专利名称：TGF-β超家族基因在制备治疗痛经药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及TGF-β超家族基因在制备治疗痛经药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
痛经为妇科血瘀证临床常见多发病症，可分为原发性痛经(PD)和继发性痛经 (SD)两大类。原发性痛经特征表现在无生殖系统明显病变，一般在初潮开始就会发生；继发性痛经可由生殖器炎症、子宫肌瘤、子宫内膜异位等生殖器官疾病引起，其中子宫内膜异位症者居多。流行病学研究表明，我国妇女中痛经发生率33. 1%，尤其是原发性痛经者占 53.2%，痛经严重影响工作者占13. 55%，为影响妇女正常工作和生活质量的常见原因。痛经为妇科最常见的症状之一，约有75%的妇女发生痛经。现代医学研究表明，痛经的发病机制与子宫异常收缩有关。由于子宫痉挛性收缩使子宫血流量减少，造成子宫缺血和疼痛发生，其病理机制涉及内分泌因素(前列腺素合成和释放，加压素、催产素、内啡肽)、神经与神经递质(去甲肾上腺素)和免疫失调等多种环节。西医临床常可使用非留体抗炎药或口服避孕药进行治疗，但这些药物长期疗效不理想，且对机体代谢有明显的毒副作用，临床不良反应大。目前有关基因治疗痛经的报道较少，转化生长因子β (transforming growth factor)家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子亚家族组成，其中包括TGF-β、活化素 (activin)、骨形态发生蛋白(BMP)、生长分化因子(GDF)等。TGF-β除了影响细胞的增殖、 分化，还在胚胎发育、胞外基质形成、骨的形成和重建等方面起着重要作用。TGF-β家族成员广泛存在于从果蝇到人多种生物的各种组织中，对正常细胞、癌变细胞都有着显著作用。且TGF-β超基因家族成员共同的特征(1)N-端有1段信号肽序列，可借以跨过内质网；( 紧挨着生物活性区有由4个氨基酸(RSRR)组成的蛋白酶加工位点；C3)C-末端包含9个保守的半胱氨酸的生物活性区，靠分子间的二硫键形成二聚体。目前还没有文献报道TGF-β超家族基因用于治疗痛经。
发明内容
发明目的本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中治疗痛经药物的不足， 提供TGF-β超家族基因在制备治疗痛经药物中的应用。技术方案为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为本发明提供TGF-β超家族基因在制备治疗痛经药物中的应用，其中优选的 TGF- β 超家族基因为 ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSF1、⑶Fll、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或 NODAL。本发明所述的TGF-β超家族基因在制备治疗痛经药物中的应用，所述的痛经类型可为原发性痛经或继发性痛经。本发明采用了 Real-time PCR免疫芯片为研究工具，通过比较原发性痛经患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)基因表达谱。发现在原发性痛经发病前后，病人与正常人
3相比，TGF-β 超家族基因(BMP4、BMP6、GSFl、GDFll、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或 NODAL) 表达明显下调。发明者首次发现了下调的TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSFU⑶F11、⑶F5、 MSTN、TXLNA, LEFTY2或NODAL)为原发性痛经的致病基因。上述基因及其TGF-β /Smad信号通路，构成了原发性痛经药物治疗的新靶点。总之，TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、GDFl 1、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或NODAL)的表达和原发性痛经直接相关，即TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSFl、ffl)Fll、 0^5、1^111乂1^嫩、1^ 1丫2或而040的表达下调导致和加剧痛经发生，上调TGF-β超家族基因出1^4、81^6、65 1、0^11、0^5、]^111乂11^、1^ 1￥2或吣041^)的表达可作为治疗原发性痛经的新靶点。其中，TGF-β 超家族基因 ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、⑶Fl 1、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 和 NODAL的核苷酸序列分别为说明书序列SEQ ID NO 1 9，即BMP4核苷酸序列为序列1 ； BMP6核苷酸序列为序列2 ；GSFl核苷酸序列为序列3 ；GDFll核苷酸序列为序列4 ；GDF5核苷酸序列为序列5 ；MSTN核苷酸序列为序列6 ；TXLNA核苷酸序列为序列7 ；LEFTY2核苷酸序列为序列8 ；NODAL核苷酸序列为序列9。有益效果本发明通过大量实验研究结果表明TGF-β超家族基因和痛经，尤其是原发性痛经的直接相关性，TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、⑶F11、⑶F5、MSTN、 TXLNA、LEFTY2或NODAL)的表达下调导致和加剧痛经发生，上调TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、 ΒΜΡ6、GSFU⑶F11、⑶F5、MSTN、TXLNA, LEFTY2或NODAL)的表达能减轻和消除痛经症状， TGF-β超家族基因可作为治疗原发性痛经的新靶点；和现有技术相比，本发明从基因水平治疗痛经症状，具有针对性强，疗效好，不良反应低的优点。本发明经大量实验研究表明， 四物汤的类方，如少腹逐瘀汤、香附四物汤等能显著上调TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、 GSFl、⑶F11、⑶F5、MSTN、TXLNA, LEFTY2或NODAL)表达，进一步从基因水平验证四物汤类方的良好的抗痛经效果。
图 1 为 TGF-β 超家族基因 BMP4、BMP6、GSF1、⑶F11、⑶F5、MSTN、TXLNA、LEFTY2 或 NODAL的表达倍数柱形图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。原发性痛经患者PBMC细胞TGF-β超家族基因的研究本发明采用基因芯片技术， 针对免疫因子基因，证明TGF-β超家族基因BMP4、BMP6、GSF1、GDF11、GDF5、MSTN、TXLNA、 LEFTY2或NODAL和痛经的相关性。1、材料与方法1. 1、原发性痛经病人和正常人血样收集经江苏省中西医结合医院伦理委员会批准，在正常月经前7天和正常月经第一
4天，收集10例原发性痛经病人和10例正常人的静脉血样，并收集病人给予少腹逐瘀汤、香 附四物汤治疗后的血样。1. 2、RNA抽提=TRIZOL试剂(Invitrogen)，氯仿(上海化学试剂有限公司)，异丙 醇(上海化学试剂有限公司)，100%乙醇(上海化学试剂有限公司)，75%乙醇(以DEPC 处理的水配制)，无RNA酶的水，无RNA酶的糖原(Ambion)TE =IOmM, Tris-HCl pH8. 0，ImM EDTA (Tris-HCl，EDTA华美生物工程公司)，0. 4M MOPS, pH7. 0 (M0PS，华美生物工程公司)， 0. IM乙酸钠(乙酸钠，上海化学试剂有限公司)，0.0 IM EDTA (EDTA，华美生物工程公司)，甲 醛(上海化学试剂有限公司)，甲醛上样染液(Ambion)，溴化乙锭 thidium Bromide, EB, 华美生物工程公司)，琼脂糖(生エ生物工程有限公司)。采用人淋巴細胞分离液提取每份血样的外周血单个核細胞(PBMC)細胞，加入Iml 的TRIZOL试剂，反复吹打溶解，负80度保存。加入0.2ml的氯仿，盖紧EP管盖，手动剧烈 振荡管体15秒后，15到30°C孵育2到3分钟。4°C下12000转/分钟离心15分钟，离心后 RNA全部被分配于水相中，将水相转移到新离心管中，水相与0. 5ml异丙醇混合，室温孵育 10分钟，4°C 12000转/分钟离心10分钟，移去上清液，加入至少Iml的75%乙醇，清洗RNA 沉淀，振荡后，4°C 7500转/分钟离心5分钟，去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5 10 分钟，溶解RNA吋，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60°C孵育10分钟， 获得的RNA溶液保存于负70°C。采用RNeasy MinEluteTM纯化试剂盒^jiagen)纯化RNA。 使用NanoDrop ND-1000测RNA浓度和纯度，測量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。样品 RNA浓度计算公式为A26(1X40ng/iU，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度。1.3、cDNA 合成SuperScript. Ill Reverse Transcriptase、invitrogen), RNase Innibitor (,epicentre), IOmM dNTPs Mix oligo (,aT) 181.31、配制混合物
500ng/ul oligo (dT) 181ド1
总 RNA1.5tig
IOmM dNTPs Mix1ド1
灭菌水up to 13 y 11. 32、先在65°C水浴5分钟后，冰上放置至少1分钟。1. 33、短暂离心后，在离心管中依次加入
5 X First-Strand 缓冲液4ド1
0. IM DTTm
RNA酶抑制剂1ド1
SuperScript III RT1ド11. 34、移液枪轻轻吸打几次混合均勻。1. 35、在 50°C温育 60 分钟。
1. 36、在70°C温育15分钟使酶失活。1. 37、每20 ill cDNA加91 yl灭菌水混勻，置冰浴待用或_20°C保存。1.4、实时定量 PCR2X SuperArray PCR master mix(Cat. No. PA-112), PCR Array1. 41.样品准备
权利要求
1.TGF-β超家族基因在制备治疗痛经药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的TGF-β超家族基因在制备治疗痛经药物中的应用，其特征在于，所述的 TGF-6 超家族基因为 ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、GDFl 1、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或 NODAL。
3.根据权利要求1或2所述的TGF-β超家族基因在制备治疗痛经药物中的应用，其特征在于，所述的痛经类型为原发性痛经。
全文摘要
本发明提供了TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSF1、GDF11、GDF5、MSTN、TXLNA、LEFTY2或NODAL)在制备治疗痛经药物中的应用，本发明通过大量实验研究表明痛经病人外周血单个核细胞PBMC细胞的的TGF-β超家族基因有明显下调，表明痛经，尤其是原发性痛经和TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSF1、GDF11、GDF5、MSTN、TXLNA、LEFTY2或NODAL)有直接相关性，TGF-β超家族基因可作为治疗原发性痛经的新靶点。
文档编号A61K48/00GK102441176SQ20111039422
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者刘培, 唐于平, 宿树兰, 段金廒, 洪敏 , 马宏跃 申请人:南京中医药大学