实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法及其应用，方法包括以下步骤：S1：在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物作为对照引物；S2：对待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第一引物，第一引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向上游步移预定距离；S3：对待测基因的PolyA位点进行定位：自终止密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第二引物，第二引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向下游步移预定距离；S4：对对照引物、第一引物和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析，确定待测基因的转录起始位点和PolyA位点。
【专利说明】实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PoIyA位点的 方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因转录【技术领域】，更具体地，涉及一种实时荧光定量PCR定位基因 转录起始位点和PolyA位点的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 真核生物的DNA转录发生在细胞核中，是遗传信息由DNA转换到RNA的过程，包括 启动、延伸和终止阶段。在起始阶段，RNA聚合酶在 〇亚基引导下识别并结合到启动子上， 形成由酶、DNA和核苷三磷酸（NTP)构成的三元起始复合物。在延伸阶段，核心酶沿着DNA 分子向前移动，随着碱基的加入，新生的RNA链不断生长。在转录终止阶段，RNA聚合酶在 Nus A因子帮助下识别转录终止信号，停止转录，RNA链离开模板。此时生成的mRNA称为前 体mRNA，须经过一系列转录后加工过程并转移到细胞质中才能表现出翻译功能。mRNA的加 工过程主要包括加帽（5'端形成特殊的帽子结构），加尾（3'端切断并加上多聚腺甘酸尾 巴）、剪接（去除内含子并拼接外显子）和甲基化（链内核苷酸甲基化）。真核生物的mRNA 都有5'帽子结构，即在转录起始后不久在5'端三磷酸脱去一个磷酸，然后与GTP反应生成 5'，5'_三磷酸相连的键，并释放出焦磷酸，最后以S-腺甘蛋氨酸（SAM)进行甲基化产生帽 子结构。5'帽子有助于mRNA穿过核膜，保护5'端不被降解以及翻译起始阶段时供eIF4E 识别等作用；5'非翻译区（5' Untranslated region, 5' UTR)在AUG附近含有核糖体结合 位点，核糖体在此组装。真核生物的前体mRNA通常还含有终止密码子下游0. l-9kb长的序 列，核酸内切酶在PolyA位点上切除多余序列，并在PolyA聚合酶的作用下添加20-200个 腺甘酸残基，形成多聚腺甘酸的尾巴结构。多聚腺甘酸的尾巴具有增强mRNA的稳定性、控 制mRNA的亚细胞定位和指导特定氨基酸的编码等作用。完整的基因转录本包括5'UTR、编 码区和3' UTR。
[0003] 全基因组测序提供了大量的DNA序列，要从中将遗传信息解读出来首先要识别基 因，特别是基因转录调控信息。通常情况下，先利用软件如GRAIL、FGENEH、WebGene、GENSCAN 对全基因进行扫描，然后再用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)技术克隆基 因的非翻译区，从而确定转录起始位点和PolyA位点。
[0004] CL0NTECH开发的5' -Full RACE kit (货号：D315)基于去帽子原理克隆cDNA 5' 末端的完整序列，3'_Full RACE Core Set with PrimerScript RTase (货号：D314)使用改 良的PrimeScript反转录酶克隆cDNA 3'末端的完整序列。其原理是将目的基因的5'非翻 译区的5'端和3'非翻译区的3'端连上接头，在接头的不同部位设计一条外侧引物和一条 内侧引物（公司提供），再在基因编码区设计对应的外侧和内侧引物（用户自备），利用套 式PCR克隆cDNA的5'非翻译区和3'非翻译区。但是任何克隆技术都不能从根本上解决特 异性差和扩增效率低下的问题。尽管RACE试剂盒采用两轮PCR扩增以提高目的片段的特 异性，但是由于每对引物中要有一条引物与接头配对，导致实际只有用户自备的两条与编 码区配对的引物参与筛选，仅相当于一次普通PCR，因此不可避免地出现非特异性扩增。未 知基因的非翻译区长度很难利用软件准确预测，更加大了克隆的难度，如果能够确认目的 片段的长度，就可以通过改变PCR反应条件来提高特异性，例如改变引物退火温度、延伸时 间和控制模板的量等。扩增效率低下是目前所有PCR扩增都面临问题，片段越长，扩增效率 越低。同一物种中非翻译区长度变化很大，从十几个碱基到数千个碱基不等，例如Mignone 等人（2002)分析了 5464个无脊椎动物5'UTR，最长的为4498bp ;3736个3'UTR，最长的为 9142bp。在理想状态下，5'-FullRACEkit(货号：D315)最长也仅能得到3.2kb的PCR扩 增产物（见D315技术手册）；而实际情况下，500bp以上的片段扩增效率明显下降，克隆难 度增加。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法，该方法使用 范围宽，灵敏度和精确度高。
[0006] 本发明还提出一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和Po I yA位点的方法 在检测试剂盒中的应用。
[0007] 根据本发明第一方面实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA 位点的方法，包括以下步骤：Sl :在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引 物作为对照引物；S2 :对所述待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子 起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第一引物，所述第一引物的扩增片段大小为第二 预定个数的碱基对，并向上游步移预定距离；S3 :对所述待测基因的PolyA位点进行定位： 自终止密码子起，每隔第一预定个数的碱基对设计一对第二引物，所述第二引物的扩增片 段大小为第二预定个数的碱基对，并向下游步移预定距离；S4 :对所述对照引物、第一引物 和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析，确定所述待测基因的转录起始位点 和PolyA位点。
[0008] 根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PoIyA位点的方 法，用qRT-PCR技术同时检测基因不同区段的表达丰度，对转录起始位点和PloyA位点进行 精确定位，解决目的基因非翻译区长度不确定性问题，使RACE克隆过程中的引物设计摆脱 对编码区的依赖，将设计位点前移到起始位点和PloyA位点附近，只需扩增500bp以内的小 片段，就可以克隆出非翻译区，该方法使用范围宽泛，并且定位的灵敏度和准确度高。
[0009] 另外，根据本发明上述实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和 PolyA位点的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
[0010] 根据本发明的一个实施例，所述第一预定个数为180-220,所述第二预定个数为 50-250,所述预定距离为1000-8000个碱基对。
[0011] 根据本发明的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的长度均为18-25 个碱基对。
[0012] 根据本发明的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度为 60-65 °C，GC 含量为 40-60 %。
[0013] 根据本发明的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度差小 于等于2°C。
[0014] 根据本发明的一个实施例，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度相等。
[0015] 根据本发明的一个实施例，所述转录起始位点定位的对照引物和第一引物的模板 量相同，所述PolyA位点定位的对照引物和第二引物的模板量相同。
[0016] 根据本发明的一个实施例，所述对照引物和第一引物的扩增反应在同一批次进 行；对照引物和第二引物的扩增反应在同一批次进行。
[0017] 根据本发明的一个实施例，对扩增片段进行特异性分析时，产物变性数据为：从 72°C 到 95°C，每 5s 升温 0· 2°C。
[0018] 根据本发明第二方面实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA 位点的方法在检测试剂盒中的应用。
[0019] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中 ：
[0021] 图1是根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位 点的方法的流程图；
[0022] 图2是本发明一个实施例中qRT-PCR引物的位置图，其中，P1-P6分别表示引物对 所对应的位置，Pl引物为对照引物，位于编码区内，P2-P6引物为定位引物，其中P2引物的 反向引物位于编码区，正向引物位于启动子区，P3-P6位于启动子区，ATG表示翻译起始密 码子；
[0023] 图3a是图2中实施例的不同qRT-PCR引物的起峰图谱，图3b是图2中实施例的 不同qRT-PCR引物的扩增产物的熔解曲线；
[0024] 图4是Axl的转录起始位点定位图；
[0025] 图5是本发明另一个实施例中qRT-PCR引物的位置图，其中，P1-P5分别表示引物 对所对应的位置，Pl引物为对照引物，位于编码区内，P2-P5引物为定位引物，其中P2引物 的正向引物位于编码区内，反向引物位于3'非翻译区，其余引物均位于3'非翻译区，ATG表 示翻译起始密码子，TGA表示终止密码子；
[0026] 图6a是图5中实施例的不同qRT-PCR引物的起峰图谱，图6b是图5中实施例的 不同qRT-PCR引物的扩增产物的熔解曲线；
[0027] 图7是Axl的PolyA位点定位图。
【具体实施方式】
[0028] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0029] 下面首先结合附图具体描述根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转 录起始位点和Po I yA位点的方法。
[0030] 如图1所示，根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和 PolyA位点的方法包括以下步骤：
[0031] Sl :在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物作为对照引物。
[0032] S2 :对所述待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起，每隔 第一预定个数的碱基对设计一对第一引物，所述第一引物的扩增片段大小为第二预定个数 的碱基对，并向上游步移预定距离。
[0033] S3 :对所述待测基因的PolyA位点进行定位：自终止密码子起，每隔第一预定个数 的碱基对设计一对第二引物，所述第二引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并 向下游步移预定距离。
[0034] S4 :对所述对照引物、第一引物和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分 析，确定所述待测基因的转录起始位点和PolyA位点。
[0035] 由此，根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位 点的方法，用qRT-PCR技术同时检测基因不同区段的表达丰度，对转录起始位点和PloyA 位点进行精确定位，解决目的基因非翻译区长度不确定性问题，使RACE克隆过程中的引物 设计摆脱对编码区的依赖，将设计位点前移到起始位点和PloyA位点附近，只需扩增500bp 以内的小片段，就可以克隆出非翻译区，该方法使用范围宽泛，并且定位的灵敏度和准确度 商。
[0036] 采用根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点 的方法，能够准确定位基因的转录起始位点和PolyA位点。定位的精确性取决于定位引物 的密度，转录起始位点和PolyA位点附近的定位引物密度越大，定位越精确。
[0037] 根据本发明的一个实施例，所述第一预定个数为180-220,所述第二预定个数为 50-250,所述预定距离为1000-8000个碱基对。
[0038] 其中，根据本发明实施例的引物的设计可以利用Primer 5. 0软件：具体地，所述 对照引物、第一引物和第二引物的长度均为18-25个碱基对，进一步地，所述对照引物、第 一引物和第二引物的退火温度为60-65°C，GC含量为40-60%。
[0039] 相比于传统的qRT-PCR，根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起 始位点和PolyA位点的方法的反应体系均使用等量的同一样品做模板，即所述转录起始位 点定位的对照引物和第一引物的模板量相同，所述PolyA位点定位的对照引物和第二引物 的模板量相同。
[0040] 优选地，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度差小于等于2°C。在本发 明的一些【具体实施方式】中，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度相等，即PCR反 应均使用同一退火温度。PCR反应须在同一批次运行，即所述对照引物和第一引物的扩增反 应在同一批次进行；对照引物和第二引物的扩增反应在同一批次进行。
[0041] 为了确保引物的扩增特异性，还应该进行扩增片段特异性分析，产物变性的具体 参数是：对扩增片段进行特异性分析时，产物变性数据是从72°c到95°C，每5s升温0. 2°C。
[0042] 根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PoIyA位点的方 法的数据分析具体如下：
[0043] 1)产物特异性判断：烙解曲线峰单一。
[0044] 2)转录区与非转录区的区别：在PCR扩增图谱中，转录区起峰（对照引物为阳性 对照），非转录区不起峰。
[0045] 3)转录起始位点：被定位在起峰引物对的正向引物结合位点和相邻不起峰引物 对的正向引物结合位点之间。
[0046] 4) Po I yA位点：被定位在起峰引物对的反向引物结合位点和相邻不起峰引物对的 反向引物结合位点之间。
[0047] 由此，根据本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位 点的方法能够准确定位基因的转录起始位点和PolyA位点。
[0048] 下面结合具体实施例描述本发明实施例的实时荧光定量PCR定位基因转录起始 位点和Po I yA位点的方法。
[0049] 实施例一利用qRT-PCR精确定位小麦高分子量谷蛋白亚基基因 Axl的转录起始位 点
[0050] 1、总 RNA 提取
[0051] 以中优9507小麦为材料，取开花后14天的未成熟种子5-6粒，加液氮研磨后用于 总RNA提取。
[0052] 1)将采集的小麦种子（约50mg)放入液氮预冷的研钵中，研成粉末，然后转入预 冷的I. 5ml离心管中，加入0. 5ml提取液，震荡4-6min ;再加入0. 5ml水饱和酚：氯仿：异 戊醇=49 :49 :2,润旋震荡5min，4°C，13000rpm离心5min ;取0· 5ml上清至新管，加入Iml TRIzol充分混匀，冰上放置lOmin。
[0053] 2)4°C，12000rpm离心IOmin,将上清液转移到I. 5ml新的无 RNase离心管中；加入 0. 2ml氯仿，剧烈摇动15s，室温放置5min。
[0054] 3)4°C，12000rpm离心IOmin,将上层水相转移到I. 5ml新的无 RNase离心管中。力口 入0· 5ml异丙醇，1/10体积3M NaAc (pH = 5. 2)颠倒混匀，-70°C放置30min。
[0055] 4) 4°C, 12000rpm 离心 10min。
[0056] 5)弃上清，加入 Iml 70% 乙醇；4°C，IOOOrpm 离心 5min。
[0057] 6)重复步骤（6) -次。
[0058] 7)弃去上清，室温干燥5-10min，加入20 μ 1灭菌的DEPC H20溶解RNA，-70°C保 存备用。
[0059] 提取液 IOml :
[0060]
【权利要求】
1. 一种实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方法，其特征在于，包 括以下步骤： 51 :在待测基因的编码区的任意区段设计一对实时定量PCR引物作为对照引物； 52 :对所述待测基因的转录起始位点进行定位：启动子区自起始密码子起，每隔第一 预定个数的碱基对设计一对第一引物，所述第一引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱 基对，并向上游步移预定距离； 53 :对所述待测基因的PolyA位点进行定位：自终止密码子起，每隔第一预定个数的碱 基对设计一对第二引物，所述第二引物的扩增片段大小为第二预定个数的碱基对，并向下 游步移预定距离； 54 :对所述对照引物、第一引物和第二引物进行扩增，并对扩增片段进行特异性分析， 确定所述待测基因的转录起始位点和PolyA位点。
2. 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方 法，其特征在于，所述第一预定个数为180-220,所述第二预定个数为50-250,所述预定距 离为1000-8000个碱基对。
3. 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方 法，其特征在于，所述对照引物、第一引物和第二引物的长度均为18-25个碱基对。
4. 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的 方法，其特征在于，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度为60-65°C，GC含量为 40-60%。
5. 根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方 法，其特征在于，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度差小于等于2°C。
6. 根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和Po lyA位点的方 法，其特征在于，所述对照引物、第一引物和第二引物的退火温度相等。
7. 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和PolyA位点的方 法，其特征在于，所述转录起始位点定位的对照引物和第一引物的模板量相同，所述PolyA 位点定位的对照引物和第二引物的模板量相同。
8. 根据权利要求1-8中任一项所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和 PolyA位点的方法，其特征在于，所述对照引物和第一引物的扩增反应在同一批次进行；对 照引物和第二引物的扩增反应在同一批次进行。
9. 根据权利要求1-8中任一项所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点和 PolyA位点的方法，其特征在于，对扩增片段进行特异性分析时，产物变性数据为：从72°C 到 95°C，每 5s 升温 0.2°C。
10. -种根据权利要求1-9中任一项所述的实时荧光定量PCR定位基因转录起始位点 和PolyA位点的方法在检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104404135SQ201410584393
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】李小辉, 姜培红, 晏月明 申请人:首都师范大学