表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌株的制作方法
【专利摘要】本发明是一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum热稳定热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS-CT-9B。通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum获得糖苷水解酶基因CtAA9b，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的糖苷水解酶基因CtAA9b表达载体pPIC9K/CtAA9b导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因CtAA9b的酵母工程菌GS-CT-9B。该工程菌表达的糖苷水解酶CtAA9B对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高1.7倍。在Mn2+条件下，CtAA9B和CtAA9B+N24的纤维素酶活性可分别提高15倍和2.54倍。CtAA9B具有良好的热稳定性和提高纤维素酶活力的能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。
【专利说明】表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌株(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌株Pichia pastorisGS-CT-9B。
(二)【背景技术】
[0002]糖苷水解酶(英语:Glycoside hydrolases,又称糖苷酶)是一种专门水解配糖键(glycosidic bond)，并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。
[0003]嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50°C条件下可以产生热稳定的纤维素酶和9家族糖苷水解酶。
[0004]嗜热毛壳菌产生的9家族糖苷水解酶CtAA9B具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，可使其活性提高1.7倍。在不同金属离子如Mn2+的作用下，CtAA9B和CtAA9B+N24的活性可分别提高15倍和2.54倍。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得内切β -1，4_葡聚糖酶基因的cDNA序列全长，命名为CtAA9b，CtAA9b基因DNA全长1041bp，包括信号肽序列，起始密码子和终止 密码子，编码322个氨基酸，具有信号肽序列(l-24aaMVKAKKSAFLATVAGASLVAAHGY)。将CtAA9b编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。
[0006]构建重组表达质粒载体pPIC9K/CtAA9b，利用电转仪进行电击转化Pichiapastoris GSl 15，在MD和丽培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9B。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28°C 200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为3.16mg/ml，分子量为55KDa，酶活力为0.0365U/ml,CtAA9b在65°C下是稳定的，处理60min后仍有95%以上的酶活性；70°C处理30min后仍保持64%的活性；80°C处理30min后保持13.5%的活性；90°C处理30min活性几乎完全丧失。
[0007]9家族糖苷水解酶CtAA9B对嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高1.7倍。不同金属离子对CtAA9B和CtAA9B+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn2+条件下，CtAA9B和CtAA9B+N24的纤维素酶活性可分别提高33倍和2.54倍。
(四)【专利附图】
【附图说明】:[0008]图19家族糖苷水解酶CtAA9B的SDS-PAGE分析
[0009]泳道1:低分子量蛋白标准
[0010]泳道2:纯化的9家族糖苷水解酶CtAA9B
[0011]图2A: 9家族糖苷水解酶CtAA9B的最适温度
[0012]B: 9家族糖苷水解酶CtAA9B的热稳定性测定
[0013]图39家族糖苷水解酶CtAA9B对内切纤维素酶N24活性的促进作用
[0014]图4金属离子Mn2+对CtAA9B纤维素酶及混合酶活性的影响
(五)【具体实施方式】
[0015]实施例1:嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum的分离鉴定
[0016] (I)标本采集:从堆肥中采集。
[0017](2)分离培养:将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50°C培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson (1964)文献。
[0018](3)鉴定:参考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文献。
[0019]实施例2:糖苷水解酶基因CtAA9b的克隆
[0020](I)嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum总RNA的提取:参照Trizol试剂盒说明。
[0021](2)cDNA 第一条链的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0试剂盒说明书进行:取I~2 μ g总RNA，加RNase Free ddH20至9.5 μ L，将RNA样品在75°C变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分:10mmol/L dNTP Mixture2 μ L, IOXRT Buffer (Mg2+) 2 μ L，25mmol/L MgCl24 μ L, Oligod(T)-Adaptor Primerl μ L, RNase Inhibiter0.5 μ L, AMV Reverse Transcriptasel μ L(Final Volume20 μ L),将反应液混合后，室温下放IOmin,然后42°C温育60min,再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180 μ L DEPC处理的ddH20，稀释至200 μ L，混匀，稍微离心，保存于-20°C，备用。
[0022](3)PCR 反应(25μ L):cDNA2y L, 10XBuffer2.5 μ L, IOmmoI/L dNTP2 μ L, 25mmol/LMgC122y L，上、下游引物各 2μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L (5U/μ L)，ddH2012 μ L。反应条件为 94°C 5min 预变性；94°C 40s, 57°C 40s, 72°C lmin,共 32 个循环，72°C延伸 10min,4°C保存。
[0023]上游引物:5’ -ATGGTCAAGGCTAAGAAGTC-3 ’
[0024]下游引物:5’ -TTAGACGCACTGGTGGTACC-3 ’
[0025](4)基因克隆:取0.5μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5ci菌株，在表面涂有氨卞青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
[0026](5)质粒DNA的提取:碱法提取质粒DNA。
[0027](6)序列测定:DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序列引物为M13启动子引物。嗜热毛壳菌CtAA9b基因cDNA全长1041bp，包含起始密码子和终止密码子，无内含子，编码322个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。该序列如下:[0028]⑷SEQ ID NOl 的信息
[0029](a)序列特征:*长度:1041碱基对；*类型:核酸；*链型:双链；*拓扑结构:线性
[0030](b)分子类型:DNA
[0031](C)假设:否[0032](d)反义:否
[0033](e)最初来源:嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum
[0034](f)序列描述:
[0035]I ATGGTCAAGG CTAAGAAGTC TGCTTTTCTC GCCACCGTCG CTGGTGCCAG CCTCGTTGCT
[0036]61 GCCCACGGCT ATGTCAACGG AATCGTCGTC AACGGCGTCT ACTACAGGAA CTACAACCCC
[0037]121 TCGGTCGACT GGTACCGTGG CAACAACCAG GAGACTCTGA TCGGCTGGAG GGCTGAGAAC
[0038]181 ACGGACAACG GCTTCGTCGA GCCCAACAAG TTCAACACTG CTGACATCAT CTGCCACCGC
[0039]241 CAGGCCGTCA ATGCCAAGGG CTATGCCACC GTCAAGGCCG GCGACAAGAT TAATATCAAG
[0040]301 TGGGACCCAA TCTGGCCTGA GAGCCACGTC GGTCCCGTCA TCGACTACCT TGCCGACTGC
[0041]361 AACGGCGACT GCTCTACAGT CTCCAAGAAC TCCCTTCGGT TCTTCAAGAT CGACGGTGCC
[0042]421 GGCTACGACA AGGCCAAGGG CAAGTGGGCT GCCGATGTCC TCCGTGAAAA TGGCAACAGC
[0043]481 TGGATGGTCC AGATCCCGGC TGACCTGAAG CCCGGTCACT ACGTCCTTCG CCATGAGATC
[0044]541 ATCGCCCTCC ACGGTGCTGC CAACCCCAAT GGCGCTCAGG CCTATCCTCA GTGCATCAAC
[0045]601 ATCAAGGTTG AGGGCAGCGG CAGCAACTCG CCTTCCGGCG TTGCCGGCAC CTCTCTCTAT
[0046]661 ACCGCCMCG ACCCGGGCAT CCTCTTCAAC CCTTGGGTCA GCAACATCGA CTACCCGGTT
[0047]721 CCGGGCCCTG CTCTGATCCC CGGTGCTGTC AGCTCCATCC AGCAGAGCAC CTCGGCCGCT
[0048]781 ACCAGAACCG CCTCAGCCAC CCCTTACGCG GGCGGCGCTG TTCCAACCAC CACTCAGGGC
[0049]841 GGCAGCCAGC CCACTACCAC GGCTCTCCCG ACCACTACCC TCGTCACCAC CACTGCTGTC
[0050]901 CCGATCACCA CTGCTCCTCC GGCTGGCCCT ACTCAGAGCA AGTGGGGACA GTGCGGTGGC
[0051]961 AGCGGCTACA CCGGCCCGAC TCTCTGCGCT CCTGGCTCGA ACTGCCAGGT CATCAACCCC
[0052]1021 TGGTACCACC AGTGCGTCTA A
[0053](B) SEQ ID N02 的信息
[0054](a)序列特征:*长度:322氨基酸；*类型:氨基酸；*链型:单链；*拓扑结构:线性
[0055](b)分子类型:蛋白质
[0056](C)序列描述:
[0057]I VNGIVVNGVY YRNYNPSVDff YRGNNQETLI GffRAENTDNG FVEPNKFNTA DIICHRQAVN
[0058]61 AKGYATVKAG DKINIKffDPI WPESHVGPVI DYLADCNGDC STVSKNSLRF FKIDGAGYDK
[0059]121 AKGKffAADVL RENGNSWMVQ IPADLKPGHY VLRHEIIALH GAANPNGAQA YPQCINIKVE
[0060]181 GSGSNSPSGV AGTSLYTAND PGILFNPffVS NIDYPVPGPA LIPGAVSSIQ QSTSAATRTA
[0061]241 SATPYAGGAV PTTTQGGSQP TTTALPTTTL VTTTAVPITT APPAGPTQSK WGQCGGSGYT
[0062]301 GPTLCAPGSN CQVINPffYHQ CV
[0063]实施方式3:表达载体的构建
[0064](I)根据分离出的CtAA9b基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端分别引入Ecor I和Not I酶切位点，下游引物引入6个组氨酸序列，作为纯化标签:上游引物:5，-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACGTCAACGGAATCGTCG-3，
[0065](EcorI);下游引物:5’ -TTGCGGCCGCTTAGACGCACTGGTGGTACC-3’
[0066](Not I )(组氨酸序列)
[0067](2)嗜热毛壳菌总RNA的提取:利用Trizol试剂提取。
[0068](3)反转录合成cDNA第一条链:取2 μ g总RNA，加入5 X反应缓冲液4 μ L，IOmMdNTP 2 μ L，核糖核酸酶抑制剂(40 — 200ιι/μυ0.5μ?3_ο1?8ο(1Τ(1μ8/μυ?μ?，β转录酶(lOu/μ L) 2μ L，42°C反应60min，然后85°C IOmin终止反应，稀释至200 μ L。
[0069](4)PCR 反应(25 μ L):cDNA2 μ L, 10 X Buffer 2.5 μ L, lOmmol/LdNTP2 μ L, 25mmol/LMgCl2 2 μ L，上、下游弓丨物各 2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0.5 μ L (5U/μ L)，ddH20 12 μ L。反应条件为 94°C 5min 预变性；94°C 40s, 57°C 40s, 72°C Im 共 32 个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
[0070](5)基因克隆:取2yL PCR产物与pMD18 — T载体进行连接，获得重组质粒pMD18T/CtAA9b操作步骤按TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在涂有AMP的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
[0071](6)质粒DNA提取:碱法提取质粒DNA。
[0072](7)用Ecor I和Not I对重组质粒pMD18_T/CtAA9b产物进行双酶切，同时用EcorI和Not I双酶切酵母表达质粒pPIC9K，DNA胶回收试剂盒回收纯化CtAA9b基因及载体PPIC9K片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pPIC9K/CtAA9b，重组质粒转化大肠杆菌JM109，在含Amp的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。
[0073]实施例4.表达糖苷水解酶基因CtAA9b的酵母工程菌株的构建及筛选
[0074](I)重组表达质粒的线性化:将重组表达质粒pPIC9K/CtAA9b用限制性内切酶Sac I线性化。
[0075](2)转化:电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞,转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。
[0076](3)筛选:用灭菌牙签挑取转化子对应点种在丽和MD平板上，30°C培养2 — 4d,挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于250 μ g/mL,300 μ g/mL,400 μ g/mL,500 μ g/mL,600 μ g/mLG418 的 YPD 平板上筛选多拷贝转化子。
[0077]实施方式5:毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测
[0078](I)将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，30 °C 250rpm/min摇床培养24h(OD600达2 — 6)，离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至0D_值为1.0，300C 250rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为0.5%，每24h取样，室温10，OOOg离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。
[0079](2)酶活性检测:酶活性测定采用DNS法，反应体系及反应条件为100 μ L的酶液，加入200 μ L的0.5%微晶纤维素，100 μ L的醋酸缓冲液(0.4mol/L、pH5.0)60°C反应30min，加入400 μ L DNS试剂，煮沸lOmin，在540nm波长下测定光吸收值。对照组用失活的酶液做对照。以失活酶液的活性定义为100%，测定糖苷水解酶CtAA9B的相对酶活性。重复三次，取平均值。蛋白含量测定采用Bradford法。[0080](3)重组糖苷水解酶CtAA9B的最适反应温度、pH及热稳定性:诱导表达的重组糖苷水解酶经过GE公司的HisTrap FF crude金属配体亲和层析柱纯化带有组氨酸标记的重组蛋白质，获得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的重组糖苷水解酶测定其性质。在不同温度和PH条件下分别测定重组糖苷水解酶的对纤维素的酶活力，将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下糖苷水解酶的相对酶活性；将重组糖苷水解酶在不同的温度下保温30min，检测剩余酶活力。重复三次，取平均值。
[0081]实施方式6:9家族糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用及不同金属离子对其活性的影响
[0082](I)糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用
[0083]采用DNS法，分别测定CtAA9B、N24及混合酶在N24最适反应条件下的内切纤维素酶活性，混合酶为CtAA9B和N24等体积混合，反应体系为:9Β50 μ L，N2450 μ L，200 μ L的
0.5%CMC-Na, 100 μ L 的醋酸缓冲液(0.4mol/L、pH5.0)50°C反应 30min，加入 400 μ L DNS 试剂，煮沸lOmin，在540nm波长下测定光吸收值。以不加糖苷水解酶CtAA9B的反应体系中的酶活性定义为100%，分别计算糖苷水解酶CtAA9B、内切纤维素酶N24以及混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。
[0084](2)金属离子Mn2+对糖苷水解酶CtAA9B纤维素酶活性的影响
[0085]在反应体系中加入不同的金属离子，使其终浓度为lmmol/L，在糖苷水解酶CtAA9B最适反应条件下测定其内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下糖苷水解酶CtAA9B的相对酶活性。重复三次，取平均值。
[0086](3)金属离子Mn2+对混合酶活性的影响
[0087]在反应体系中加入不同的金属`离子，使其终浓度为lmmol/L，在内切纤维素酶N24最适反应条件下测定混合酶的内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。
[0088]实施方式7:表达CtAA9b基因的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9B的保藏
[0089]表达CtAA9b基因的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9B的保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期:2013年7月19日；酵母工程菌株编号为=CGMCC N0.7943 ;毕赤酵母工程菌株的分类命名为:巴氏毕赤酵母Pichia pastoris。
【权利要求】
1. 一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum获得热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9b,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体PPIC9K，获得表达重组质粒pPIC9K/CtAA9b，转化毕赤酵母GSl 15，从中筛选出表达热稳定糖苷水解酶基因CtAA9b的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9B，该糖苷水解酶CtAA9B对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用。
【文档编号】C12N15/81GK103484390SQ201310423132
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】李多川, 韩超 申请人:山东农业大学