专利名称：山羊tnnt3基因及克隆山羊tnnt3基因编码区全序列的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种山羊TNNT3基因及克隆山羊TNNT3基因编码区全序列的方法。
背景技术：
快肌肌钙蛋白(TNNT3)是存在于骨骼肌中的钙离子结合蛋白复合物成员之一。肌钙蛋白T(TNT)与肌钙蛋白C和肌钙蛋白I 一起形成三元肌钙蛋白复合物，在肌肉的收缩和舒张中起着关键作用。TNNT3是一种非对称性蛋白质，伴有一球形C端功能区，它有一个与原肌凝蛋白结合的位点，是负责将肌钙蛋白复合物与原肌凝蛋白相结合的蛋白质。协调肌丝的钙离子浓度依赖性ATP酶活性，从而在肌细胞收缩和舒张过程中发挥作用。目前还没有山羊TNNT3基因的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种克隆山羊TNNT3基因编码区全序列的方法，以及山羊TNNT3基因的完整编码区序列。采用如下技术方案山羊TNNT3基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO :1。所述的山羊TNNT3基因，所述基因的编码区序列为SEQ ID NO :2。所述的山羊TNNT3基因，所述基因的编码区序列编码氨基酸为SEQ ID NO :3。所述的山羊TNNT3基因的克隆方法，包括如下步骤步骤一提取山羊腿肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；步骤二引物的设计及PCR反应；依据已发表的牛的TNNT3基因的序列设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计； 所述简并引物为上游引物P1 5 ‘ -CAGCCGTAGAAAGCACC-3 ‘下游引物P2:5' -CACTCTACTTCCAGCACCC-3 ‘用所述cDNA为模板进行梯度PCR反应；步骤三PCR产物的回收和纯化；步骤四克隆。所述的方法，所述步骤二中，所述PCR反应体系为PCR反应体系为50 μ 1体系 25 μ L 的 2 XMaster Mix Tap,上下游引物各 2. 5 μ L，10 μ L 的 cDNA，10 μ L 的 ddH20 ；反应条件为 95°C预变性 5min，35 个循环(94°C,40s ；53，40s ；72°C，50s)，最后 72°C IOmin0本发明简单、快捷的获取了山羊TNNT3基因的完整编码区序列，填补了该基因在山羊上的空白，为进一步研究山羊的该基因奠定了基础。该技术相比较分段克隆和RACE技术而言，目的PCR片段的长短大致明确，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的优势。
图1是TNNT3基因克隆阳性菌的普通PCR产物电泳图。图2是山羊TNNT3基因编码区的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。步骤一提取山羊腿肌组织中的总RNA (核糖核酸)，然后将总RNA反转录成cDNA ；1.组织的采集选取周岁的天府肉羊颈动脉放血后立即取约Ig腿肌放入液氮罐中用于提取总 RNA2. RNA的制备及cDNA的合成在实验室用液氮将山羊腿肌磨成粉末装入1. 5ml的EP管，放入零下80的超低温冰箱中备用。取新的1. 5ml的EP管，加入1. 2ml的Trizol液，然后加入约80mg的腿肌组织粉末。立即用手摇晃混勻后，用震荡仪震荡约30秒后室温放置4分钟。4°C下13500rpm离心3分钟将液体用移液枪转运到另一个新的1. 5ml的EP管，并往这个新EP管中加入0. 2ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管约15秒，然后4°C下 13000rpm离心8分钟。离心结束以后用移液枪将这个EP管中的上层水相约0. 5ml移入一新的离心管，加入0. 5ml的异丙醇，室温放置10分钟，接着4°C下12000rpm离心10分钟。 弃去上清液，加入Iml的75%乙醇(DEPC水配制)混勻，4°C下7500g离心5分钟。小心弃去上清液，然后然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，注意不要把RNA吸掉，然后根据RNA量的多少，加入50到150 μ L的DEPC水。用1. 5%琼脂糖电泳法检测RNA 的质量，将效果好的RNA立即反转录成cDNA。步骤二引物的设计及PCR反应；依据已发表的牛的TNNT3基因的序列(登录号为NM_001001441)设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计。设计的引物为上游引物P1 5 ‘ -CAGCCGTAGAAAGCACC-3 ‘下游引物P2 5 ‘ -CACTCTACTTCCAGCACCC-3 ‘用cDNA为模板进行普通PCR反应，扩增TNNT3基因，退火温度53°C。PCR反应体系为 50 μ 1 体系 L 的 2XMaster Mix Tap，上下游引物各 2. 5 μ L，10 μ L 的 cDNA，10 μ L 的 ddH20.)，反应条件为 95 0C 预变性 5min, 35 个循环(94°C，40s ；53，40s ；72 °C，50s)，最后 720C IOmin0反应结束后将约有SOObp的PCR产物收集到一个EP管中并切胶回收。简并引物PI、P2不会出现影响PCR反应的发夹结构，引物二聚体，上下游引物交联。适宜的PCR反应温度范围跨度大。步骤三PCR产物的回收和纯化；PCR产物用宝生物胶回收试剂盒纯化回收，具体操作步骤为a. PCR产物经2.0%琼脂糖120V电泳分离后，在紫外光下用一次性刀片切下约800bp的DNA条带，装入1. 5mL的EP管中，将胶轻柔切碎。b.在离心管中加入600 μ 1的溶胶液Α，放置于55°C水浴锅中水浴IOmin溶胶，中
间取出离心管缓慢摇动一到两次。c.胶溶解后放至室温，加入加20 μ L溶液B，混勻，转入离心柱，8000rpm离心40s。d.弃离心液，将柱子放入新的1.5mlEP管中，加50(^1^洗脱液(，8000印111离心 Imin重复此步骤3次。e.将离心柱放入新离心管，加20 μ 1灭菌蒸馏水，浸润lOmin，IOOOOrpm离心 1. 5min。f.离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液。g.取2μ L回收产物于1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度。步骤四克隆；(1)目的片段与载体连接将回收、检测后的目的片段与PMD-18T载体连接，根据TaKaRa的pMD_18T载体试剂盒使用说明书，操作连接体系为PMD-18T Vectorl.OyL纯化回后的PCR片段4. OyL连接液 Ligase buffer5. 0 μ LTotal10. 0μ L以上操作在冰上进行，稍离心混勻，16°C在PCR仪中连接过夜，-20°C保存备用。(2)大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)a.挑取大肠杆菌Dffia菌种，在LB琼脂板上画线，37°C培养过夜(12_16h)。b.挑取单菌落，接种到IOOmL LB液体培养基中。37°C 190rpm振荡培养12h，当 ODD600值达到0. 4-0. 5时(轻摇培养基肉眼可见云雾状)，停止培养。c.将菌液以50mL/份分装至预冷的IOOmL灭菌离心管中，冰浴10_15min，4000rpm 4°C离心 IOmin0d.弃上清，每管用50mL的预冷的0. IMol的CaCl2 (液体中有冰粒效果最好)重悬菌体沉淀，冰浴30min后，4000rpm 4°C离心3min。e.弃上清，每管用IOmL预冷的0. IM的CaCl2重悬菌体沉淀，冰浴10-15min，即为感受态细胞。f.现制现用。或将制备好的感受态细胞加入30%甘油至终浓度为15-20%，混勻， 分装成200uL/份，投入液氮快速冷冻后-80°C保存(3)连接产物的转化a.从_80°C冰箱取出保存的感受态细胞，置于冰上解冻。b.将2. 5μ1连接产物缓慢打入200μ1的感受态细胞中，动作要轻柔，冰浴 20minoc. 42°C水浴热激90s (中间不能摇晃离心管)，迅速取出置于冰上，冰浴5-lOmin。d.加入800 μ 1 LB液体培养基(不加Amp)，于37°C、小于150rpm振荡培养50min 以复苏细胞。e.3000rpm离心5min，吸去部分上清，轻柔悬浮细菌，涂布于选择性平板上。待液
5体完全渗入琼脂后，倒扣平板，于37°C恒温培养箱中培养9_16h。(4)阳性菌落的筛选随机挑选菌落接种于LB氨节培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，用于相应基因PCR扩增相同的引物及反应条件进行扩增。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 (图1)，将扩增产物与目的片段大小一致的菌液0. 5mL装入1. 5ml EP离心管中，加入30% 甘油。交送宝生物工程技术有限公司完成测序。步骤五检验试验的正确性；将测序结果在NCBI上运用blast在线比对软件以验证序列的正确性和该方法的可靠性。结果表明该方法获得的山羊TNNT3基因完整编码区序列的核苷酸序列与其他已知的哺乳动物的TNNT3基因序列同源性为91. 47% 99. 18%。表明该方法能达到获得山羊 TNNT3基因的完整编码区序列的目的。获得的山羊TNNT3基因序列为SEQ ID N0:1，编码区序列为SEQ ID NO :2，编码氨基酸序列SEQ ID NO :3。本技术简单，快捷的获取了山羊TNNT3基因的完整编码区序列，填补了该基因在山羊上的空白，为进一步研究山羊的该基因奠定了基础。该技术相比较分段克隆和RACE技术而言，目的PCR片段的长短大致明确，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的优势。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.山羊TNNT3基因，其特征在于，其特征在于，其核苷酸序列为SEQID N0:1。
2.根据权利要求1所述的山羊TNNT3基因，其特征在于，所述基因的编码区序列为SEQ ID NO :2。
3.根据权利要求1所述的山羊TNNT3基因，其特征在于，所述基因的编码区序列编码氨基酸为 SEQ ID NO :3ο
4.权利要求1所述的山羊ΤΝΝΤ3基因的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤一提取山羊腿肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；步骤二引物的设计及PCR反应；依据已发表的牛的TNNT3基因的序列设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；所述简并引物为上游引物 P1 5 ‘ -CAGCCGTAGAAAGCACC-3 ‘ 下游引物 P2 5 ‘ -CACTCTACTTCCAGCACCC-3 ‘ 用所述cDNA为模板进行梯度PCR反应； 步骤三PCR产物的回收和纯化； 步骤四克隆。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述PCR反应体系为 PCR反应体系为50 μ 1体系25μ L的2XMaster Mix Tap，上下游引物各2. 5 μ L，10 μ L的 cDNA, IOyL 的 ddH20 ；反应条件为 95°C预变性 5min，35 个循环(94°C，40s ；53,40s ；72°C, 50s)，最后 720C IOmin0
全文摘要
本发明公开了山羊TNNT3基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO1。编码区序列为SEQID NO2。编码区序列编码氨基酸为SEQ ID NO3。还公开了一种山羊TNNT3基因的克隆方法，包括如下步骤步骤一提取山羊腿肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；步骤二引物的设计及PCR反应；步骤三PCR产物的回收和纯化；步骤四克隆。本发明简单、快捷的获取了山羊TNNT3基因的完整编码区序列，填补了该基因在山羊上的空白，为进一步研究山羊的该基因奠定了基础。
文档编号C07K14/47GK102181452SQ20111007476
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者吴婷婷, 徐刚毅, 汪代华, 陈浩林 申请人:四川农业大学