棉花GhPHOT2基因在植物抗强光伤害方面的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于基因工程应用技术领域，具体涉及棉花GhPH0T2基因在植物抗强光伤害方面的应用。
【背景技术】
[0002]棉花是喜光喜温的植物，在世界各地都有种植。光照是棉花正常生长不可缺少的重要因素之一，对棉花的产量和质量都有很大的影响。目前对棉花和光照关系的研究，主要集中在光照时间和光照强度对棉花的影响，以及不同光质如红光和蓝光等对棉花产量的影响，但有关棉花光受体的研究还未见报道。
[0003]已有研究证明参与向光性的受体主要是向光素、隐花色素和光敏色素。向光素是一种常见的光信号受体，参与蓝光诱导下植物的向光反应、气孔开放和叶绿体运动等诸多反应。目前在苔藓、拟南芥和玉米等植物中陆续发现了两种蓝光受体，分别为PHOTl和PH0T2。但现有关于这两种蓝光受体的研究主要集中于拟南芥中相关基因及其表达后与叶绿体运动之间的关系，而关于棉花中相关基因的作用及其功能的研究则较为缺乏。
【发明内容】
[0004]本发明在对棉花Ghphot2基因进一步研究基础上，提供了棉花Ghphot2基因在植物抗逆境特性，具体而言是抗强光伤害方面的新应用，从而为培育植物抗逆新品种提供了可能性。
[0005]本发明所采取的详细技术方案介绍如下。
[0006]棉花GhPH0T2基因在植物抗强光伤害中的应用，该基因与叶绿体避光运动相关，具体而言，含有棉花GhPH0T2基因的植株，叶片对光敏感度较高，具体而言，对蓝光敏感强度为10 μπιο?.m—2.s—S超过此强度时，叶绿体出现明显的避光运动响应。
[0007]将棉花中GhPH0T2基因沉默后，棉花植株在光照时，叶绿体缺少避光运动，容易受到光伤害。
[0008]利用棉花GhPH0T2基因培养耐光伤害植物新品种的方法，将棉花GhPH0T2基因转化植株，或超表达后，相应植株中叶绿体避光能力增强，可明显提升植物的耐光能力，避免光伤害。
[0009]拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科鼠耳芥属植物，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草，是植物遗传学、分子生物学常用的模式植物之一，也常用于植物逆境条件下抗性基因研究。本发明即以此模式植物为例，将棉花GhPH0T2基因转录进拟南芥phot2突变体后，对该基因的功能进行了具体分析。
[0010]光照对植物的生理反应起着非常重要的调节作用。蓝光诱导植物向光反应、气孔开放、叶绿体运动、叶片定位及伸展等生理反应，PH0T2作为一种蓝光受体，可以特异性调节叶绿体的避光运动，降低了强光对叶绿体的伤害作用，从而优化了植物的生长发育。本发明在对棉花GhPH0T2基因深入研究基础上，认为:含有棉花GhPH0T2基因的植株对光伤害敏感度更高，即对光伤害的响应更为迅速和敏感，在面临超过适应量的光照伤害时，能够调节叶片中叶绿体更为及时和迅速的做出避光运动，从而避免光伤害。以本发明为基础，利用基因工程，可为培育耐强光的逆境植物新品种提供了新的可能性。
【附图说明】
[0011]图1为棉花和拟南芥(野生型)正常生长过程中，蓝光小孔实验时不同光照强度下叶片变化情况及叶绿体避光情况，图中BL表示蓝光光照，BL后数字表示具体光照强度;其中(a)为棉花真叶在不同光强下小孔实验与叶绿体避光情况，从图中可以看出，棉花在蓝光强度为10 pmol.πΓ2.s—1时，小孔现象明显，并且叶绿体开始出现避光反应；(b)为拟南芥真叶在不同光强下小孔实验与叶绿体避光情况，从图中可以看出，拟南芥在蓝光强度大于20pmol.m—2.s—1小孔现象明显，并且叶绿体开始出现避光反应；
图2为棉花GhPH0T2基因沉默实验过程中，棉花叶片的表型、蛋白表达及蓝光小孔实验过程中棉花叶片的变化情况；(a)采用实验室VIGS体系，构建含有CLA基因和PH0T2基因病毒侵染载体以及空载(阴性对照)，分别转化棉花幼苗叶片，发现含有CLA基因病毒侵染载体注射的棉花叶片发生明显的白化，表明实验所用VIGS体系具有很高的干涉效率；同样也注射了含有PH0T2基因病毒载体(基因沉默组，V2-P2 )和空载(阴性对照组，V2)以及未注射对照(CK组)，以备后期实验检测；(b)为RT-PCR检测结果，其中基因沉默组中无GhPH0T2基因表达，表明该基因被沉默；(c)为蓝光小孔照射实验过程中，不同处理组的棉花叶片的对比结果，其中CK组、V2组(阴性对照组)能够正常避光，而基因沉默组则无法正常避光；(d)为强光蓝光小孔照射实验过程中，在光强100 ymol.m—2.s—1Jd后各组棉花叶片的对比结果，其中基因沉默组叶绿体不能正常避光，故叶绿体收到了不可逆转的伤害，叶片组织出现坏死(图中箭头所指)，而CK组和V2组叶片并没有出现损伤;图中V2-1、V2-2、V2-P2-1、V2_P2_2等表示该组中不同植株个体编号，(b)中Act in表示参考基因；
图3为棉花GhPH0T2基因回补拟南芥phot2突变体后，蓝光照射实验过程中，拟南芥叶片变化情况；(a)为不同处理组在蓝光照射实验过程中叶片变化情况，图中线框处为叶片上光照位置；(b)RT-PCR鉴定结果；(c)为不同处理组在蓝光照射实验过程中叶绿体变化情况，其中分为黑暗处理组(Dark)和强蓝光处理组，图中拟南芥回补棉花GhPH0T2基因材料C-1、C-9与野生型(WT)类似，叶绿体具有避光能力，而phot2单突变体和photlphot2双突变体则不表现出避光能力；(d)为对拟南芥总蛋白提取后的western杂交结果，其中GFP作为一抗，Actin表示参考基因；
图4为野生型棉花中棉花GhPH0T2基因超表达后相关实验结果；(a)为野生型棉花与转基因棉花在夏季7:00-19:00时的叶片透光情况；(b)为对应时间段内对野生型棉花与转基因棉花的叶片的透光率随时间变化的坐标图；(c)为对野生型棉花与转基因棉花两个株系中GhPH0T2基因表达量的PCR检测结果，以及对GFP标记基因的检测；(d)为Southern blot杂交结果，Southern blot杂交时，以500bp大小的Hyg片段为模板，以随机引物法制作探针用于杂交，其杂交结果表示转基因棉花(P-18、P_30)中所转入的棉花的GhPH0T2基因均为单拷贝，而阴性对照组、CK组、阳性对照组中均无条带，表明重组质粒成功整合进入棉花基因组中。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0013]实施例1
在前期研究基础上，发明人认为，棉花GhPH0T2基因与植物叶绿体避光作用相关，为对此结论进行验证，发明人以模式植物拟南芥及其相关突变体为例，进行了叶绿体避光反应试验，以对PH0T2基因功能进行初步对比分析，简要介绍如下。
[0014]拟南芥及phot2突变体的种植
将拟南芥野生型(WT)和phot2突变体种子播种于0.6%琼脂的MS培养基上。所述phot2突变体从拟南芥资源中心获得，该突变体的PH0T2基因失活，不能正确编码相关蛋白质；生长环境为:光/暗周期为8/ 16h，温度22 °C，黑暗温度18 °C，相对湿度70%，光照强度90μπιο?.m—2.s—1 ；
待拟南芥种子萌发并生长I周后，移入栽培盆(土壤配方为，营养土:蛭石=1:1)中，生长20天后取完好无损伤的叶片进行避光试验。
[0015]棉花的种植
将棉花种子(中棉16，由中国农科院棉花研究所提供)放入80°C水浴锅中2 min解除休目民，然后播种于培养土(营养土:輕石为2:1)中3?5 cm深；
人工气候室培养，生长环境为:温度280C-300C ,16 h光照，8 h黑暗，相对湿度60%，光照强度120 μπιο?.m—2.s—S
培养两周后，取长出的相同生长点的真叶用作蓝光小孔避光实验。
[0016]蓝光小孔避光(照射)试验的具体操作为:
(1)做避光处理前将培养的植株提前十二个小时放于黑暗环境中，以增加叶绿体避光的灵敏度;同时提前准备好带有8 mm孔径的不透光的遮光板备用；
(2)实验时，将剪取的叶片正面朝上放在培养皿中，将遮光板盖在叶片上，叶片的照光小孔位置尽可能保持一致;需要注意的是，剪取叶片时应尽可能避免叶片受到损伤；
盖好遮光板后向培养皿中添加适量的双蒸水以保证叶片的湿度及避免照光而引起温度升高影响实验结果；
(3)将培养皿水平放置在垂直向下照射的LED蓝光板下，根据实验需要选择相应的照光强度和照光时间对叶片进行处理;避光实验后取叶片下表层细胞进行显微镜观察，观察叶绿体移动情况。
[0017]实验结果如图1所示。