专利名称：棉花GbVe基因、其编码蛋白及在植物抗黄萎病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及棉花GbVe基因、其编码蛋白及在植物抗黄 萎病中的应用。
背景技术：
棉花黄萎病被称为“棉花癌症”，其致病菌为大丽轮枝菌，由于抗病基因资源匮乏 和大丽轮枝菌治病机理复杂，尚无有效地防治方法，黄萎病已经成为世界范围内影响棉花 产量和纤维品质的主要病害之一。黄萎病是一种土传维管束疾病，其病菌可在土壤中长期 潜伏。到目前为止尚未能找到彻底防治棉花黄萎病的办法。利用棉花抗黄萎病品种进行 黄萎病的防治由于受到育种周期长和抗黄萎病资源匮乏等因素的限制而未能广泛应用。因 此，利用基因工程技术分离植物抗黄萎病相关基因并通过遗传转化培育抗黄萎病新品种， 是目前棉花抗黄萎病遗传改良的一个重要方向。目前，已从棉花上克隆了一些抗病相关基因，这些基因的克隆为棉花抗病基因工 程的研究奠定了良好的理论基础。最近，Parkhi等将NPRl基因导入棉花后，转基因植株表 现为一种广谱性抗病，不仅可以抗多种真菌病害，还同时对线虫病害有一定的抗性。尽管前 人从棉花中克隆了大量与抗病相关的基因，但有关棉花抗黄萎病基因(Ve)的克隆及功能 分析尚无报道。番茄、马铃薯等作物是大丽轮枝菌侵害的主要对象，近年来其在抗黄萎 病基因克隆方面取得了突破进展。Kawchuk等用图位克隆技术从番茄(Solanum lycopersicum “VFN8”)基因组文库中成功分离了 2个大丽轮枝菌抗性基因Vel和Ve2， 且Ve赋予了转基因马铃薯对强致病力黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum Reinke和 Berth)较强的抗性。Chai等依据Vel和Ve2基因的部分保守域设计引物，采用同源克隆法 从Solanum licopersicoides分离了 SlVel基因，研究发现转SlVel的马铃薯提高了其抗黑 白轮枝菌的能力。以上结果表明Ve基因具有介导跨物种抗黄萎病的能力，并不严格受小种 特异性的限制，即具有多效性。Fei等利用RACE技术从水茄(S. torvum Swartz)中克隆了 全长3640bp的StVe基因；生物信息学分析显示，StVe与Vel和Ve2在核酸水平具有较高同 源性，编码的是一个富含亮氨酸(15. 89% )LRRs型跨膜细胞表面受体类蛋白，暗示了 StVe 可能具有抗黄萎病功能。Shi等从水茄(Solanum torvun)中分离StVe基因，并表明该基 因与抗黄萎病抗性有一定相关性。最近，Vining K等从长叶薄荷中(mentha longifolia) 分离到与Ve基因同源的mVel基因，并认为该基因在薄荷黄萎病抗性方面起着重要作用。 Emilie F.等将番茄Vel与Ve2基因通过农杆菌介导方法将其导入番茄作物，结果表明Ve 基因在番茄中超量表达，显著提高了番茄黄萎病抗性。综上所述，Ve基因在植物抗黄萎病 方面具有显著的作用，应是一个理想的棉花转基因抗黄萎病育种候选基因。目前关于棉花抗黄萎病基因的研究工作已经展开，筛选出的用于转化的基因大部 分是具有广谱抗性的抗真菌基因，而对黄萎病病菌专抗的基因很少，尤其是还未见有关棉 花中大丽轮枝菌抗性基因Ve的相关报道。因此，从高抗黄萎病的海岛棉品种中克隆与抗黄萎病相关的关键基因(Ve)，研究其表达调控机制及功能，为获得高抗黄萎病转基因棉花提 供新的基因资源，进而为培育高抗黄萎病棉花新品种奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花GbVe基因及其编码蛋白。本发明的另一目的是提供上述棉花GbVe基因在植物抗黄萎病中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种棉花GbVe基因编码的蛋白，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功 能的氨基酸序列。例如在非活性区段，将第297位的谷氨酰胺(Gln)替换为脯氨酸(Pro)， 或是将第597位的苏氨酸(Thr)缺失，或是在837位添加苏氨酸(Thr)均不会影响蛋白的 功能。本发明还提供编码上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本发明还提供含有棉花GbVe基因的载体及含有该载体的宿主细胞。本发明还提供含有棉花GbVe基因的转化植物细胞。本发明进一步提供棉花GbVe基因在植物抗黄萎病中的应用。优选地，所述植物为 拟南芥。具体地，本发明是从高抗黄萎病菌的海岛棉品种中克隆得到与抗黄萎病相关的基 因Ve，根据染色体步移技术，将扩增得到的5’端的GbVe基因片段和3’端的GbVe基因片段 拼接，然后根据基因序列设计合成可扩增全长GbVe基因的引物，采用RT-PCR技术经过常规 克隆测序方法获得了全长GbVe基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果(1)本发明提供了棉花GbVe基因及其编码的蛋白，其核苷酸序列和氨基酸序列分 别如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。(2)利用本发明提供的GbVe基因获得的转基因拟南芥的黄萎病抗性显著提高。(3)本发明克隆得到的GbVe基因不仅有助于揭示棉花与黄萎病菌之间相互作用 的分子机制，为植物的抗黄萎病代谢途径的研究提供重要理论基础，也为植物基因工程领 域进行植物遗传性状的改良提供了更有价值的候选功能基因。
图1为本发明棉花GbVe基因的cDNA全长序列PCR产物的电泳检测结果，其中M 为DL 5000Marker, 1为目的片段。图2为本发明载体pCamGbVe的结构示意图。图3为本发明pCamGbVe质粒双酶切结果示意图，其中M为DL12000 DNA Marker, 1禾口 2为BamHI和KpnI双酶切质粒pCamGbVe的产物。图4为本发明转GbVe基因拟南芥的PCR检测结果，其中M为DL2000 DNA Marker, 1 为水对照，2为非转基因拟南芥阴性对照，3为GbVe-EST阳性质粒扩增结果，4_14为转GbVe 基因拟南芥。图5为本发明转GbVe基因拟南芥的Southern检测结果，其中M为DNA Marker，P 为阳性质粒对照；WT为阴性质粒对照；L3-L5为转GbVe基因拟南芥株系。
图6为本发明转GbVe基因拟南芥的Northern检测结果，其中WT为阴性质粒对照； L3-L5为转GbVe基因拟南芥株系。图7示例本发明转GbVe基因拟南芥对大丽轮枝菌的抑制作用。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1棉花GbVe基因的克隆包括步骤l)GbVe基因中间片段的扩增；2)GbVe基因的3'染色体步移扩增；3)GbVe基因的5'染色体步移扩增；
4) GbVe基因全序列的gDNA和cDNA扩增。具体地，步骤1)选用天根生化公司提供的植物基因组DNA试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)和植物基因组DNA提取试剂盒，从抗黄萎病的海岛棉“Pima 90-53”的棉花幼嫩 叶片和根部组织分别提取出gDNA和总RNA，纯化后用于随后的染色体步移扩增和cDNA合 成，具体方法如下根据GenBank上公布的番茄Ve基因序列，在NCBI上进行BLAST比对， 根据比对结果设计特异性引物上游引物5‘ -GGAGTATCCCTGAGTCGATATGCA-3‘；下游引物 5 ‘ -CACTTCTGGTATTGGCCC-3 ‘。以纯化后的 gDNA 为模板，取 1 μ LgDNA 进行 Touch Down PCR扩增，反应程序及条件为温度95°C，时间5分钟；温度95°C，时间45秒，温度62°C，时 间45秒，温度72°C，时间1分钟，5个循环；温度95°C，时间45秒，温度60°C、时间45秒，温 度72°C，时间1分钟，5个循环；温度94°C，时间45秒，温度58 °C，时间45秒，温度72°C，时 间1分钟，5个循环；温度72°C，时间10分钟，4°C保存；的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产 物，PCR产物通过T4DNA连接酶连接到质粒pGEM-T载体上，并转化大肠杆菌DH5 α，然后涂 布到具有氨苄青霉素的LB平板上，37°C过夜培养直至菌落长出，随机挑取3个阳性克隆进 行测序，序列分析获得GbVe基因的中间部分基因序列。步骤2)选用TaKaRa公司提供的染色体步移试剂盒，按照说明书进行操作； 根据步骤1)中GbVe基因中间片段的测序结果，设计合成三条上游特异引物，3' SPl 5 ‘ -GGAGTATCCCTGAGTCGATATGCA-3 ‘ ,3 ‘ SP2 5 ‘ -GTCTAATAATTCCCTGAGCGGGTC-3 ‘， 3' SP3 5' -CGTGCATTGTTCAGAGAGGAGCC-3 ‘，用试剂盒提供的简并引物 AP Primer 为下 游引物，以纯化的gDNA为模板进行3轮PCR扩增。第1轮PCR采用特异性引物3' SPl与 试剂盒中提供的简并引物AP Primer分别进行热不对称PCR反应。第1轮反应程序及条件 为94"C Imin98 "C Imin940C 30s, 650C lmin，72°C 2min，5 个循环94°C 30s, 25°C 3min,72°C 2min94°C 30s, 65°C lmin, 72°C 2min、
94°C 30s, 65°C lmin, 72°C 2min [ 15个循环
94°C 30s, 44°C lmin, 72°C 2min」72 °C 10min，4°C 保存第2轮PCR反应以第1轮PCR产物稀释50倍为模板，采用特异性引物3‘ SP2与 试剂盒中提供的简并引物AP Primer分别进行热不对称PCR反应。第2轮反应程序及条件
为
94 °C30s,65 °Clmin,72 0C2 min、94 °C30s,65 °Clmin,72 °C2 min94 °C30s,44 °Clmin,72 0C2 min ^72 "C 10min，4°C 保存第3轮PCR反应以第2轮PCR产物稀释50倍为模板，采用特异性引物3‘ SP3与 试剂盒中提供的简并引物AP Primer分别进行热不对称PCR反应。第3轮反应程序及条件 同第2轮反应程序及条件。的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收条带特异清晰的PCR 产物按上述方法克隆到质粒PGEM-T载体上，随机挑取3个阳性克隆进行测序，序列分析获 得GbVe基因的3'端基因序列。步骤3)选用TaKaRa公司提供的染色体步移试剂盒，按照说明书进行操作； 根据步骤1)中GbVe基因中间片段的测序结果，设计合成三条上游特异引物，5' SPl 5' -GGAGGTAAACACCGTTAGGA-3‘ ,5' SP2 5' -ATTGCCTTCCAGGTCGACAAGCA-3‘ ,5' SP3 5 ‘ -CAGGAATAGACCCGCTCAGGGAA-3 ‘，用试剂盒提供的简并引物AP Pr imer为下游引物，以 纯化的gDNA为模板进行3轮PCR扩增。第1轮PCR采用特异性引物5' SPl与试剂盒中提 供的简并引物APPrimer分别进行热不对称PCR反应。第1轮反应程序及条件为94"C Imin98 "C Imin940C 30s, 650C lmin，72°C 2min，5 个循环94°C 30s, 25°C 3min,72°C 2min
94°C 30s, 650C lmin, 72°C 94°C 30s, 65°C lmin, 72°C
94°C 30s, 440C lmin, 72°C72 °C 10min，4°C 保存第2轮PCR反应以第1轮PCR产物稀释50倍为模板，采用特异性引物5' SP2与 试剂盒中提供的简并引物AP Primer分别进行热不对称PCR反应。第2轮反应程序及条件
为
2min、
2min > 15个循环 2min J 72 °C 10min，4°C 保存第3轮PCR反应以第2轮PCR产物稀释50倍为模板，采用特异性引物5‘ SP3与 试剂盒中提供的简并引物AP Primer分别进行热不对称PCR反应。第3轮反应程序及条件 同第2轮反应程序及条件。的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收条带特异清晰的PCR 产物按上述方法克隆到质粒PGEM-T载体上，随机挑取3个阳性克隆进行测序，序列分析获 得GbVe基因的5'端基因序列。根据中间片段、5'染色体步移、3'染色体步移的测序结果进行序列拼接，设计合 成一对特异的引物，扩增全长的GbVe基因，5'端GbVeF 5' -CTGGGATCCACCAATGATGATTTC ACC-3 ‘，3 ‘端引物 GbVeR 5 ‘ -CCTGGTACCCTAAGGAGAAAAGGGAGGAG-3 ‘；以纯化的 gDNA 为 模板，选用LATaq酶进行PCR扩增，反应程序及条件为温度94°C，时间5分钟；温度94°C， 时间45秒，温度55 °C，时间45秒，温度72 °C，时间3. 5分钟，30个循环；温度72 °C，时间10 分钟；1 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，PCR产物按上述方法克隆到PMD19-T载体上，随 机挑取3个阳性克隆进行测序，获得GbVe基因的gDNA全长序列，所得到的重组质粒命名为 pMDGbVe。以提取的总RNA为模板，按照Takara公司提供的M-MLV试剂说明书合成cDNA第 一链，取1 μ L cDNA为模板，分别以GbVeF和GbVeR为上、下游引物，选用LATaq酶进行PCR 扩增，反应程序及条件为温度94°C，时间5分钟；温度94°C，时间45秒，温度55°C，时间45 秒，温度72°C，时间3. 5分钟，30个循环；温度72°C，时间10分钟；的琼脂糖凝胶电泳检 测PCR产物(图1)，PCR产物按上述方法克隆到质粒PMD19-T载体上，随机挑取3个克隆进 行测序，序列分析获得GbVe基因的cDNA全长序列。实施例2棉花GbVe基因编码蛋白的氨基酸序列的同源性分析将棉花GbVe基因编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)在NCBI数据库中进 行blast对比分析，发现它与多种植物体内的应答病原菌侵染重要的受体类抗病基因 (LRR-TM)均有一定相似度，但同源性较低。GbVe基因与StVe和SlVe2的一致性不到55%， 但它们同属于植物应答病原菌侵染重要的受体类抗病基因(LRR-TM)，含有信号肽、跨膜域、 LRR重复单元、N端成熟区等保守结构域。利用DNAman分析软件将分离克隆的GbVe基因 与GenBank上的植物应答病原菌侵染重要的受体类抗病基因所编码的氨基酸序列进行比 对分析，结果如表 1 所示，分别为 SIVe，AY262015 ；Vel, AF272366 ；SlVe2, AY282579 ；Ve2, AF365929 ；StVe, AY311527 ；Cf-2. 2，U42445 ；Cf5, AF053993 ；HcrVf1, AJ297739 ；HcrVf2, AJ297740 ；HcrVf3, AJ297741 ；LeEiXl, AY359965 ；LeEiX2, AY359966。结果表明本发明获得 的GbVe基因与以往的报道的植物应答病原菌侵染重要的受体类抗病基因序列具有明显的 差异，证明该基因是一个新的抗大丽轮枝菌基因，且在棉花上为首次克隆。表1 GbVe基因与植物应答病原菌侵染重要的受体类抗病基因的氨基酸序列同源 性比较(％) 实施例3棉花GbVe基因在提高拟南芥黄萎病抗性中的应用1、棉花GbVe基因植物表达载体的构建及转化将上述已构建好的pMDGbVe和真核基因表达启动子35s和终止子构建成融合表达 基因，连接在双元表达载体pCambial300(市售商品)的EcoRI/Hindlll酶切位点(结构如 图2所示)，得到重组质粒pCamGbVe，经BamHI和KpnI双酶切鉴定结果显示为两条目的片 段(图3)，表明GbVe基因以正确的阅读框架插入到pCambia1300中。将pCamGbVe转化到 农杆菌GV3101中。按照侵染拟南芥花絮的方法转化拟南芥获得抗潮霉素(hptll)的转基 因植株。2、转GbVe基因植株的PCR检测剪取转GbVe基因植株和非转GbVe基因植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取基因 组DNA，在室温干燥后用适量无菌双重蒸馏水悬浮，-20°C保存。提取的DNA模板量调整为 50ng/y L，取 1 μ L 为模板进行 PCR 扩增，94°C，5min ；94 °C, 45S, 55 °C, 45S, 72 °C, 30min, 30 个循环；72°C，10min。1 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果表明获得了 GbVe基因整合 到拟南芥植物基因组的转基因植株(图4)。3、转GbVe基因拟南芥的Southern检测剪取转GbVe基因植株和非转GbVe基因植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取基因 组DNA，在室温干燥后用适量无菌双重蒸馏水悬浮并纯化，-20°C保存。用KpnI分别酶切 转GbVe基因植株和非转GbVe基因植株的gDNA，每个样品酶切30 μ g，以GbVe基因的一 段长约530bp的EST为探针，按照地高辛DNA标记及检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection Kitl，Roche，德国)的说明书进行操作。结果表明GbVe基因在检测的三个株系 中以单拷贝整合到拟南芥基因组中(图5)。
4、转GbVe基因拟南芥的Northern检测剪取转GbVe基因植株和非转GbVe基因植株的幼嫩叶片，采用植物RNA试剂盒 (Tiangen，中国)提取总RNA。每个样品取30 μ g在1 %的甲酰胺变性琼脂糖凝胶上电泳， 以GbVe基因的一段长约530bp的EST为探针，按照地高辛DNA标记及检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection Kitl，Roche，德国)的说明书进行操作。结果表明GbVe基因在 检测的三个株系高效表达(图6)。5、转GbVe基因拟南芥的黄萎病抗性鉴定大丽轮枝菌为河北农业大学棉花遗传育种分子研究室保存的强致病力菌系，将该 病菌在PDA培养基上活化7-10天，并转接到液体查彼克培养基中悬浮培养10-14天，接菌 时在显微镜下借助血球计数板将悬浮孢子液浓度调至5X 107cfu/mL。拟南芥种子经春化4 天，播种于营养钵中，22°C，光照16h/黑暗8h，湿度60-70%，培养四周。小心拔出幼苗，用 灭菌水冲洗根部，将处理好的幼苗根部浸入20mL的孢子悬浮液(5 X 107CfU/mL) 1分钟，每 处理一个株系更换一次新的孢子悬浮液，对照按同样方法接灭菌水。接种后将幼苗迅速移 栽回营养钵并保持高湿2天。定期观察对照株系与转基因株系的表型变化。结果显示(图7)，在接种大丽轮枝菌后，野生型拟南芥表现出叶片严重黄化甚至 干枯(图7-E、F、G)，株高严重矮化(图7-1)，长势弱小，维管束褐变程度高(图7-H)等症 状；而转基因拟南芥出现轻微的叶片黄化(图7-A、B、C)，株高较对照减少不明显(图7-1)， 生长健壮，维管束无明显褐变现象(图7-H)。说明GbVe基因可以明显抑制大丽轮枝菌的繁 殖，显著提高植株的黄萎病抗性。本发明属于新基因的制备，特别是指抗黄萎病基因GbVe及其制备以及利用其编 码的蛋白。包括以 5'端 5' -CTGGGATCCACCAATGATGATTTCACC-3‘和 3'端 5' -CCTGGTAC CCTAAGGAGAAAAGGGAGGAG-3 ‘为特异引物，以棉花根部cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得 抗黄萎病基因GbVe，并应用其编码了对大丽轮枝菌具有显著抑制作用的蛋白。本发明为抗 黄萎病基因工程提供了新的重要候选基因，利用本发明获得了全长的GbVe基因及其构建 的植物表达载体，可为进一步转化到重要作物提高转基因植物的黄萎病抗性奠定基础，具 有极大的经济效益和应用价值。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
棉花GbVe基因编码的蛋白，其特征在于，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2或3所述基因的转化植物细胞。
7.权利要求2或3所述的基因在植物抗黄萎病中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述的植物为拟南芥。全文摘要
本发明涉及棉花GbVe基因及其编码蛋白，其是从高抗黄萎病的海岛棉品种中克隆得到与抗黄萎病相关的Ve基因，根据染色体步移技术，将扩增得到的5’端的GbVe基因片段和3’端的GbVe基因片段拼接，然后根据基因序列设计合成可扩增全长GbVe基因的引物，采用RT-PCR技术经过常规克隆测序方法获得了全长GbVe基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明为植物抗黄萎病基因工程提供了新的重要候选基因，利用本发明获得的全长GbVe基因及其构建的植物表达载体，可为进一步转化重要作物以提高转基因作物的黄萎病抗性奠定基础，具有极大的经济效益和应用价值。
文档编号C12N15/29GK101928338SQ201010275300
公开日2010年12月29日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者吴立强, 张桂寅, 张艳, 李志坤, 杨硕, 王省芬, 马峙英 申请人:河北农业大学