一种获得山羊Dlk1基因新转录剪切体的方法
【专利摘要】本发明属于家畜基因工程【技术领域】，公开了一种获得山羊Dlk1基因新的转录剪切体的方法。首先从南江黄羊肌肉组织中分离出核糖核酸；设计特定的引物组，利用巢式PCR扩展出cDNA片段。经过克隆和测序分析证实了在山羊Dlk1基因转录过程中存在3种剪切形式，包含外显子的部分及全部缺失。这一发现为研究山羊Dlk1基因的表达及功能究奠定了重要基础。
【专利说明】一种获得山羊Dlkl基因新转录剪切体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于家畜基因工程【技术领域】，具体涉及一种获得山羊^7^7基因新转录剪切体的方法。
【背景技术】
[0002]Dlkl基浪(Delta-like homolog 2 )位于印记域内，参与哺乳动物的脂肪积累及葡萄糖代谢过程。Dlkl基因也被称为脂肪前体因子I 0°^/-7)，其蛋白为跨膜糖蛋白，包含六个串联重复表皮生长因子样的胞外基序，结构类似Notch信号家族分子，但与Notch家族配体不同的是Dlkl的N端缺乏DSL (Delta:Serrate:Linl2)结构域，因而不能激活Notch信号的受体分子。体外内研究均表明基因参与多个组织的分化，抑制脂肪的生成，可能作为Notch信号分子的拮抗物来参与Notch信号通路的调控。人体内缺乏Dlkl表达会导致肥胖；敲除的转基因小鼠表现为中度肥胖，同时其体内脂肪含量增加30%，表明Dlkl基因可以抑制脂肪细胞的分化。
[0003]目前，研究发现在人、小鼠、牛和猪基因中存在多种转录剪切体(A，B, C，C2,D, D2和E型)，其中A型和B型剪切体编码具有抑制脂肪细胞分化功能的长链可溶蛋白；其它剪接体编码不具抑制功能的短链蛋白。另外，研究还发现过量表达的转基因小鼠也会出现肌肉肥大。在猪多个组织中均有似左7-AAJh-B取DlkK2表达，其中似左7-C2表达量最高，推测在猪肌肉生长和脂肪沉积等方面发挥着重要的作用。目前在山羊上还未见有关^7^7基因不同转录剪切体的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供山羊^7^7基因的新转录剪切体、其扩增引物及扩增方法。
[0005]本发明所述的山羊Dlkl基因，有三种转录剪切体DlldH Dlkl~kS2和似々7-AS3，其核苷酸序列分别如SED ID N0.1，SED ID N0.2和SED ID N0.3所示。
[0006]本发明提供了用于扩增山羊似左2基因的两组扩增引物:
正向外引物Dlkl-1F的核苷酸序列如SED ID N0.4所示；
反向外引物Dlkl-1R的核苷酸序列如SED ID N0.5所示；
正向内引物Dlkl-2F的核苷酸序列如SED ID N0.6所示；
反向内引物Dlkl-2R的核苷酸序列如SED ID N0.7所示。
[0007]本发明还提供了一种扩增山羊^7^7基因，包括三种转录剪切体i?7i7-ASl，DlAl-AS2和D7A7-AS3的方法，步骤如下:
步骤1:提取山羊肌肉组织的总RNA ；
步骤2:从近缘物种人，小鼠，牛和猪^7^7基因序列中分析保守序列，以此作为参考来设计所述引物组；
步骤3:以步骤I所得总RNA为模板，以所述的两组引物为引物，通过巢式PCR扩增获得山羊似左7基因的片段。
[0008]对所得序列用NCBI网站进彳丁 blastn在线分析,与/7/^7序列一致性最闻的序列都IDlkl在哺乳动物中的同源序列，可以确定所得序列为山羊^7^7基因。
[0009]利用Clustalx V2.0软件对山羊Dlkl基因(包括三种转录剪切体DlklH,Dlkl-AS2和D7^7-AS3)的核苷酸序列进行比对分析并使用MEGA5.2软件构建NJ树。
[0010]本发明以山羊肌肉组织为材料，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、巢式聚合酶链式反应(nested-PCR)，对山羊左7基因进行了研究，首次从山羊肌肉组织中克隆得到了 Dlkl基因三种转录剪切体iDlkl-b&\，Dlkl-b&2和似左7-AS3 )，并对其同源性和进化地位进行了分析，对研究山羊基因不同转录剪切体在脂类代谢过程发挥的生物学功能具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的山羊07^7基因的转录剪切体I序列片段。
[0012]序列表SEQ ID NO:2是本发明克隆的山羊似左2基因的转录剪切体2序列片段。
[0013]序列表SEQ ID NO:3是本发明克隆的山羊似左2基因的转录剪切体3序列片段。
[0014]图1:山羊似左7基因不同转录剪切体PCR产物电泳检测图。
[0015]图2:山羊基因不同转录到切的不意图，箭头表不所述引物位直。
[0016]图3:近缘哺乳动物Dlkl基因编码区序列的NJ系统进化树。
具体实施方案
[0017]以下结合附图，通过实施例对本发明进一步详细说明。
[0018]本发明中山羊采自四川省南江黄羊育种场，RNA提取纯化等试剂购自Invitrogen公司，PCR试剂购自宝生物(大连)有限公司(Takara)。
[0019]总RNA提取:取10mg山羊肌肉组织在研钵中加液氮研磨，用Trizol法提取总RNA, Trizol试剂购自Invitrogen公司，提取方法根据使用说明书。
[0020]山羊Dlkl基因序列的克隆，包括三个转录剪切体DmH DU1-AS2和DlklU:
通过比对已公开的近缘哺乳动物(人、小鼠、牛和猪)的似左2基因序列得到保守区，在保守区序列设计两组引物扩增山羊^7^7基因。
[0021]山羊基因的克隆:
使用正向外引物Dlkl-1F与反向外引物Dlkl-1R进行第一轮PCR扩增，对扩增产物用正向内引物Dlkl-2F与反向内引物Dlkl-2R进行第二轮PCR扩增，获得山羊左7基因的目的片段；
Dlkl-1F:5’ TCCGCAACCAGAAGCCCAG 3’
Dlkl-1R:5’ GCGTAGCGTTCACCAGATTTG 3’
Dlkl-2F:5’ CTTGCTCCTGCTGGCTTTC 3’
Dlkl-2R:5’ GTGGTCATGTCGATCTTCTC 3’
第一轮PCR:
扩增反应体系如下:
【权利要求】
1.作为山羊Dlkl基因新的转录剪切体，它们的核苷酸序列如序列表SEQID NO:1,SEQID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所述。
2.根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于:其中SEQID NO:1片段未发现缺失序列；SEQ ID NO:2片段缺失从第三外显子第13个核苷酸到第五外显子第205个核苷酸序列，包括部分第三和第五外显子序列，完整第四外显子序列；SEQ ID NO:3片段缺失从第三外显子第43个核苷酸到第五外显子第103个核苷酸序列，包括部分第二和第六外显子序列，完整第三、第四和第五外显子序列。
3.检测权利要求1所述遗传标记的正、反向引物组的DNA序列如下所示:
Dlkl-1F:5’ TCCGCAACCAGAAGCCCAG 3’
Dlkl-1R:5’ GCGTAGCGTTCACCAGATTTG 3’
Dlkl-2F:5’ CTTGCTCCTGCTGGCTTTC 3’
Dlkl-2R:5’ GTGGTCATGTCGATCTTCTC 3’。
4.制备如权利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步骤:
利用NCBI数据库信息，比对人、小鼠、牛和猪Dlkl基因得到保守区，在保守区设计引物扩增山羊Dlkl基因，提取山羊肌肉组织RNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列。
【文档编号】C12N15/11GK104164437SQ201310186871
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月20日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】仲涛, 张红平, 李利, 靳鹏飞, 王林杰 申请人:四川农业大学