表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌株的制作方法
【专利摘要】本发明是一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum热稳定热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS-CT-9A。通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomium?thermophilum获得糖苷水解酶基因CtAA9a，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，然后将得到的糖苷水解酶基因CtAA9a表达载体pPIC9K/CtAA9a导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一种表达糖苷水解酶基因CtAA9a的酵母工程菌GS-CT-9A。该工程菌表达的糖苷水解酶CtAA9A对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高1.3倍。在Mn2+条件下，CtAA9A和CtAA9A+N24的纤维素酶活性可分别提高14倍和2.4倍。CtAA9A具有良好的热稳定性和提高纤维素酶活力的能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。
【专利说明】表达9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌株(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达具体地说是以嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌株Pichia pastor isGS-CT-9A。
(二)【背景技术】
[0002]糖苷水解酶(英语:Glycoside hydrolases,又称糖苷酶)是一种专门水解配糖键(glycosidic bond)，并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。
[0003]嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源 的培养基中50°C条件下可以产生热稳定的纤维素酶和9家族糖苷水解酶。
[0004]嗜热毛壳菌产生的9家族糖苷水解酶CtAA9A具有微弱的纤维素酶活性，但对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，可使其活性提高1.3倍。在不同金属离子如Mn2+的作用下，CtAA9A和CtAA9A+N24的活性可分别提高14倍和2.4倍。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum获得内切β-1, 4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全长，命名为CtAA9a，CtAA9a基因DNA全长1053bp，包括信号肽序列，起始密码子和终止密码子，无内含子，编码328个氨基酸。具有信号肽序列(l-22aaMPSFVSKTLISALAGAASVAAH)及一个N糖基化位点和30个O糖基化位点。将CtAA9a编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。
[0006]构建重组表达质粒载体pPIC9K/CtAA9a，利用电转仪进行电击转化Pichiapastoris GSl 15，在MD和丽培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9A。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28°C 200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为3.26mg/ml，分子量为65KDa，酶活力为0.0437U/ml，9A在65°C下是稳定的，处理60min后仍有95%以上的酶活性；70°C处理30min后仍保持77%的活性；80°C处理30min后保持26%的活性；90°C处理30min活性几乎完全丧失。
[0007]9家族糖苷水解酶CtAA9A对嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高1.3倍。不同金属离子对CtAA9A和CtAA9A+N24混合酶活性具有促进或抑制作用，其中在Mn2+条件下，CtAA9A和CtAA9A+N24的纤维素酶活性可分别提高32倍和2.4倍。
(四)【专利附图】
【附图说明】:[0008]图19家族糖苷水解酶CtAA9A的SDS-PAGE分析
[0009]泳道1:低分子量蛋白标准
[0010]泳道2:纯化的9家族糖苷水解酶CtAA9A
[0011]图2A:9家族糖苷水解酶CtAA9A的最适温度B:9家族糖苷水解酶CtAA9A的热稳定性测定
[0012]图39家族糖苷水解酶CtAA9A对内切纤维素酶N24活性的促进作用
[0013]图4金属离子Mn2+对CtAA9A纤维素酶及混合酶活性的影响
(五)【具体实施方式】
[0014]实施例1:嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum的分离鉴定
[0015](I)标本采 集:从堆肥中采集。
[0016](2)分离培养:将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50°C培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson (1964)文献。
[0017](3)鉴定:参考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文献。
[0018]实施例2:糖苷水解酶基因CtAA9a的克隆
[0019](I)嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum总RNA的提取:参照Trizol试剂盒说明。
[0020](2)cDNA 第一条链的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0试剂盒说明书进行:取I?2 μ g总RNA，加RNase Free ddH20至9.5 μ L，将RNA样品在75°C变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分:10mmol/L dNTP Mixture2 μ L, IOXRT Buffer (Mg2+) 2 μ L，25mmol/L MgCl24 μ L, Oligod(T)-Adaptor Primerl μ L, RNase Inhibiter0.5 μ L, AMV Reverse Transcriptasel μ L(Final Volume20 μ L),将反应液混合后，室温下放IOmin,然后42°C温育60min,再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180 μ L DEPC处理的ddH20，稀释至200 μ L，混匀，稍微离心，保存于-20°C，备用。
[0021](3)PCR 反应(25μ L):cDNA2y L, 10XBuffer2.5 μ L, IOmmoI/L dNTP2 μ L, 25mmol/LMgC122y L，上、下游引物各 2μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L (5U/μ L)，ddH2012 μ L。反应条件为 94°C 5min 预变性；94°C 40s, 56°C 40s, 72°C lmin,共 32 个循环，72°C延伸 10min，4°C保存。
[0022]上游引物:5’ -ATGCCTTCATTCGTTTCGAAG-3 ’
[0023]下游引物:5，-TTAGTGGGCAGCAAGGTCAC-3，
[0024](4)基因克隆:取0.5μ I PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5CI菌株，在表面涂有氨卞青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
[0025](5 )质粒DNA的提取:碱法提取质粒DNA。
[0026](6)序列测定:DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序列引物为M13启动子引物。嗜热毛壳菌CtAA9a基因cDNA全长1053bp，包含起始密码子和终止密码子，无内含子，编码328个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第9家族。该序列如下:[0027](A)SEQ ID NOl 的信息
[0028](a)序列特征:*长度:1053碱基对；*类型:核酸；*链型:双链；*拓扑结构:线性
[0029](b)分子类型:DNA
[0030](C)假设:否
[0031](d)反义:否
[0032](e)最初来源:嗜热毛壳菌 Chaetomium thermophilum
[0033](f)序列描述:
[0034]
I ATGCCTTCAT TCGTTTCGAA GACTCTCATC TCTGCCCTCG CCGGCGCCGC CAGCGTCGCT
61 GCCCACGGCC ACGTCAAGAA TTTCGTCATC AACGGTCTGT CGTATCAGGC CTACGACCCG
121 ACCGTCTTTC CCTACATGCA AAATCCTCCC ATTGTCGCCG GCTGGACGTC CGCTMCACT
181 GACAACGGCT TCGTGGGCCC CGAGGACTAC TCGAACCCCG ATATCATCTG CCACAMTCG
[0035]
241 GCCACGMCG CCAAGGGTCA CGCGGTCATC AAGGCCGGTG ACTCTGTCTA CATCCAGTGG
301 GACACCTGGC CCGAGTCGCA CCACGGCCCG GTCATCGACT ACCTCGCTAG CTGCGGCAGC
361 GCCGGCTGCG AGACGGTCGA CAAGGCCCAG CTCGAGTTCT TCAAGATTGC CGAGGCCGGT
421 CTGATTGACG GCTCCCAGGC TCCCGGCAAG TGGGCTGCCG ATCAGCTTAT CGCCCAGAAC
481 AATTCGTGGC TGGTCACCAT CCCCGAGAAC ATCAAGCCAG GCTTCTACGT CCTCCGCCAC
541 GAAATTATCG CC.CTGCACAG CGCTGGCCAG ACAAACGGCG CCCAGAACTA CCCCGTCTGC
601 ATCAACCTCG AGGTCACTGG CGGCGGCAGC GACCTCCCCT CAGGAGTCAA GGGTACTGAG
661 CTGTACAAGC CCACCGACCC CGGCATCTTG ATCAACATCT ACCAGCCGCT CTCGAGCTAC
721 ACCATCCCTG GCCCTGCTCT GATGCCCGGC GCCAAGCCCG TCACCCAGCG CACTTCGGCC
781 ATCATCGGCA GCACCACCGC TATCACCGGC ACCGCCACCG CTGCTCCCGC CGCCCCAACC
841 TCAACCGCCG CTGCCACCAC CACTACCTCT GCTAATGCCA ACCCCATTCC GACTACCACC
901 CTCCGCACGA GCACCATCGC TCCTCAGCCC ACTGCTGCCC CCACCCAGAC CCCGACCTCC
961 CGCGTCGGCC AGCCCCCGCG CCCGACCCGC TGCCCTGGTC TGGACAACCT CAAGCGCGCT
1021 CGTCGCCATG CTCGTGACCT TGCTGCCCAC TAA
[0036](B)SEQ ID N02 的信息
[0037](a)序列特征:*长度:328氨基酸；*类型:氨基酸；*链型:单链；*拓扑结构:线性
[0038](b)分子类型:蛋白质
[0039](C)序列描述:
[0040]
I GHVKNFVING LSYQAYDPTV FPYMQNPPIV AGWTSANTDN GFVGPEDYSN PDIICHKSAT
61 NAKGHAVIKA GDSVYIQTOT WPES昍GPVI DYLASCGSAG CETVDKAQLE FFKIAEAGLI
121 DGSQAPGKWA ADQLIAQNNS WLVTIPENIK PGFYVLRHEI IALHSAGQTN GAQNYPVCIN
181 LEVTGGGSDL PSGVKGTELY KPTDPGILIN IYQPLSSYTI PGPALMPGAK PVTQRTSAII
241 GSTTAITGTA TMPAAPTST AAATTTTSAN ANPIPTTTLR TSTIAPQPTA APTQTPTSRV
301 GQPPRPTRCP GLDNLKRARR HARDLAAH
[0041]实施方式3:表达载体的构建
[0042](I)根据分离出的CtAA9a基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端分别引Λ Ecor I和Not I酶切位点，下游引物引入6个组氨酸序列，作为纯化标签:
[0043]h游引物:5’ -CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACGGCCACGTCAAGAAT-3’ (Ecor I);下游引物:5’ -TTGCGGCCGCTTAGTGGGCAGCAAGGTC-3’ (Not I )(组氨酸序列)
[0044](2)嗜热毛壳菌总RNA的提取:利用Trizol试剂提取。
[0045](3)反转录合成cDNA第一条链:取2yg总RNA，加入5X反应缓冲液4 μ L，IOmMdNTP2 μ L，核糖核酸酶抑制剂(40 — 200u/ μ L)0.5 μ L，引物 oligodT (I μ g/ μ L) I μ L，反转录酶(IOu/ μ L) 2 μ L，42°C反应60min，然后85°C IOmin终止反应，稀释至200 μ L。
[0046](4)PCR 反应(25μ L):cDNA2y L, 10XBuffer2.5 μ L, IOmmoI/L dNTP2 μ L, 25mmol/LMgCl22y L，上、下游引物各 2μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L (5U/μ L)，ddH2012 μ L。反应条件为 94°C 5min 预变性；94°C 40s, 56°C 40s, 72°C lmin,共 32 个循环，72°C延伸 10min，4°C保存。
[0047](5)基因克隆:取2yL PCR产物与pMD18 — T载体进行连接，获得重组质粒pMD18T/CtAA9a操作步骤按TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在涂有AMP的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
[0048](6 )质粒DNA提取:碱法提取质粒DNA。
[0049](7)用Ecor I和Not I对重组质粒pMD18_T/CtAA9a产物进行双酶切，同时用EcorI和Not I双酶切酵母表达质粒pPIC9K，DNA胶回收试剂盒回收纯化9a基因及载体pPIC9K片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pPIC9K/CtAA9a，重组质粒转化大肠杆菌JM109，在含Amp的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。
[0050]实施例4.表达糖 苷水解酶基因CtAA9a的酵母工程菌株的构建及筛选
[0051](I)重组表达质粒的线性化:将重组表达质粒pPIC9K/CtAA9a用限制性内切酶SacI线性化。
[0052](2)转化:电击转化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞,转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。
[0053](3)筛选:用灭菌牙签挑取转化子对应点种在丽和MD平板上，30°C培养2 — 4d,挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于250 μ g/mL,300 μ g/mL,400 μ g/mL,500 μ g/mL,600 μ g/mLG418 的 YPD 平板上筛选多拷贝转化子。
[0054]实施方式5:毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测
[0055](I)将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，30 °C 250rpm/min摇床培养24h(OD600达2 — 6)，离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至0D_值为1.0，300C 250rpm/min继续培养，每24h补充甲醇至终浓度为0.5%，每24h取样，室温10，OOOg离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。
[0056](2)酶活性检测:酶活性测定采用DNS法，反应体系及反应条件为100 μ L的酶液，加入200 μ L的0.5%微晶纤维素，100 μ L的醋酸缓冲液(0.4mol/L、pH5.0)60°C反应30min，加入400 μ L DNS试剂，煮沸lOmin，在540nm波长下测定光吸收值。对照组用失活的酶液做对照。以失活酶液的活性定义为100%，测定糖苷水解酶CtAA9A的相对酶活性。重复三次，取平均值。蛋白含量测定采用Bradford法。[0057](3)重组糖苷水解酶CtAA9A的最适反应温度、pH及热稳定性:诱导表达的重组糖苷水解酶经过GE公司的HisTrap FF crude金属配体亲和层析柱纯化带有组氨酸标记的重组蛋白质，获得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的重组糖苷水解酶测定其性质。在不同温度和PH条件下分别测定重组糖苷水解酶的对纤维素的酶活力，将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下糖苷水解酶的相对酶活性；将重组糖苷水解酶在不同的温度下保温30min，检测剩余酶活力。重复三次，取平均值。
[0058]实施方式6:9家族糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用及不同金属离子对其活性的影响
[0059](I)糖苷水解酶对内切纤维素酶N24活性的促进作用
[0060]采用DNS法，分别测定CtAA9A、N24及混合酶在N24最适反应条件下的内切纤维素酶活性，混合酶为CtAA9A和N24等体积混合，反应体系为:CtAA9A50 μ L，N2450 μ L，200 μ L的 0.5%CMC-Na, 100 μ L 的醋酸缓冲液(0.4mol/L、pH5.0)50°C反应 30min，加入 400 μ L DNS试剂，煮沸lOmin，在540nm波长下测定光吸收值。以不加糖苷水解酶CtAA9A的反应体系中的酶活性定义为100% ，分别计算糖苷水解酶CtAA9A、内切纤维素酶N24以及混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。
[0061](2)金属离子Mn2+对糖苷水解酶CtAA9A纤维素酶活性的影响
[0062]在反应体系中加入不同的金属离子，使其终浓度为lmmol/L，在糖苷水解酶CtAA9A最适反应条件下测定其内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下糖苷水解酶CtAA9A的相对酶活性。重复三次，取平均值。
[0063](3)金属离子Mn2+对混合酶活性的影响
[0064]在反应体系中加入不同的金属离子，使其终浓度为lmmol/L，在内切纤维素酶N24最适反应条件下测定混合酶的内切纤维素酶活性，不加金属离子反应体系中的酶活性定义为100%，计算不同金属离子条件下混合酶的相对酶活性。重复三次，取平均值。
[0065]实施方式7:表达CtAA9a基因的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9A的保藏
[0066]表达CtAA9a基因的毕赤酵母工程菌株GS_CT_9A的保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期:2013年7月19日；酵母工程菌株编号为:CGMCC N0.7946 ;毕赤酵母工程菌株的分类命名为:巴氏毕赤酵母Pichia pastoris。
【权利要求】
1.一种表达嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9a的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR方法从嗜热毛壳菌Chaetomiumthermophilum获得热稳定9家族糖苷水解酶基因CtAA9a,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体PPIC9K，获得表达重组质粒pPIC9K/CtAA9a，转化毕赤酵母GSl 15，从中筛选出表达热稳定糖苷水解酶基因CtAA9a的毕赤酵母工程菌株GS-CT-9A，该糖苷水解酶CtAA9A对内切纤维素酶的活性具有明显`的促进作用。
【文档编号】C12R1/84GK103436456SQ201310423134
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】李多川, 韩超 申请人:山东农业大学