白菜wrky31基因及其编码的蛋白质的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种白菜WRKY31基因及其编码的蛋白质，所述白菜WRKY31基因的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述白菜WRKY31基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明提供的白菜WRKY31基因及其编码的蛋白质具有转录调控基因表达特性，通过转录调节白菜花粉育性和抗逆性相关基因的表达，能够提高植物的抗逆性，可用于分子植物育种，在培育雄性不育植物材料，抗逆性新品种，提高植物对逆境的抗性中起到重要的作用。
【专利说明】
白菜WRKY31基因及其编码的蛋白质
技术领域
[0001] 本发明涉及一种白菜WRKY31基因及其编码的蛋白质。
【背景技术】
[0002] 雄性不育系是十字花科作物生产一代杂种的理想系统，我国也是掌握十字花科植 物雄性不育优异种质资源最多，应用最广的国家之一。花粉败育是植物雄性不育发生的表 型体现，分析雄性不育机理需从解析花粉发育过程的各环节入手。多年来，人们通过正、反 向遗传学的方法鉴定了一系列参与花粉发育过程的关键基因。20世纪初，人们通过对拟南 芥等模式植物以及一些重要粮食作物等的花粉转录组、蛋白质组等进行分析，勾勒了花粉 mRNA、蛋白质组成等的初步特征。这些研究分别从散点和全局的角度分析花粉发育过程，积 累了对该过程的一定的认识。然而，花粉发育受控于成千上万个基因、蛋白质等，是一个多 步骤、复杂的过程，想要进一步解析其分子机制必须从深入分析基因、蛋白质等之间的相互 关系入手。
[0003] 花粉发育过程通常是植物生殖发育过程中最易受环境影响的环节。高温、低温、多 雨、干旱等温度与湿度条件的变化，均会直接引起花粉失活甚至导致败育等。转录因子是转 录水平上调控基因表达的重要因素，其所介导的基因表达调控网络在植物抵御各种环境胁 迫时扮演重要角色，如已经鉴定的MYB、WRKY和bZIP等基因家族等。在拟南芥花粉发育不同 阶段表达的12977个基因当中，有608个为推测的转录因子。研究表明AtMYB103、AtbZIP34 等转录因子的突变均影响下游基因及/或多个代谢通路的基因表达。然而，转录因子参与 花粉发育过程的研究刚起步，分析挖掘这些转录因子的功能将大大加快解析花粉发育及该 过程中的胁迫应答的分子机制的进程。
[0004] WRKY是植物转录因子超家族之一，其通过与顺式作用元件特异结合而调控基因表 达。WRKY是最先在甘薯中发现的植物转录因子超家族，因其N端含有高度保守的氨基酸结 构域WRKYGQK而得名，其通过与顺式作用元件W-box [ (T) (T) TGAC (C/T)]特异结合而调控基 因表达。根据WRKY结构域的数量以及锌指结构的特征，WRKY家族大致分为3个亚家族，其 中WRKY II亚家族又细分为a~e共5个分支。
[0005] 经过近20年的研究，人们对WRKY在植物胁迫应答中发挥的作用有了较丰富的认 识，对于WRKY在植物胁迫响应中扮演重要角色已有较多报导，而WRKY参与发育的例子则相 当有限，目前仅在毛状体、胚胎、种子发育中有所报道，另有研究表明WRKY还可能与花粉发 育相关：拟南芥WRKY34被证明在成熟花粉中特异表达，且负调控花粉低温胁迫响应的信号 转导过程。
【发明内容】
[0006] 本发明提出一种白菜WRKY31基因及其编码的蛋白质。
[0007] 本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
[0008] 一种白菜WRKY31基因，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，cDNA的核苷酸 序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009] 一种白菜WRKY31基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0010] 一种用于白菜WRKY31基因的cDNA全长克隆的PCR引物对，包括核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示的上游引物和如SEQ ID N0:5所示的下游引物。
[0011] 一种用于白菜WRKY31基因的DNA全长克隆的PCR引物对，包括核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示的上游引物和如SEQ ID N0:5所示的下游引物。
[0012] -种用于半定量RT-PCR分析白菜WRKY31基因的PCR引物对，包括核苷酸序列如 SEQ ID N0:7所示的上游引物和如SEQ ID N0:8所示的下游引物。
[0013] 本发明提供的白菜WRKY31基因及其编码的蛋白质具有转录调控基因表达特性， 通过转录调节白菜花粉育性和抗逆性相关基因的表达，能够提高植物的抗逆性，可用于分 子植物育种，在培育雄性不育植物材料，抗逆性新品种，提高植物对逆境的抗性中起到重要 的作用。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明实施例二中的总RNA的变性凝胶电泳图；
[0015] 图2是本发明实施例四中的cDNA全长克隆的PCR扩增产物的电泳图；
[0016] 图3是本发明实施例六中的白菜和拟南芥中WRKY基因家族的进化树分析；
[0017] 图4是本发明实施例七中的白菜BrWRKY31基因的表达模式。
【具体实施方式】
[0018] 下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。
[0019] 本发明提供一种白菜WRKY31基因，在一个【具体实施方式】中：所述白菜WRKY31基因 的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，该白 菜WRKY31基因命名为BrWRKY31。
[0020] 本发明还提供一种白菜WRKY31基因编码的蛋白质，在一个【具体实施方式】中：所述 白菜WRKY31基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，命名为BrWRKY31。
[0021] 在下方各实施例中，物质若是固体，则物质的百分数表示质量百分数，物质若是液 体，则物质的百分数表示体积百分数；室温指20_25°C。
[0022] 实施例一：基因组DNA的提取
[0023] 将白菜（白菜'Bcajh97_01B'可育株，当然也可以为白菜'Bcajh97_01A/ B'不育株）叶片鲜样100~200mg，加液氮研磨至粉末，加入600 yL提取缓冲液 (200mmol ? L 'Tris-Cl，pH 7. 5 ;25mmol ? L :EDTA，pH8. 0 ;250mmol ? L 'NaCl ;0? 5% SDS)，混 勾，60°C水浴45min，每lOmin摇一次；4°C，12000rpm离心10min ;将上清转移至新的1. 5mL 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比为24:1)的溶剂，离心7min ;将上清转移至 新的1. 5mL离心管中，加等体积预冷到4°C的异丙醇，混勾后室温静置10min，12000rpm离心 15min ;弃上清，加 lmL 70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，弃上清，重复一次；室温自 然干燥沉淀；加 20~30 y L的ddH20 (含0. lmol *L iRNase)使沉淀溶解。提取的DNA样品 放置于_20°C保存，在实施例五的DNA全长克隆中作为模板使用。
[0024] 实施例二：总RNA的提取
[0025] 获取白菜不育系（白菜'Bcajh97_01A/B'不育株，为雄配子减数分裂胞质分裂突 变体 the male meiotic cytokinesis, mmc)和可育株系（白菜 'Bcajh97_01B' 可育株，为 野生型）植株的花粉母细胞、减数分裂、四分体、单核小孢子和成熟花粉期等五个发育时期 的花蕾（花蕾根据纵径大小分成5级，从I级到V级分别为：小于1mm、1. 2~1. 6mm、1. 8~ 2. 2mm、2. 4~2. 8mm和3. 0~3. 4mm，分别为花粉母细胞期、减数分裂期、四分体时期、单核 小孢子期以及成熟花粉期），以及可育株系的根、茎、叶、花序和授粉后3天的嫩角果共15 份材料，分别采用Trizol法抽提以上15份材料的总RNA。整个提取过程保持无RNase污 染：用于抽提RNA的离心管、枪头均用0. 1%的DEPC-H20处理12h以上后高压灭菌（120°C， 40min)处理；玻璃器皿180°C烘烤5h。材料的总RNA提取的过程具体如下：
[0026] 将50~100mg材料在液氮中研磨至粉末，转入1. 5mL离心管。加入lmL的Trizol 充分摇勾，室温放置5111；[11;加入0.211^氯仿，剧烈摇荡158 ;120001'0;1；'，4<€，离心10111；[11;取上 清液，加入等体积的异丙醇，室温放置l0min ;12000rCf，4°C，离心15min ;弃上清，RNA沉淀 加入111^75%的乙醇，混匀，4°(：，7500代6离心5111111;弃上清液，重复两次 ；1?熟沉淀室温干 燥5~10min后用0? 01 % DEPC水溶解；-75°C保存备用。
[0027] 用甲醛变性凝胶电泳检测总RNA的质量：总RNA样品3~5 y L，加入上样缓冲液， 70°C变性10min，冰上冷却；配制1. 2%的甲醛变性凝胶（琼脂糖0. 3g，加入DEPC-H20 20mL， 加热融化，冷却至60°C，补加2. 5mL的10XM0PS和2. 5mL甲醛，总体积25mL)，混匀，铺胶； 3~5V/cm，电泳2h。用以上15份材料提取获得的总RNA变性凝胶电泳图片均如图1所示。 总RNA样品完整性较好，可用于其后的反转录实验（实施例三中的cDNA的合成）和实施例 七中的基因时空表达模式分析，各样品的纯度较好，0D260/280值均在1. 9到2. 0之间，浓 度均达到lug. yL1以上。
[0028] 实施例三：cDNA的合成
[0029] 将实施例二中提取的各个总RNA分别稀释至1 y g ? y L \分别获取等量的总RNA， 用于cDNA的合成。cDNA的合成参照Clontech公司的SMART? PCR cDNA Synthesis Kit实 验手册。合成的cDNA采用NanoDrop分析仪进行浓度测定，0D260/280值均在1. 6到1. 8之 间，浓度均在500ng，yL1左右。
[0030] 实施例四：cDNA全长的克隆
[0031] 以拟南芥的登录号At4g22070为关键词搜索白菜基因组数据库（www. brassica. info)，获得其在白菜中的同源序列。根据该同源序列设计引物（上游引物PI (SEQ ID NO: 4) :5' -CACCATGirCCGGITTCCGGTGA-3' 和下游引物 P2(SEQ ID N0:5) :5' -CTATATAITGTCACC GTTGCTAGTAGC-3'），以从实施例三中用白菜'Bcajh97-01B'可育株系的花序提取的总RNA 反转录成的cDNA为模板进行同源克隆，其PCR体系为：cDNA模板0. 5 y L，10XPCR缓冲液 (buffer) A 2. 5 y L，上游引物 P1 (10 y mol ? L 丨）0? 5 y L，下游引物 P2 (10 y mol ? L 丨）0? 5 y L， lOmmol .L MNTPs 0? 5 y L，Taq 聚合酶（2U ? y L ^O. 5 y L，补充 ddH20 至总体积 25 y LJCR 程 序：94°C，预变性 3min ;94°C，变性 30s ;56°C，复性 30s ;72°C，延伸 30min，30 个循环；72°C， 再延伸7min;4°C保存。PCR产物经Axygene DNA凝胶回收试剂盒回收，连接pGEM-T Easy Vector，转化大肠杆菌（Escherichia coli)DH5 a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，抽提 质粒，酶切鉴定后，重组质粒送Invitrogen公司测序，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:2 所示。PCR扩增产物的电泳图如图2所示，其中，泳道1为PCR扩增产物，M表示DNA Maker。 该 Marker 为 Fermentas 公司的 GeneRuler lOObp DNA Ladder Plus (货号为 SM0321)。
[0032] 实施例五：DNA全长的克隆
[0033] 以实施例一中的提取的DNA为模板，采用的引物为上游P3(SEQ ID NO:6) (5, -CAGCGATACTGTACGGATCCAAC-3'）和下游引物 P2:5' -CTATATAITGTCACCGITGCTAGTA GC-3'）。其PCR体系为：DNA模板0. 5 y L，引物浓度、以及其它试剂和浓度均与实施例四中 的cDNA全长克隆的设置相同。PCR程序中72°C延伸时间为2min，其它设置与实施例四中 的cDNA全长克隆的设置相同。PCR产物经Axygene DNA凝胶回收试剂盒回收，连接pGEM-T Easy Vector，转化大肠杆菌（Escherichia coli)DH5a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆， 抽提质粒，酶切鉴定后，重组质粒送Invitrogen公司测序，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0034] 实施例六：核酸序列分析
[0035] 用DNAStar软件分析实施例五中基因的DNA的最大开放阅读框，其最大开放阅读 框长度为1617bp，包含6个外显子和5个内含子，推导出氨基酸序列。利用NCBI生物信息 中心的 BLAST 服务（http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)进行同源搜索。蛋白质 序列及结构特征分析通过蛋白质专家分析系统网站（http://ca.expasy.org)进行。
[0036] 白菜WRKY31基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，该氨基酸序列 由538个残基组成，将具有该氨基酸残基序列的蛋白质命名为BrWRKY31，蛋白质分子量为 58. 60kDa，等电点（isoelectric point, pi)为5. 64。通过对BrWRKY31的结构域进行分析， 自氨基端开始：第1-13位氨基酸残基为线粒体定位信号肽，第26-42位氨基酸残基为细胞 核定位信号肽，第26-42位氨基酸残基为细胞核定位信号肽，第106-139位氨基酸残基为亮 氨酸拉链，第282-296位氨基酸残基为保守的A基序，第297-357位氨基酸残基为DNA结合 域，第303-309位氨基酸残基为WRKY结构域。
[0037] 将BrWRKY31 蛋白质与拟南芥 WRKY 的 lib 家族（包括AtWRKY6，AtWRKY9，AtWRKY31， AtWRKY36, AtWRKY42, AtWRKY47, AtWRKY61 和 AtWRKY74)比较，联配分析采用 CLUSTALW 2. 0. 12进行分析，其中保守部分用*表示，WRKY结构域用虚线方框标出，锌指结构用实线方 框标出。如下表1所示，氨基酸序列的同源性比对结果显示，BrWRKY31与拟南芥WRKY31的 氨基酸序列的同源性为90%。
[0038] 表1 :氨基酸序列的同源性比对结果：
[0039]
[0042] 如图3所示为白菜和拟南芥中WRKY基因家族的进化树分析，其中BrWRKY31属于 WRKY基因家族的lib亚家族。
[0043] 实施例七：基因时空表达模式分析
[0044] 采用半定量RT-PCR分析白菜BrWRKY31基因的表达模式。
[0045] 分别以实施例二中提取的各个植物组织的总RNA为原料，采用 ThermoScript Reverse Transcriptase(Invitrogen, USA)试齐丨J 盒合成用于半定 量RT-PCR分析的cDNA。用于半定量RT-PCR分析白菜BrWRKY31基因的上游引物 为 P4(SEQ ID N0:7) (5, -GCTGCAACTTCTTCGATG-3'）和下游引物为 P5(SEQ ID N0:8) (5' -CTATATAITGTCACCGTTGCTAG-3'）。PCR 体系：cDNA 模板 0? 5 y L，10XPCR 缓冲液 (buffer) A 2. 5 y L，上游引物 P4 (10 y mol ? L 丨）0? 5 y L，下游引物 P5 (10 y mol ? L 丨）0? 5 y L， lOmmol ? L MNTPs 0? 5 y L，Taq 聚合酶（2U ? y L ^O. 5 y L，补充 ddH20 至总体积 25 y L。 PCR 程序：94°C，预变性 3min ;94°C，变性 30s ;56°C，复性 30s ;72°C，延伸 30min，30 个循环； 72°C，再延伸7min ;4°C保存。PCR产物经Axygene DNA凝胶回收试剂盒回收，连接pGEM-T Easy Vector，转化大肠杆菌（E.coli)DH5 a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，抽提质粒， 酶切鉴定后，重组质粒送Invitrogene公司测序。
[0046] 取各组织均有且稳定表达的BrUBCIO作为半定量RT-PCR分析的内参基因，其扩增 引物为上游引物 P6(SEQ ID N0:9) (5' -GGGTCCTACAGACAGTCCTTAC-3'）和下游引物 P7(SEQ ID N0:10) (5' -ATGGAACACCTTCGTCCTAAA-3'）。
[0047] 以内参基因BrUBCIO作为参照，使用半定量RT-PCR法同时检测以上15份材料的 BrWRKY31基因的表达水平，如图4所示，图中ml~m5分别表示不育系植株的花粉母细胞、 减数分裂、四分体、单核小孢子和成熟花粉期的花蕾，wl~w5分别表不可育系植株的花粉 母细胞、减数分裂、四分体、单核小孢子和成熟花粉期的花蕾，R〇、St、Le、F1和Si分别为可 育系的根、莖、叶、花序和授粉后3天的嫩角果，从图中可以看出，BrWRKY31基因在可育株花 粉的单核小孢子和成熟花粉期的花蕾中特异表达，在不育株各个时期的花蕾中均不表达。 [0048] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应 当视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种白菜WRKY31基因，其特征在于：所述白菜WRKY31基因的DNA的核苷酸序列如 SEQ ID N0:1所示，cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。2. -种白菜WRKY31基因编码的蛋白质，其特征在于：所述白菜WRKY31基因编码的蛋 白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。3. -种用于白菜WRKY31基因的cDNA全长克隆的PCR引物对，其特征在于：包括核苷 酸序列如SEQ ID N0:4所示的上游引物和如SEQ ID N0:5所示的下游引物。4. 一种用于白菜WRKY31基因的DNA全长克隆的PCR引物对，其特征在于：包括核苷酸 序列如SEQ ID N0:6所示的上游引物和如SEQ ID N0:5所示的下游引物。5. -种用于半定量RT-PCR分析白菜WRKY31基因的PCR引物对，其特征在于：包括核 苷酸序列如SEQ ID N0:7所示的上游引物和如SEQ ID N0:8所示的下游引物。
【文档编号】C12N15/10GK106032535SQ201510109093
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月12日
【发明人】蒋晶晶, 曹家树, 黄鹂, 缪颖, 于为常, 张建华
【申请人】香港中文大学深圳研究院