SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR 检测试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 硒是一种人类和动物必需的微量元素，与许多疾病密切相关，如癌症、神经退行性 疾病及心血管病等，并在一些重大疾病的防治中起到重要作用。
[0003] 在现有已发现的25种硒蛋白中，硒蛋白K(SelK)是2003年被Gladyshv实验室鉴 定出的一种新型硒蛋白；SelK是一个含有94个核苷酸，大小为10. 6KD的小分子蛋白。关 于SelK的生物学功能尚不明确，近几年发现SelK可能有如下功能：SelK在心肌细胞中参 与应对氧化应激；在人肝癌细胞中参与调节内质网应激；在受体介导的免疫细胞活化过程 中促进钙流；参与内质网相关蛋白降解；参与调节巨噬细胞表面CD36棕榈酰化；影响泡沫 细胞的形成和动脉粥样化等。因此硒蛋白K的表达水平对于多种生命活动中的症状诊断具 有非常重要的参考价值。
[0004] 而现有对于SelK表达水平的检测方法中，多通过传统的蛋白质染色印迹或者荧 光定量PCR的方法进行。其中，荧光定量PCR可以快速实时的监测并计算模版的初始浓度， 为研宄蛋白在转录水平上的表达提供了便捷的一种方法。而现有的荧光定量PCR中的染料 法是属于非特异性的检测方法，不如荧光探针法对模版没有特异性；同时，现有荧光探针法 的引物和探针多只适用于某一特定的局部组织或者细胞，在其他的组织细胞检测中经常扩 增不到目的条带，使用中存在不足。
【发明内容】
[0005] 本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种适用于各种人的细 胞或组织鉴定SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒及方法。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0007] 一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，包括特异性引物和荧光探 针；其中，
[0008] 所述特异性引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1喊基序列的上游引物F和具有序列 表SEQ. ID. No. 2碱基序列的下游引物R ;
[0009] 所述荧光探针具有序列表SEQ. ID. No. 3碱基序列，且5'端标记有可淬灭的报告基 团，3'标记有BHQ荧光基团。
[0010] 采用本专利中的引物探针可以成功扩增出目的基因，扩增曲线良好，电泳结果显 示目的条带清晰；且引物探针反应性能良好，适用于各种人的细胞或组织鉴定SelK的表 达。
[0011] 本发明进一步还提出一种采用上述试剂盒进行SelK基因表达水平的荧光定量 PCR检测方法，包括如下步骤：
[0012] 提取待测样本RNA ;
[0013] 将所述待测样本RNA进行反转录，得到反转录DNA ;
[0014] 以所述反转录DNA为模板，进行实时荧光PCR ;
[0015] 检测PCR过程中的荧光信号；
[0016] 其中，所述实时荧光PCR过程中采用的引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序 列的上游引物F和具有序列表SEQ. ID. No. 2碱基序列的下游引物R ;
[0017] 所述实时荧光PCR过程中采用的荧光探针具有序列表SEQ. ID. No. 3碱基序列，且 5'端标记有可淬灭的报告基团，3'标记有BHQ荧光基团。
[0018] 本发明的上述检测方法，实时反映靶基因扩增的过程，并根据内参或外参直接反 映出靶基因的拷贝数；具有灵敏度高、特异性强等优点；并且引物和探针基于硒蛋白表达 的mRNA的特定的区域设计，适用于各种人的细胞或组织鉴定SelK的表达。
【附图说明】
[0019] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0020] 图1为本发明实施例SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测的荧光变化图；
[0021] 图2为本发明实施例SelK基因表达水平的荧光定量PCR扩增产物的电泳结果图；
[0022] 图3为图1中荧光荧光曲线对应的扩增样本和统计数据图。
【具体实施方式】
[0023] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0024] 本发明实施例提供一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测方法，包括如下步 骤：
[0025] S10,获取待测样本，并提取待测样本的RNA ;
[0026] S20,以提取的待测样本的RNA模板进行实时荧光RT-PCR ;
[0027] S30, RT-PCR过程中的荧光信号。
[0028] 本发明上述过程通过对提取的待测样本的RNA进行扩增，并通过扩增过程中荧光 探针产生的荧光信号变化，从而便可以得知待测样本中SelK基因表达水平；当然，基于实 时荧光RT-PCR进行，重点在于针对目的SelK基因的特异性引物和荧光探针。其中，本发明 的步骤S20中的特异性引物和荧光探针为：
[0029]
【主权项】
1. 一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括特异性引物 和荧光探针；其中， 所述特异性引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的上游引物F和具有序列表 SEQ. ID. No. 2碱基序列的下游引物R ; 所述荧光探针具有序列表SEQ. ID. No. 3碱基序列，且5'端标记有可淬灭的报告基团， 3'标记有BHQ荧光基团。
2. 如权利要求1所述的SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述可淬灭的报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX中的一种。
3. 如权利要求1或2所述的SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在 于，所述试剂盒还包括有阳性对照；所述阳性对照为人cDNA模板。
4. 如权利要求1或2所述的SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在 于，所述试剂盒还包括有阴性对照；所述阴性对照为RNase free dH20。
5. -种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 提取待测样本RNA ; 将所述待测样本RNA进行反转录，得到反转录DNA ; 以所述反转录DNA为模板，进行实时荧光PCR ; 检测PCR过程中的荧光信号； 其中，所述实时荧光PCR过程中采用的引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的 上游引物F和具有序列表SEQ. ID. No. 2碱基序列的下游引物R ; 所述实时荧光PCR过程中采用的荧光探针具有序列表SEQ. ID. No. 3碱基序列，且5'端 标记有可淬灭的报告基团，3'标记有BHQ荧光基团。
6. 如权利要求5所述的SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所 述可淬灭的报告基团为FAM。
【专利摘要】本发明提供了一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，包括特异性引物和荧光探针；其中，特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物F和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物R；所述荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，且5’端标记有可淬灭的报告基团，3’标记有BHQ荧光基团。采用本发明中的引物探针可以成功扩增出目的基因，扩增曲线良好，电泳结果显示目的条带清晰；且引物探针反应性能良好，适用于各种人的细胞或组织鉴定SelK的表达。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104561288
【申请号】CN201410830420
【发明人】张仁利, 李瑞敏
【申请人】深圳市疾病预防控制中心
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月26日