酸的序列及其互补序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含有如SEQIDNO:4所示序列中至少25个连续核苷酸的序列及其互补序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含有如SEQIDNO:4所示序列的序列及其互补序列。本发明还提供一种如上所述的方法，其中将被所述扩增反应扩增出的序列含有包含如SEQIDNO:2核苷酸133/134提供的转基因盒插入物-基因组序列的核苷酸连接点(t-a)的序列。本领域技术人员将理解，该连接点可用于表征并由此鉴定该事件，并且设计和产生适用于在扩增反应中扩增含有前述连接点的序列的寡核苷酸引物序列，是在所述技术人员熟练掌握范围内的。本领域技术人员还可以理解，可以根据位于SEQIDNO:2的笫一位核苷酸5，(也即上游)的插入物或基因组序列和位于SEQIDNO:2的第1198位核苷酸3，(也即下游)的基因组序列来设计适用于扩增反应的引物序列。本发明还提供一种检测含有如SEQIDNO:2所示的多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制备含待测植物基因组DNA的样品；(b)获得适用于扩增反应以扩增含如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少35个连续核苷酸的序列及其互补序列的引物对；(c)将所述引物对加入到所述样品以及用于实施扩增反应的工具中；(d)实施扩增反应；和(e)将扩增得到的序列可视化。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少40个连续核苷酸的序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列中至少50个连续核苷酸的序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含如SEQIDNO:2第104~163位核苷酸所示序列的序列。在又一种实施方案中，所述引物适用于在扩增反应中扩增含如SEQIDNO:2中至少50、100、150、200、300、400或500个连续核苷酸的序列，所述序列包含SEQIDNO:2第133和134位核苷酸之间的核苷酸连接点。以上所提及的引物适用于在扩增反应中扩增以上提到的序列及其互补序列。本发明还提供作为上述方法的扩增产物的序列。本发明还提供所述序列的互补序列。本发明还提供一种上述方法，其中的扩增产物包含上述序列。本发明还提供一种上述方法，其中所述引物对包含正向引物，其含有当以5，+3，方向读取时与如SEQIDN0:2核苷酸1~133所示序列的区域相同的序列，和反向引物，其含有当以5，+3，方向读取时与如SEQIDN0:2核苷酸134~1198所示序列的反向互补序列的区域相同的序列。本领域技术人员将认识到，可以根据本文所提供的序列及其互补序列创造出许多适用于本发明方法的引物。此外，如以上所提到的，这样的引物序列可以基于如SEQIDNO:2所示序列5，和3，(上游和下游)的序列，而且鉴定这样的5，和3，序列是在本领域技术人员熟练能力范围内的。本发明还提供一种检测衍生自CE43-67B事件的植物材料的方法，所述方法包括(a)制备含待测植物基因组DNA的样品；(b)获得能够与选自以下的序列杂交的探针含如SEQIDNO:3所示序列中至少18个连续核苷酸的序列和含如SEQIDN0:4所示序列中至少18个连续核苷酸的序列；(c)在允许所述探针与所述样品中的互补核酸杂交的条件下，将至少一种步骤(b)的探针加入到所述样品中；(d)通过洗涤除去实质上未杂交的探针；和(e)检测由此杂交的探针以鉴定该样品是否来自CEC-67B事件。本发明还提供一种检测包含如SEQIDNO:1所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制备含待测植物基因組DNA的样品；(b)获得能够与含如SEQIDNO:3所示序列中至少18个连续核苷酸的序列杂交的探针；(c)在允许所述探针与所述样品中的互补核酸杂交的条件下，将探针加入到所述样品中；(d)通过洗涤除去实质上未杂交的探针；和(e)检测由此杂交的探针以鉴定该样品是否包含所述多核苷酸。本发明还提供一种检测包含如SEQIDNO:2所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括(a)制备含待测植物基因组DNA的样品；(b)获得能够与含如SEQIDNO:4所示序列中至少18个连续核苷酸的序列杂交的探针；(c)在允许所述探针与所述样品中的互补核酸杂交的条件下，将探针加入到所述样品中；(d)通过洗涤除去实质上未杂交的探针；和(e)检测由此杂交的探针以鉴定该样品是否包含所述多核苷酸。在上述方法的一种特定实施方案中，所述探针含有至少20个连续核苷酸。在所述方法的又一种实施方案中，所述探针含有SEQIDNO:1的至少50、100、150、200、300、400或500个连续核普酸，所述探针包含SEQIDNO:1第275和276位核苷酸之间的核苷酸连接点，或SEQIDNO:2的至少50、100、150、200、300、400或500个连续核苷酸，所述探针包含SEQIDNO:2的第133和134位核苷酸之间的核苷酸连接点。在本发明的又一种实施方案中，所述探针可含有本说明书内所述的相关多核苷酸的片段。尤其是，所述探针可含有能够与表现本申请所述事件特征的序列杂交的多核苷酸序列。在所述方法又一种实施方案中，所述洗涤发生在高严紧条件下。可以采用本领域技术人员熟知的方法产生和标记所述探针。该探针可以是，例如，PCR产物或限制性消化片段。在又一种实施方案中，本文所述的探针可以用荧光、放射性、酶或其它适宜的标记物进行标记以使得杂交可被检测。在本发明的又一种实施方案中，提供了一种在严紧条件下将探针与样品中互补核酸杂交并检测该探针是否已杂交的方法。高严紧杂交条件是本领域技术人员熟知的，包括，例如在约65'C下在包含6xSSC、0.01。/。SDS和0.25%脱脂奶粉的溶液中进行杂交，之后在相同的温度下在含有0.2xSSC和0.1%SDS的溶液中洗涤。技术人员也可以选择以下杂交条件，即，于6065。C之间，在含有0.1%SDS的0.3倍强度柠檬酸盐緩沖盐水中进行杂交，之后在相同的温度下用含有0.1%SDS的0.3倍强度柠檬酸盐緩冲盐水洗涤。本领域技术人员还可以选择可同等理解为"高严紧"条件的其它杂交条件。基于杂交原则的用于检测来自本文所述事件的植物材料的适宜方法包括但不限于Southern印迹、Northern印迹和原位杂交。技术人员熟悉这些技术。通常，它们包括将探针与样品孵育，洗涤除去未结合探针，以及检测探针是否已杂交。所述检测方法依赖于附着在探针上的标签类型一一例如，放射性标记的探针可通过暴露在X射线膜上并显影来检测。作为选择，酶标探针可通过底物转化从而产生颜色变化来检测。又一方面，提供了一种鉴定含有CE43-67B事件的植物的方法，所述方法包括(a)制备含待测植物基因组DM的样品；(b)经限制酶消化所述DNA;(c)分离消化的DNA片段并将由此分离的片段转移到膜上；(d)用如上述所设计的探针探测由此结合的片段，所述探针已被标记以使其可视化；(e)除去实质上未杂交的探针；和(f)检测由此杂交的探针，其中所述事件可以通过与具有特定大小的片段杂交的所述探针来表征。在有一方面，提供了一种能够通过根据本发明的方法鉴定的棉花事件。在一种特定实施方案中，所述方法是根据前述段落的方法。本公开文本还包括一种检测包含能够被SEQIDNO:7所示多核苷酸编码的蛋白质的植物的方法，所述方法包括(a)制备待测植物的蛋白质提取物；(b)提供能够与来自苏云金芽孢杆菌的CrylAb蛋白结合的抗体；(c)在允许所述抗体与所述提取物中的所述蛋白质结合的条件下将所述抗体加入到所述提取物中；和(d)检测由此结合的抗体从而鉴定该提取物是否含有所述蛋白。本公开文本还包括一种检测含有来自苏云金芽孢杆菌的CrylAb基因的植物的方法，所述方法包括(a)制备待测植物的蛋白质提取物；(b)提供能够与来自苏云金芽孢杆菌的CrylAb蛋白结合的抗体；件下将所述抗体加入到所述提取物中或将所述提取物加入到所述抗体中；和(d)检测由此结合的抗体从而鉴定该提取物是否含有所述CrylAb蛋白。该方法可用于区分表达CrylAb的植物，比如含有CE43-67B的植物，和不表达CrylAb的植物。以抗体结合为基础的检测衍生自本文所述事件的植物材料的适宜方法包括但不限于Western印迹、酶联免疫吸附检测法(ELISA)和SELDI质谱分析法。技术人员熟悉这些方法和其它的免疫学技术。通常的步骤包括将样品与结合所述蛋白的抗体孵育，洗涤除去未结合抗体，并检测抗体是否已结合。许多这样的检测方法是以酶反应——比如抗体可以用比如辣才艮过氧化物酶这样的酶作标记——以及应用适宜的底物、检测颜色改变为基础的。适宜的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本公开文本还包括一种检测衍生自本文所述事件的植物材料的方法，所述方法包括获得用于分析的样品；制备样品的蛋白质提取物；提供设计用于检测样品中存在的所述蛋白之存在的测试条或dipstick;将测试条或dipstick与样品孵育；并检测所述蛋白是否存在。本方法可以是用于本文所述事件的基于抗体的检测方法，并使用测试条或或dipsticks。通常的步骤包括将测试条或dipstick与样品进行孵育，并观察测试条或dipstick上有色条带的有无。有色条带指示样品中蛋白的存在。这样的测试条或dipstick测试通常是蛋白特异性的，且可用于该领域的快速样品测试。在一种实施方案中，免疫学方法或dipstick利用SEQIDNO:7所编码的来自苏云金芽孢杆菌的CrylAb基因特异的一种或多种抗体或其一种或多种片段。抗体片段包括但不限于，Fab、经修饰的Fab、diFab、Fab，、F(ab，)2或FV片段，免疫球蛋白轻链或重链单体、单链FV(scFV)或纳米抗体(nanobody)。抗体或其片段可以是单克隆或多克隆的。在一种特定实施方案中，抗体是由选自DSMACC2723和DSMACC2724(二者均于2005年5月12日保藏于德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)，MascheroderWeglb，38124Braunschweig,德国)的细胞系分泌的抗体，或能够抑制由选自DSMACC2723和DSMACC2724的细胞系分泌的抗体与CrylAb结合的抗体。可以注意到，生产单克隆和多克隆抗体及其片段的方法是本领域熟知的。适宜的测试条或dipsticks以及它们的使用材料描述于PCT申请W002/27322中，例如，是一种由塑料底支持的含有醋酸纤维素、纤维素、硝化纤维素或尼龙的检测膜的側流免疫条。这样的免疫条可以用其中液体样品通过毛细作用被抽吸的薄膜或滤膜来制造。当样品中的蛋白沿条带纵向移动时，它与免疫条中所含的抗体反应并被捕获在一条将可视的线上。适宜的检测方法是，例如，胶体金和有色乳胶珠。在一种特定施方案中，在由塑料底支持的硝化纤维素适当制成的测试条上喷洒一条如上述的特异抗-CrylAb抗体线。在该第一抗体线的上方平行喷洒一条抗-小鼠抗体的试剂对照线。该膜的顶部一侧为一块吸收块，底部一侧为一块含有干燥胶体金标记的抗-CrylAb抗体。在一种优选实施方案，胶体金标记的抗-CrylAb抗体不同于喷洒在测试线的第一抗体。在一种特定实施方案，该胶体金标记的抗-CrylAb抗体是由细胞系DSMACC2723分泌的抗体，喷洒在测试线的抗体是由细胞系DSMACC2724分泌的抗体。样品施加块在胶体金块侧边。使用时，将样品施加块放在所提取组织的样品中，或者将该样品以另一种方式应用到该块上，例如，通过滴管。样品中所含的任何CrylAb蛋白在测试条上流动，并被胶体金标记的抗-CrylAb抗体结合。当其继续在测试条上移动，蛋白还会被测试线处的抗-CrylAb抗体结合。多余的金缀合物在试剂对照线被捕获。在阳性测试中，也即，如果CrylAb存在于样品中，会出现双红线下部的线指示CrylAb的存在，而上部的线是指示装置正确工作的对照线。在本发明的又一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒含有以下部分上述引物对，和实施上述方法的说明，和实施扩增反应的工具，以及可选的用于制备待测样品的工具。在又一种实施方案中，提供了一种含有包括以下部分的试剂盒上述抗体，实施上述方法的说明，实施上述方法的工具，和可选的制备待测样品的工具。在本发明的又一种实施方案中，所述试剂盒可包含DNA扩增一检测技术，比如PCR或TaqManTM。在本发明的又一种实施方案中，所述试剂盒可包含探针杂交一检领，J才支术，t匕如Southern-卩迹、Northern印迹或/f4立杂交。在本发明的另一种实施方案中，所述试剂盒可包含抗体结合-检测技术，比如Western印迹、ELISA，s、SELDI质^普法、测试条或dipsticks。在本发明的又一种实施方案中，所述试剂盒可包含前述检测技术的任意组合。在又一种实施方案中，所述试剂盒可包含说明书形式的一或多种上述方法。又一方面提供了一种用于育种方法的根据本发明的植物或种子。例如，这些植物可用于将提供昆虫抗性的性状转移到同属但具有不同背景种质的植物中去。这样的向不同种质的育种可能是所期望的，如果该植物要在需要可替代种质的条件下种植。可用于将性状转移到不同背景种质中去的育种方法是本领域熟知的。在本发明的又一方面提供了用根据本发明的植物或种子来产生外植体材料的用途，所述外植体材料用于用其它遗传性状转化所述外植体的方法中。一旦提供了能够用本发明的方法鉴定的事件，则产生这样的外植体材料并将其用于转化程序是本领域技术人员能力范围内的。此外，一旦提供了能够用本发明的方法鉴定的事件，则将所述事件用于本文所述的育种方法是本领域技术人员能力范围内的。根据本发明，提供了将一或多种上述的本发核苷酸用于检测CE43-67B事件的用途。在一种实施方案中，所述多核苷酸可用于如上所述的检测CE43-67B事件的方法中。实施例通过以下非限制性实施例和相关序列表，本发明将更为清楚SEQIDNOl:CE43-67B事件基因物组序列-插入物SEQIDNO2)CE43-67B事件插入物-基因组序列SEQIDNO3:CE43-67B事件基因组序列-插入物连接点SEQIDNO4:CE43-67B事件插入物-基因组序列连接点SEQIDNO5-6:CE43-67B事件引物SEQIDNO7)CE43-67B事件:CrylAb基因序列SEQIDNO8-19:CE43-67B事件引物实施例l:克隆和转化1.1载体克隆釆用对来自内部载体的片段进行限制性消化和连接的标准基因克隆技术构建了转化栽体pN0V1914和pN0V4641。载体pN0V1914包括一个含有Ubiquitin(UBQ3)启动子、UBQ3内含子、编码赋予潮霉素抗性的蛋白质的基因序列以及nos多腺苷酸化序列的可选择标记盒。载体pN0V4641包括革巴基因的表达盒，该表达盒含有肌动蛋白(ACT2)启动子、ACT2内含子、已针对在玉米中表达进行了密码子优化的编码CrylAb基因的序列、以及nos多腺苷酸化序列。采用标准农杆菌转化技术将这些栽体转化进根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌林GV3101,并通过抗生素抗性选择出转化细胞。1.2植物转化通过农杆菌介导的对陆地棉Coker312载培种(GossypiumhirsutumL.cvCoker312)的转化产生了CE43-67B事件。将Coker312种子播种于温室中。从3至5周龄植林上切取幼嫩叶柄，并浸没在70%乙醇中灭菌。之后将叶柄浸没在5°/。Clorox+2ml/lTween20溶液中20分钟。将叶柄在(1犯20中洗涤三次。切除叶柄端部，并将叶柄转移至叶柄预培养基(4.3g/lMS盐、B5维生素(lQQmg/l肌醇、lmg/l烟酸、lmg/l盐酸吡多醇、10mg/l盐酸硫胺素)、30g/l葡萄糖、2.4g/1phytogel,pH7.0)中，并在光照下于30。C预培养3天。2ml含有pNOV1914和pN0V4641构建体的农杆菌培养物在适当的抗生素中生长过夜，之后用液体MMS1培养基(4.3g/lMS盐、B5维生素(100mg/l肌醇、1mg/l烟酸、lmg/l盐酸吡多醇、10mg/l盐酸硫胺素)、0.05rag/l2,4-D、0.lmg/l激动剂、30g/l葡萄糖、pH6.5)稀释至OD"q介于0.1~0.2。切除叶柄端部，将叶柄置于无菌培养皿中的10~20ml的细菌溶液中。一旦进入该溶液，即将叶柄纵向切割然后切成2cm切片。叶柄外植体在细菌溶液中浸泡5~10分钟后，将它们转移到铺有无菌滤纸的共培养平板(配方与液体MMS1相同，再加入2.4g/1Phytagel)上，使其在低光强度、24。C下共培养4872小时。将共培养的外植体转移到含有500mg/l头孢噢將和10mg/l潮霉素的MMS1培养基(配方与固S1液体培养基相同，再加入2.4g/lPhytagel)，并在16小时光照和8小时黑暗的光循环下、30。C培养。两周后、以及此后每4~6周将外植体转移到新鲜培养基上，直至愈伤组织形成。一旦愈伤组织长至豌豆大小，即将它们从外植体上取下并转移到含有500mg/l头孢塞將和10mg/l潮霉素的新鲜MMS1培养基上，并通过适当地每4周继代培养来维持。将1.5g愈伤组织彻底打碎，并置于含有10ml液体MMS2培养基(4.3g/lMS盐、B5维生素(lOOfflg/1肌醇、lmg/l烟酸、lmg/1盐酸吡多醇、10mg/l盐酸硫胺素)、L9g/1KN03、30g/l葡萄糖，pH6.5)的50ml三角瓶中。30°C、光照下以100rpm的转速将悬浮愈伤组织振荡两周。用醒S2液体培养基洗涤这些悬浮培养细胞3次，重悬浮，并接种至固体画S2培养基(配方与液体MMS2培养基相同，另加入2.4g/Lphytogel)上。一旦接种后，除去过量的液体画S2培养基，并在3(TC、光照下培养平板。每周检查平板上的体细胞胚发育。体细胞胚在1~2个月内形成。此液体悬浮步骤可重复多次直至胚胎发生性愈伤组织或体细胞胚形成。将体细胞胚转移到EG(胚状体萌发)培养基(2.65g/lMS盐改良No.4(Duchefa)、1.9g/lKN03，B5维生素(同前)、30g/l葡萄糖、lg/1谷氨酰胺和0.5g/l天冬酰胺，pH6.5)，并每34周继代培养到新鲜EG培养基上。一旦体细胞胚变绿且大于2cm，即将它们根朝下植于EG培养基中。在所有再生阶段，均要预防生长中的小植林触及容器盖子或侧面以预防叶片脱落。将带有1~2片真叶的萌发胚转移到175mlGreiner容器中的EG培养基上。将带有真叶的强壮小植林转移到175mlGreiner容器中吸饱了犯20的无菌泥炭塞中，并转移到3英寸花盆的泥炭中。在30。C下14小时日照和20'C下10小时黑暗的条件下，在高湿度的种植室的植物种植器中驯化植物。一旦看到盆的排水孔中有根长出，即将它们转移到更大的含50%JohnInnesNo.3和50%添加有Osmocote的泥炭的盆中并置于温室中。1.3转基因体的鉴定和选择对推定的转基因植林用PCR法篩选CrylAb基因的存在。用昆虫生物检测法鉴定和筛选阳性事件的杀昆虫活性。通过Southern印迹分析完成了对杀昆虫系的分子表征。在田间试验中观察获自若干事件的Tl种子的昆虫抗性及农艺品质。根据分子表征、经ELISA鉴定的蛋白表达7jc平、对烟蜂夜蛾(Heliothisvirescens)和棉贪夜蛾(Spodopteralittoralis)的杀昆虫抗性以及田间表现选择了CE43-67B事件。用常规植物育种方法分离出潮霉素选择标记盒从而得到CE43-67B事件。1.4CE43-67B序列的验证从CE43-67B事件分离基因组DNA。将其用于通过标准DNA测序技术对CE43-67B事件中DNA插入位点与棉花基因组DNA的连接点(SEQIDN0:1和2)进行观'J序。实施例2:通过PCR特异性检测CE43-67B事件2.1DNA提取根据生产商的说明利用WizardMagnetic96DMPlantSystem(Promega，#FF3760)从叶片组织提取DNA，但在程序开始时再加一步叶片材料研磨后，向各孔中加入0.9ml棉花抽提緩沖液(0.2MTrispH8.0,50mMEDTA，0.25MNaCl,0.1%v/v2-巯基乙醇，2.5%w/v聚乙烯吡咯烷酮)，将植物组织重悬浮，并将平板在4，000rpm(2755g)下离心10分钟。吸出并弃掉上清后，加入300ul裂解緩冲液A(Promega),从此点开始按照生产商的程序进行。经该程序得到了大约85ul浓度约为10ng/ul的纯化基因组DNA。2.2事件特异性PCR反应用含有以下物质的标准反应混合物设置25ulPCR反应lxJ卿startREDTaqPCR(Sigma,#P-1107)0.5uM引物1(SEQIDNO:9)0.5uM引物2(SEQIDNO:10)lOng基因组DMddH20将PCR反应在热循环仪中于94。C加热3分钟，之后进行35个如下循环94°C30秒，60°C30秒，72°C50秒。72。C加热5分钟结束反应。将PCR反应在琼脂糖上跑胶，用溴化乙啶染色后，在紫外光下使DNA条带可视化。得到一条大小约760bp的条带。或者，用含有以下物质的标准反应混合物设置25ulPCR反应lxJ,startREDTaqPCR(Sigma,#P-1107)0.5uM引物1(SEQIDNO:11)0.5uM引物2(SEQIDNO:12)lOng基因组DNAd歸将PCR反应在热循环仪中于94'C加热5分钟，之后进行35个如下循环94。C30秒，60°C30秒，72匸30秒。72。C加热5分钟结束反应。将PCR反应在琼脂糖上跑胶，用溴化乙啶染色后，在紫外光下使DNA条带可视化。得到一条大小约267bp的条带。实施例3:通过多重PCR合子型测试检测CE43-67B3.1基因组DNA提取如实施例2.1所述从CE43-67B提取基因组DNA。3.2多重PCRI设计了用于多重PCR合子型测试的PCR引物。按照下述为各待测样品设置了20ulPCR反应lxJumpStartReadyMix羅TaqPCR(SigmaP-1107)0.5uM引物1(SEQIDNO:5)0.5uM引物2(SEQIDNO:6)0.5uM引物3(SEQIDNO:8)10ng基因组DNAddH20将PCR反应在热循环仪中于94。C加热3分钟，之后进行35个如下循环94°C15秒，55°C15秒，72°C45秒。72。C加热5分钟结束反应0将PCR反应在琼脂糖上跑胶，用溴化乙啶染色后，在紫外光下使DNA条带可视化。两条带(561bp和约1000bp)的存在表明，该样品来自CE43-67B杂合植物；一条561bp大小的带表明，该样品来自CEW-WB纯合植物；而一条约1000bp大小的带表明该样品来自纯合野生型棉花植物。3.3多重PCRII设计了用于多重PCR合子型测试的PCR引物。按照下迷为各待测样品设置了20ulPCR反应lxJ卿StartReadyMixREDTaqPCR(SigmaP-1107)0.5uM引物1(SEQIDNO:11)0.5uM引物2(SEQIDNO:12)0.5uM引物3(SEQIDNO:13)10ng基因组DNAddH20将PCR反应在热循环仪中于94。C加热3分钟，之后进行"个如下循环94°C30秒，60。C30秒，72°C45秒。72。C加热5分钟结束反应。将PCR反应在琼脂糖上跑胶，用溴化乙啶染色后，在紫外光下使DNA条带可视化。两条带(267bp和约1000bp)的存在表明，该样品来自CE43-67B杂合植物；一条267bp大小的带表明，该样品来自CE43-67B纯合植物；而一条约1000bp大小的带表明该样品来自纯合野生型棉花植物。实施例4:通过Southern印迹检测CE43-67B4.1用于Southern印迹的DNA抽提用冷研钵和研扦将约2~3g鲜重的冷冻幼嫩叶片组织研成细粉，并加入贴标签试管中的15ml水冷的核酸抽提緩冲液(0.35M葡萄糖、0.1MTris-HClpH8,50mMNa2EDTA，2%聚乙烯吡咯烷酮-IO，0."/。抗坏血酸，0.2。/。B-巯基乙醇)中。在冰上孵育样品15-20分钟。轻轻混和试管，并于4"C在2700g下离心20分钟。弃上清，加入8ml核酸裂解緩冲液(O.14M山梨醇，0.22MTris-ClpH8，0.8MNaCl，0.22MNa2EDTA，0.8%w/vCTAB，1。/。Sarkosyl，1%聚乙烯吡咯烷酮-10，0.1%抗坏血酸，0.2%B-巯基乙醇，5jig/ml蛋白酶K)。混和后，于65°C孵育试管3G分钟。加入10ml氯仿，轻轻倒置混和试管直至形成乳状物，之后于室温在4600rpni下离心10分钟。将水性层转移至一支含有10(ilRNaseA(1QmgsigmaR4642)的新试管中，37'C下孵育该试管30分钟。重复一次氯仿和离心步骤。将水性层转移至一支含有10ml异丙醇的新试管中。室温下孵育约15分钟后，在试管中央观察到凝胶状沉淀物。轻轻混和试管，以沉淀出DNA。用无菌环将DM绕出并置于含有70%乙醇的Falcon试管中。将DNA空气干燥以除去乙醇，并将其重悬于200-400plTE中。4.2DNA抽提的替代方法室温下用研磨和研扦以及2ml研磨緩沖液(100mMNaOAcpH4.8，50mMEDTApH8.0，500mMNaCl，2%PVP(10，000MW)、1.4%SDS)和一些沙子将2-3片幼嫩棉花叶片(约lg鲜重)研磨成糊。将研磨组织转移到15mlfalcon管中，并用lml研磨緩沖液将研钵中剩余的研磨组织沖洗到试管中。于65。C孵育样品15分钟，偶尔振荡。加入4mlIOM醋酸铵，将样品充分混和，于65。C孵育IO分钟以沉淀蛋白质。室温下4600rpm离心样品10分钟。将水相转移到一支新的15ml试管中。加入0.6体积的冷异丙醇，室温下孵育样品约30分钟。緩慢混合后倒置试管数次，将DNA绕出并溶解于500ulTE中。加入10ul10mg/mlRNAse，室温下孵育15分钟。用500ul苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)提取后，轻轻混和样品，并以13000rpm离心5分钟。用细的巴斯德吸液管将上清液转移到新试管中，并如上述用氯仿异戊醇(24:i)重提。将上清液转移到新试管中，加入i/io体积3MNaOAc(pH4.8)并混和，然后加入一倍体积的冷异丙醇。可将样品在室温下孵育达30分钟以沉淀DNA。将DNA绕出并重悬于70%乙醇中。空气干燥DNA以出去乙醇，并重悬于200ul水中。4.3限制酶消化用分光光度计和跑胶对DNA进行定量。以每次消化总体积40ul中5ugDM准备适当的酶消化物。包括Ncol、Mscl、HindlII/Kpnl和Nhel/AscI的消化物用于检测拷贝数和插入完整性。各酶消化物在适当温度下孵育6小时。4.4凝胶电泳向上述4.3的各样品中加入溴酚蓝上样染料，并将各样品加样到0.8%TBE琼脂糖凝胶中。凝胶在50伏特下跑胶过夜。跑胶后，在O.25MHC1中洗涤凝胶10分钟以使DM脱嘌呤，在变性溶液(0.5MNaOH,1.5MNaCl)中轻轻搅拌孵育30分钟，用蒸馏水漂洗，之后在中和溶液(0.5MTris，1.5MNaCl)中孵育30分钟。按照下述准备Southern印迹把一块玻璃板架在一个盛有2(^SSC的托盘上，将3M纸条放在玻璃板上使纸的两端浸入到20XSSC溶液(起灯芯的作用)中。在灯芯上放一片与凝胶相同大小的SM纸，并把凝胶置于其上。在凝胶边缘放置nescofilm条以形成封边。在凝胶顶面放置Hybond膜，依次再放置两张3M纸。在组装印迹过程中，要小心以确保在膜、凝胶和3M纸之间没有进入气泡。在3M纸上方堆叠Scm-10cm高的吸水纸，并加砝码固定好。过夜使DM转移到Hybond膜上。转移之后，拆掉Southern印迹堆，并通过紫外交联使DNA结合到膜上。4.5杂交通过对二元质粒pNOV4641进行HindlII/Kpnl限制性消化并纯化所得片段制得适宜的DNA探针。25ng探针DNA在45ulTE中沸煮5分钟，置于水上5分钟，之后转移入RediprimeII(AmershamPharmaciaBiotech,并RPN1633)试管。向Rediprime试管中加入5ul32P-标记的dCTP，37。C下孵育1小时。根据生产商的说明经microspinG-50柱(AmershamPharmaciaBiotech,#27-5330-01)离心纯化探针以除去未掺入的dNTPs。通过比较柱中保留的与样品管中的放射性成分的量来粗略评估探针活性，比率至少为50:50是可接受的。Hybond膜用40ml预热的Rapid-Hyb緩沖液(Amersham-Pha函cia)打湿，在65'C在预杂交30分钟。将标记探针沸煮5分钟，并置于冰上5分钟。向预杂交緩冲液中加入适量探针(每ml预杂交緩冲液一百万计数)，65。C下杂交过夜。接下来的一天，弃杂交緩沖液，之后用50ml2xSSC/l%SDS溶液漂洗一次，在150ml2xSSC/l%SDS溶液中65。C下洗涤膜30-45分钟。用0.lxSSC/l%SDS溶液重复该过程两次。将膜暴露在荧光屏或X-射线胶片上以检测探针结合的位置。实施例5:通过ELISA检测CE43-67B5.1蛋白质提取收集用于分析的棉花组织，并于-70'C冷冻。将冷冻组织研成细粉，并称重放入贴有标签的聚丙烯试管中。对于冷冻组织以2:1(体积提取緩冲液样品鲜重)的比率，或对于冻干组织以30:l(体积提取緩沖液样品干重)的比率向样品中加入提取緩沖液(100mMTris，100mM硼酸钠，5mMMgCl,0.05%Tween20，0.2%抗坏血酸钠，水，pH7.8,lmMAEBSF，0.OOlmMLeupeptin)。用装有PTA10TS消泡发生器的BrinkmanPT10/35Polytron涡旋和均质化，直至混合物液化。将提取物在10，000xg下离心15分钟。将蛋白质提取物上清在2-8'C储存。5.2ELISA程序ELISA程序釆用以下标准技术。将96-孔板浸入乙醇中2小时，风干。用每孔50ul山羊抗-CrylAb抗体包被平板，并于2-8'C孵育过夜。用IXELISA洗涤液(lOOmMTris,0.5%Tween-20，75mMNaCl，pH8.5)洗涤三次后，将板扣于纸巾上稍拍打干燥。向各孔中加入150ul封闭液(10mMNaP04，140mMNaCl，1%BSA，0.02%叠氮化钠,用NaH2P04和化2肝04滴定至pH7.4)，之后于室温孵育45分钟。如上述将板洗涤三次。将CrylAb标准物和蛋白质提取样品加入到平板上适当的孔中，三个重复，每孔总体积为50ul。2-8。C下将板孵育一个半小时，之后于室温下在孵育30分钟。用ELISA洗涤液洗涤板三次，之后于35-39。C与每孔50ul兔抗-CrylAb抗体孵育1小时。用ELISA洗涤液洗涤板三次，并在室温下与每孔50ul缀合碱性磷酸酶的驴抗-兔抗体孵育30分钟。之后用ELISA洗涤液洗涤板三次，向各孔中加入50ul磷酸酶底物，将板在室温下孵育30分钟。通过向各孔中加入50ul3MNaOH使反应停止。用Ceres900C多孔板读数器测定405nm处各孔中的溶液吸收值，用KC3曲线拟合软件(Bio-TekInstrumentsInc.)分析所得结果。参照CrylAb蛋白质标准品计算样品中的CrylAb浓度。实施例6:通过DipStick检测CE43-67B6.l蛋白质提取将一片约0.2cm2的叶片组织置于含提取緩沖液的试管中。通过切碎和浸软组织，用塑料搅拌子从组织中提取蛋白质。6.2Dipstick测试将测试条放到试管中孵育5~IO分钟以显示结果。测试条在结合了抗-CrylAb抗体处有第一条带，且在对照抗体结合处有第二条带。孵育后，测试条结果窗中双红线表示CrylAb存在。较低的线表示CrylAb蛋白存在，而较高的线是表示该测试运行正确的对照。实施例7:经终点TaqMan合子型测试检测CE43-67B7.1基因组DNA提取如实施例2.1所述从CE43-67B中提取基因组DNA。7.2终点TaqManPCRi殳计了用于终点TaqManPCR合子型测试的PCR引物。按照以下设置了各待测样品的20ulPCR反应lxJ卿StartReadyMix謹TaqPCR(SigmaP-1107)0.5uM引物混合物1(等摩尔浓度的SEQIDNO:14、15和16)0.5uM引物混合物2(等摩尔浓度的SEQIDNO:17、18和19)10ng基因组DMddH20将PCR反应物在热循环仪中于95。C加热5分钟，之后进行40个如下的循环95°C15秒，60°C1分钟。7.3分析在ABI7900HT上读取焚光值，并采用所提供的SDS软件中的AllelicDiscrimination程序进行终点分析。检测到FAM荧光表明，该样品来自CE43-67B纯合植抹。检测到TET荧光表明，该样品来自纯合野生型棉花植林。检测到FAM和TET荧光表明，该样品来自CE43-67B杂合植林。实施例8:CE43-67B的杀昆虫效力8.1田间试验I——设计在美国的六个地点进行了田间试验以测试CE43-67B的昆虫抗性。在各地点，按随机化完全区组设计设置重复试验，每个试验包括4个重复。每个试验由包括4x40英尺的多个行、每英尺种植3林植物的地构成。在各个地点，在植物盛蕾期，一个试验由人工侵袭烟蜂夜蛾幼虫，另一试验由个人工4曼袭谷实夜蛾(Heicoverpazea)幼虫。之后评估各试验棉铃和棉蕾的损害百分数。人工侵袭通过将含虫卵的黄原胶溶液喷洒到植林上从而使幼虫直接孵化在植林上来完成。侵袭设计为约每抹植物3个虫卵。8.2田间试验I——结果下表中所示数据是试验期所有评估的平均值已将多个棉蕾损害率和棉铃损害率共同平均得到一个结实体(fruitingbody)损害率均值，并且全部六个地点的数据也一起进行了平均。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>这些数据清楚地显示，与名称为Coker312的非转基因对照相比，CE43-67B对烟椅夜蛾和谷实夜蛾均具有极好的抗性。8.3田间试验II——i殳计用在人工侵袭前24~36小时获自Stoneville，MS的南方昆虫管理实验室(SouthernInsectManagementLaboratory)的烟对夜蛾虫卵人工侵袭CE43-67B植林。将虫卵与黄原胶溶液混合，并利用常规的C02背负喷洒器喷洒到棉花植林的末端区域。虫卵经一个扁平扇形8006喷嘴以约10psi进行喷洒。该试验在Leland,MS的Syngenta，sSouthernRegionalTechnicalCentre和VeroBeach,FL的VeroBeachResearchCentre两个地点进行。在两个地点，利用了约2240个CE43—67B植林的非重复固定区组(unreplicated，solidblocks),以及约224个非转基因Coker312植林的较小区组进行侵袭。如果认为天敌群体高到足以干扰侵袭，则在计划的侵袭前24~48小时用acephate(Orthene)以0.5lbai/A喷洒研究区域。用非转基因Coker312棉花区估计侵袭技术的有效性，以及确定这些研究中所使用的烟辨夜蛾林的田间适应性。在各地点，对CE43-67B和Coker312棉花进行四次人工侵袭，每次侵袭四分之一的可用植株。侵袭在中蕾和早花期之间进行。通过收集数片来自Coker312植抹的带卵叶片并将其置于培养皿中来评估虫卯孵化率。计数所收集叶片上的虫卵，并在2~3天后评估成功的幼虫羽化。侵袭后7天进行评估。在Leland，MS地点，评估了所有侵袭植抹中的一半，而在VeroBeach,FL地点，评估了所有侵袭植株中的四分之三。在每种情况下，评估包括对整林彻底寻找存活幼虫。还从Leland的试验中得到了棉蕾损害率。对于在CE43-67B植林上发现了存活幼虫的地方，对含有幼虫的果实结构做了标记。4至7天后，再次彻底评估这些果实结构以及所有相邻结构以评估这些幼虫是否仍然存活。由于至该阶段，Coker312植林上的许多幼虫已经开始在土壤中寻找化蛹位置，因此后来在Coker地块中并没有进行类似的评估。8.4田间试验II——结果下表是所收集数据的总结。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>*基于所施用的虫卵数量和所观察到的孵化率进行的评估。ND=未检观寸侵袭7天后在两个地点在CE43-67B植林上存活的幼虫均非常小，在一龄至三龄之间。侵袭后7天包含活幼虫的果实结构作了标记，并在4~7天后再次进行了评估。在笫二次评估时，在所标记的、或是周围的果实结构中都没有回收到活幼虫。此外，所有标记的果实结构均保留在植抹上并正常发育。这强烈提示，侵袭7天后在CE43-67B植抹上仍然存活的极少数幼虫在第二次评估时不再存活。在CE43-67B植抹上观察到的棉蕾损害水平与非转基因Coker312对照相比是极低的，这证实，烟圻夜蛾幼虫是很有生命力的，并且能够建立强侵袭。该人工侵袭试验的数据显示，与名称为Coker312的非转基因对照相比，CE43-67B对烟奸夜蛾具有极好的抗性。权利要求1.包含含有SEQIDNO1所示序列的第一区和含有SEQIDNO2所示序列的另一区的多核苷酸。2.包含以下序列的多核苷酸a)SEQIDNO:3所示序列中的至少18个连续核普酸；b)SEQIDNO:1核苷酸246~305所示序列中的至少35个连续核苷酸；或c)SEQIDNO:l所示序列中的至少50个连续核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:l的第275和276位核苷酸。3.包含以下序列的多核苷酸a)SEQIDNO:4所示序列中的至少18个连续核普酸；b)SEQIDNO:2核苷酸103~164所示序列中的至少35个连续核普酸j或c)SEQIDNO:2所示序列中的至少50个连续核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:2的第133和134位核普酸。4.含根据权利要求13任一项的多核苷酸的棉花植物。5.含根据权利要求l~3任一项的多核苷酸的根据权利要求4的棉花植物的种子。6.—种检测包含SEQIDNO:l所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括a)制备包含待测植物基因组DNA的样品；b)获得适用于扩增反应以扩增含有SEQIDNO:3所示序列中的至少18个连续核苷酸的序列及其互补序列的引物对；c)将所述引物对加入所述样品和用于实施扩增反应的工具中；d)实施扩增反应；和e)将由此扩增的序列可视化。7.—种检测包含SEQIDNO:2所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括a)制备包含待测植物基因组DM的样品；b)获得适用于扩增反应以扩增含有SEQIDNO:4所示序列中的至少18个连续核苷酸的序列及其互补序列的引物对；c)将所述引物对加入所述样品和用于实施扩增反应的工具中；d)实施扩增反应；和e)将由此扩增的序列可视化。8.根据权利要求6或权利要求7的方法，其中所述序列包含至少20个连续核苷酸。9.一种检测包含SEQIDNO:l所示多核苷酸和/或SEQIDNO:2所示多核苷酸的植物的方法，所述方法包括a)制备包含待测植物基因组DNA的样品；b)获得能够与选自下组的序列杂交的探针，所述组由含有SEQIDNO:3所示序列中的至少18个连续核苷酸的序列和含有SEQIDNO:4所示序列中的至少18个连续核苷酸的序列组成；c)在允许所述探针与所述样品中的互补核酸杂交的条件下向所述样品中加入至少一种步骤(b)的探针；d)除去实质上未杂交的探针；和e)检测由此杂交的探针从而鉴定该样品中是否包含所述多核苷酸。10.根据权利要求9的方法，其中所述序列含有至少20个连续核苷酸。11.根据权利要求9或权利要求10的方法，其中通过在高严紧条件下漂洗所述探针来除去所述实质上未杂交的探针。12.试剂盒，其包含权利要求6或权利要求7中所定义的引物对，实施权利要求6或权利要求7的方法的说明，用于实施扩增反应的工具，以及可选的用于制备待测样品的工具。13.由细胞系DSMACC2723或DSMACC2724分泌的抗CrylAb抗体。14.一种dipstick，其含有a)特异性抗CrylAb抗体的测试线；b)抗小鼠抗体的试剂对照线；c)包含干燥的胶体金标记的抗CrylAb抗体的区块；和d)冲羊品施加区块，其中抗-CrylAb抗体和干燥的胶体金标记的抗CrylAb抗体独立地选自由细胞系DSMACC2723分泌的抗体和由细胞系DSMACC2724分泌的抗体。全文摘要本申请涉及抗昆虫转基因棉花植物。尤其涉及一个称作CE43-67B的特定事件。本申请还涉及CE43-67B事件特征性的多核苷酸、含有所述多核苷酸的植物以及检测CE43-67B事件的方法。文档编号C12N15/82GK101184847SQ200680018728公开日2008年5月21日申请日期2006年5月15日优先权日2005年6月2日发明者D·V·奈格罗托,J·巴内特,P·J·凯雷申请人:先正达参股股份有限公司