鸭mef2b基因的编码序列及其克隆方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭MEF2B基因的编码序列及其克隆方法。本发明对鸭的组织提取总RNA，并将总RNA逆转录为cDNA第一条链后，设计特异性引物，利用该特异性引物，并运用RT?PCR方法结合A/T克隆技术对鸭MEF2B基因进行克隆，经过实验证明，本发明的方法准确性高，结果可靠，能为构建鸭MEF2B基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。
【专利说明】
鸭MEF2B基因的编码序列及其克隆方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，尤其是一种鸭MEF2B基因的编码序列及其克隆方法。
【背景技术】
[0002] 肌细胞增强因子2B(MEF2B)基因属于肌细胞增强因子2家族(Myocyte-specific enhancer binding factor 2，MEF2)中的一员，研究表明，多种生理过程与MEF2基因家族相 关，如骨骼发育、肌肉形成、肝脏纤维化和神经系统发育，MEF2于肌肉细胞中广泛存在，在与 大多数肌肉特异基因的启动子或增强子直接结合后，能够启动或增强基因的相关表达，该 基因可作为肌源性基因表达的主要调节物。MEF2B基因位于脊椎动物中MEF2家族进化树的 基部，距离其它成员最远，因此其缺少HJURP_C区域，仅含有MADS-box结构域。
[0003] Hidaka等（1995)在研究MEF2B基因与其同源的基因在小鼠胚胎性癌细胞P19(简称 EC细胞)差异性表达的时候发现，在P19细胞分化的过程中，MEF2A和MEF2D基因的转录出现 上调，而MEF2B基因的转录却大量存在于未分化的P19中，在畸胎瘤细胞(F9细胞)和胚胎干 细胞(ES细胞）以及成年小鼠心脏、骨骼肌或脑组织中出现下调，由此说明小鼠的MEF2B基因 可能在胚胎发育的过程中与MEF2基因家族的其他成员有着不同的功能。MEF2B基因很有可 能替代MEF2C基因的作用，如果在胚胎时期敲出MEF2C基因，MEF2B基因的表达量会显著上升 (Lin等，1997) ding等（2013)认为MEF2B基因的突变，可导致弥漫性大B细胞淋巴瘤原癌基 因 BCL6的表达束缚受到抑制。
[0004] 研究指出，MEF2B在多种肌肉及神经组织中高表达，何波（2006)对猪的MEF2B和 MEF2C基因的组织表达谱分析发现，两个基因在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪和睾丸等8个组 织中均能检测到表达，且表达量都较高，通过对骨骼肌体外培养发现，随着分化程度的深 入，它们的表达量也越来越高。祁艳霞等(2013)利用荧光实时定量PCR技术分析了南阳黄牛 3月龄到24月龄间背最长肌组织中MyoD和MEF2基因家族的表达变化情况，结果表明MEF2B基 因的表达呈持续上升趋势。程波(2012)报道，MEF2B基因在山羊个体的不同组织间均能检测 至 1J，但表达量有着不同的规律。
[0005] 上述研究结果提示，鸭MEF2B基因可能与其生产水平、肉质性状等有关联。国内鸭 MEF2B基因的相关研究报道，NCBI数据库中暂无鸭MEF2B基因序列及相关的文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是:提供一种鸭MEF2B基因的编码序列及其克隆方法，它准确性高， 结果可靠，为构建鸭MEF2B基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材 料。
[0007] 本发明是这样实现的：鸭MEF2B基因的编码序列，它具有如序列表中SEQ ID N0 :1 所示的核苷酸序列。
[0008] 克隆鸭MEF2B基因 CDS区序列的方法，对鸭的组织提取总RNA，并将总RNA逆转录为 cDNA第一条链后，根据同源物种设计特异性引物，F:ATGGGCCGGAAAAAAATCCA，R: CTATCTCTGCCAAACGTCCACGG;运用RT-PCR方法结合A/T克隆技术对鸭MEF2B基因进行克隆，将 RT-PCR扩增产物与pGEM-T载体连接，构建pGEM-T-MEF2B重组质粒，即完成了对鸭MEF2B基因 ⑶S区序列的克隆。
[0009]由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明对鸭的组织提取总RNA，并将 总RNA逆转录为cDNA第一条链后，设计特异性引物，利用该特异性引物，并运用RT-PCR方法 结合A/T克隆技术对鸭MEF2B基因进行克隆，经过实验证明，本发明的方法准确性高，结果可 靠，能为构建鸭MEF2B基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。
【附图说明】
[0010] 图1为鸭MEF2B基因 RT-PCR凝胶电泳检测图； 图2为鸭MEF2B基因构建pGEM-T-MEF2B重组质粒PCR凝胶电泳检测图。
【具体实施方式】
[0011 ]本发明的实施例:用于克隆鸭MEF2B基因编码区序列的引物及方法 1、 鸭总RNA提取及cDNA的合成 采取鸭胸肌组织液氮速冻，-80°C超低温冰箱保存，用于总RNA抽提，参照TRizol Reagent试剂（life/Invitrogen, USA)说明书进行，将所得总RNA逆转录为cDNA的第一条 链，cDNA 合成根据 Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis (K1622)逆转录试剂盒合成， 2、 鸭MEF2B基因⑶S区序列引物设计 欲扩增鸭MEF2B基因 CDS区序列由于该基因在鸭物种上NCBI尚未给出，故采用物种同源 性的方法采用鸡的MEF2B基因（GenBank:XM_004948890.2)和紫翅椋鸟MEF2B基因（GenBank: XM_014887170.1)mRNA序列运用NCBI中Primer-BLAST在线设计引物进行设计，引物由上海 英潍捷基生物有限公司合成，引物具体信息见表1。
[0012] 3、鸭MEF2B基因 CDS区RT-PCR扩增反应： 反应条件:95°C预变性5 min，94°C变性40 s，退火35 s(退火温度详见表2-3)，72 °C延 伸45 s，72 °C终延伸10 min，4 °C保存，32循环。
[0013] 反应体系：采用30 yL反应体系，其中：2X PCR Master Mix (北京天根）13 μ L，上、下游引物各2 yL(浓度均为 10 ymol/L)，cDNA模板2yL(1550 ng/yL)，加 RNase-free water补足至30 yL〇
[0014] 4、重组质粒的构建及测序 鸭MEF2B基因⑶S区PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后（图1)，采用AXYGEN柱式DNA胶回 收试剂盒进行RT-PCR产物切胶回收纯化，纯化产物按照 pGEM-T载体试剂盒说明书进行操作，采用蓝白斑法筛选克隆产物，最终提取重组质粒 (图2)送往上海英潍捷基生物有限公司测序。
[0015] 5、测序结果验证 扩增目的片段(鸭MEF2B基因的编码序列）长度为1221 bp，其具体序列如序列表中SEQ ID N0 :1所示。其中包含起始密码子ATG和终止密码子TAG，所得片段长度与其他物种 MEF2B基因⑶S区片段长度相近，经NCBI在线保守结构域预测发现，该序列含有含有MADS-box保守区域，不含HJURP_C区域，符合脊椎动物MEF2B基因结构，说明鸭的MEF2B基因⑶S区 序列克隆成功。
【主权项】
1. 一种鸭MEF2B基因的编码序列，其特征在于：它具有如序列表中SEQ ID NO :1所示 的核苷酸序列。2. -种克隆鸭MEF2B基因⑶S区序列的方法，其特征在于:对鸭的组织提取总RNA，并将 总RNA逆转录为cDNA第一条链后，设计特异性引物，F:ATGGGCCGGAAAAAAATCCA，R: CTATCTCTGCCAAACGTCCACGG;运用RT-PCR方法结合A/T克隆技术对鸭MEF2B基因进行克隆，将 RT-PCR扩增产物与pGEM-T载体连接，构建pGEM-T-MEF2B重组质粒，即完成了对鸭MEF2B基因 ⑶S区序列的克隆。
【文档编号】C12N15/12GK106046138SQ201610434425
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】李辉, 赵忠海, 卜小雁, 易恒洁, 彭邦星, 师新彩, 张蓉
【申请人】贵州大学