猪抗菌肽cystatin11融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种猪抗菌肽cystain11融合蛋白及其编码基因与应用。本发明所述的猪抗菌肽cystain11融合蛋白很好地利用了抗菌肽和Pichiapastoris的优点，其编码基因可以在Pichiapastoris中高效表达，降低了抗菌肽的生产成本，将此融合蛋白在制备抑制细菌药物中的应用，特别是大肠杆菌和葡萄球菌，开发一种绿色、安全、无残留的抑菌新型药物，具有很高的经济价值和巨大的社会效益。
【专利说明】猪抗菌肽cystat in11融合蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种猪抗菌肽cystainll融合蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]随着养殖规模的不断扩大，细菌性和病毒性传染病已经成为严重制约我国养殖业发展的关键因素，并造成了重大的经济损失。化学药物的广泛使用虽然在疾病的防控中发挥的了重要的作用，但其在体内的高残留以及病原微生物多重耐药性的出现给动物和人类的健康带来了严重的威胁。因此，开发新型的抗微生物药物显得尤为迫切。抗菌肽作为机体先天性免疫的重要组成成分几乎存在于所有生物体中，可抑杀细菌、真菌、病毒、寄生虫和癌细胞，且作用迅速、不受微生物已产生的耐药性突变影响、不易使微生物出现耐药性突变。随着研究的不断深入，抗菌肽越来越显示出了其在医学、兽医学等相关领域的独特应用价值，并且长期以来抗菌肽被视为理想的抗生素替代品。但抗菌肽的天然产量低和合成的价格昂贵是抗菌肽药物·发展必须解决的问题。
[0003]毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统，它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷。除此之外，由于它在蛋白质表达方面还具有以下几个其它表达系统所不可比拟的优点，使得该系统成为目前研究最多、应用最广泛的真核表达系统之一:(1)它所携带的aox启动子是一种强有力的启动子，受甲醇严格诱导调控而表达，所以可严格调控外源蛋白的表达；(2)可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的翻译后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性；(3)表达量高，迄今为止，已有300多种异源蛋白在该表达系统中获得了高效表达，如破伤风毒素片段C可达12g/L，而明胶的表达量甚至达到了 14.8g/L ； (4)外源基因的表达产物既可存在于胞内，又可通过其特有的信号肽α -因子或天然蛋白本身的信号肽分泌至细胞外，同时，该系统自身分泌的蛋白非常少，这大大简化了纯化过程；(5)整合入外源基因的重组子表达系统十分稳定；有文献报道通过同源重组整合入外源基因的重组子表达系统可连续培养50代却未见外源基因丢失的现象；(6)糖基化程度低，Pichia pastoris中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8-14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50-150甘露糖残基要短得多，·同时，由于Pichia pastoris不能象酿酒酵母那样在核心多糖末端形成α -1，3末端甘露糖，使得它的蛋白抗原性远远低于后者，因而更适合于治疗用途；(7)该表达系统由于对营养要求低，培养基成份简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产。利用Pichia pastoris构建的高效表达系统能够显著提高抗菌肽的产量，从而降低抗菌肽的生产成本，对抗菌肽的工业化生产具有广阔的应用前景。
[0004]但是有些抗菌肽在Pichia pastoris中不能进行很好地表达，因此,亟需提供一种符合Pichia pastoris表达偏好性且能够在Pichia pastoris表达系统中高效表达的抗菌肽蛋白。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种符合Pichia pastoris表达偏好性且能够在Pichiapastoris表达系统中高效表达的抗菌肽蛋白，具体是一种猪抗菌肽cystainll融合蛋白及其编码基因与应用。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:猪抗菌肽cystainll融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0007]所述融合蛋白在制备抑制细菌药物中的应用。所述的细菌为大肠杆菌和葡萄球菌。
[0008]所述融合蛋白的编码基因，其喊基序列如SEQ ID N0:1所不。
[0009]本发明所述融合蛋白的编码基因是由编码猪cystainll成熟肽的cDNA序列、6个组氨酸cDNA序列和限制性内切酶Xho I和EcoR I位点的cDNA序列组成。
[0010]本发明中猪抗菌肽cystainll融合蛋白的编码基因的制备方法的步骤为:
[0011]表达载体的构建:·人工合成的cystatinll的基因序列上设计有限制性内切酶的酶切位点，将cystatinll的基因序列和表达质粒pwPICZalpha用同样的限制性内切酶酶切后连接在一起，通过双酶切检测和筛选含有cystatinll基因序列的重组质粒；
[0012]酵母表达系统的构建:使用限制性内切酶线性化重组表达质粒，通过电转化的方法，将cystatinll的基因序列整合到毕赤酵母的基因组中，将转化后的菌体悬液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30°C培养3_4d，挑取6个单菌落，进行小剂量的诱导表达，SDS-PAGE检测表达上清确认阳性克隆；
[0013]重组蛋白的纯化和活性检测:挑选阳性克隆菌落进行大剂量的诱导表达，表达上清采用ProteinPure N1-NTA树脂和强阳离子交换树脂纯化，通过SDS-PAGE和Westernblot检测纯化的重组蛋白；通过抑菌圈实验检测重组蛋白的抗菌活性。
[0014]本发明所述的猪抗菌肽cystainll融合蛋白很好地利用了抗菌肽和Pichiapastoris的优点，其编码基因可以在Pichia pastoris中高效表达，降低了抗菌肽的生产成本，将此融合蛋白在制备抑制细菌药物中的应用，特别是大肠杆菌和葡萄球菌，开发一种绿色、安全、无残留的抑菌新型药物，具有很高的经济价值和巨大的社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1 是 ProteinPure N1-NTA 树脂纯化重组 cystatinll 的 SDS-PAGE 电泳图。
[0016]图2是强阳离子交换树脂纯化重组cystatinll的SDS-PAGE电泳图。
[0017]图3 是重组 cystatinll 的 Westernblot 分析图。
[0018]图4是重组cystatinll的抑菌效果图，图中:(A)大肠杆菌；(B)葡萄球菌；(I)氨苄青霉素;(2)空白对照；(3)PBS ； (4)重组cystatinll。
【具体实施方式】
[0019]以下所述，仅是对本发明更进一步的叙述，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
[0020]1、所用试剂及其配制
[0021](1) LB (Luria-Bertani)液体培养基:
【权利要求】
1.猪抗菌肽cystainll融合蛋白，其特征在于,其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
2.权利要求1所述融合蛋白在制备抑制细菌药物中的应用。
3.根据权利要求2所述融合蛋白的应用，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌和葡萄球菌。
4.权利要求1所述融合蛋白的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQID N0:1所
【文档编号】C07K19/00GK103435701SQ201310312961
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月24日 优先权日:2013年7月24日
【发明者】姜俊兵, 范阔海, 王志瑞, 李宏全 申请人:山西农业大学