专利名称：链球菌2型gdh基因荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的的检测方法，具体涉及一种猪链球菌2型 ⑶H(谷氨酸脱氢酶，glutamate dehydrogenase)基因荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
猪链球菌病是由猪链球菌(Str印tococcus Suis, S. Suis)引起的一种重要的人兽 共患病。猪链球菌是革兰氏阳性兼性厌氧球菌，根据其荚膜多糖抗原性的差异分为35个血 清型，即1-34型和1/2型。其中1/2，1，2，7，9和14型是导致动物患病的主要血清型，其中 以2型(SS2)流行最广，致病力最强，不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎 和突然死亡，还可以感染人并致其死亡，严重威胁着人类的公共卫生安全。目前确定猪链球菌的方法主要是在基因水平进行鉴定，如PCR方法。其中荧光 定量方法作为检测手段已经应用在很多病原体的检测上，具有检测时间短、结果直接可见 和能够进行绝对或相对定量分析，是一种快速的优秀的诊断方法，已经应用在生产实验研 究中。荧光定量方法在SS2上的应用已有报道，主要集中应用在细菌相关蛋白的表达水 平检测上，Anding Zhang以细菌16S rRNA作为内参基因检测SS2的保护性抗原烯醇化酶 (Enolase)，证明了烯醇化酶是一个诱导蛋白，可以作为疫苗候选基因是一个新的保护性抗 原。亦有人以猪链球菌MRP、CPS和16S rRNA为靶基因进行荧光定量PCR，达到了预期效 果，检测灵敏度明显高于普通PCR检测方法。但尚未建立以GDH基因为目的基因的荧光定 量PCR方法。猪链球菌的谷氨酸脱氢酶属于GDH蛋白家族，分子量为45kD，其氨基酸序列具有 GDH蛋白家族I的典型保守序列。猪链球菌的GDH在细胞表面表达，是NADP (H)特异性酶， 主要进行氮的同化和谷氨酸的合成，其在利用NADPH作辅酶催化α -酮戊二酸合成L-谷氨 酸时活性最高，催化L-谷氨酸生成α _酮戊二酸的活性较弱，没有利用NADH为辅酶的活性 [15]。其编码的基因在SS2中保守存在并有保守的抗原性，能与感染猪链球菌有毒株的猪 的血清反应，可作为检测猪链球菌的重要标志性抗原。经对现有技术文献的检索和根据中国专利文献库提供的信息发现与“链球菌”、 “检测方法”相关的文献有①“一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法”(200510019132. X)。该 项技术公开了一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法，首先是设计引物，所提 供的套式聚合酶链式反应包括二次PCR，4对引物，变形链球菌两对正反引物和茸毛链球菌 两对正反引物；其次是细菌染色体DNA及唾液染色体DNA提取；第三是第一次PCR，依次加 入两对引物，四种dNTP混合物及模板DNA和Taq酶；第四是第二次PCR，将第一次PCR产物 稀释，加入另外两对引物，进行扩增；第五是电泳。本发明方法简单，成本低廉。该项技术虽 然也是链球菌的一种检测方法，但检测人得唾液中的变形变形链球菌和茸毛链球菌，而不 是检测猪链球菌2型；该项技术检测方法虽然简单，但不能定量。②“一种引起坏死性筋膜炎的变异A族侵袭性链球菌的检测方
3法”(200510077734. 0)。该项技术公开了一种引起坏死性筋膜炎的变异A族侵袭性链球菌 的检测方法。该项技术包括对分离菌株进行生化鉴定或进行针对speB PCR的检测，确定分 离菌株为A族侵袭性链球菌；对分离菌株进行动物模型感染，确定菌株为强毒株；对鉴定的 A族侵袭性链球菌进行EMM基因分型；对鉴定的A族侵袭性链球菌进行SLA基因检测等步 骤。该项技术虽然也是链球菌的一种检测方法，但检测一种引起坏死性筋膜炎的变异A族 侵袭性链球菌，而且未能应用荧光定量PCR。③“一种鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒及检测方法”(200810220112. 2)。 该项技术公开一种鱼类病原菌海豚链球菌(Sti^ptococcus iniae)分子诊断试剂盒及检测 方法。该项技术包括裂解缓冲液A、DNA提取B液、DNA提取C液、DNA提取D液、阳性模板 对照E液和PCR反应液F液，该试剂盒及检测方法是以海豚链球菌基因组中的保守序列设 计的一对特异引物为主体而组成的；同时，还对DNA提取裂解液及PCR反应条件包括镁离子 浓度、退火温度、循环数进行了优化。该项技术检测的是一种鱼类病原菌海豚链球菌，未涉 及猪链球菌2型、荧光定量PCR和GDH基因。④“一种马链球菌兽疫亚种PCR检测方法及用于该方法的试剂 盒”(200910143936. 9)。该项技术属于流行病学和卫生检测领域。涉及一种快速检测马链 球菌兽疫亚种的PCR快速检测试剂盒及方法。该项技术未涉及荧光定量PCR和GDH基因。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种猪链球菌2型GDH基因的荧 光定量PCR检测方法。本发明根据猪链球菌2型GDH基因高度保守序列设计一对引物和 TaqMan探针，建立TaqMan荧光定量PCR检测方法，检测感染猪不同时间血液中细菌的拷贝 数，以确定感染菌液的数量。本发明是通过以下技术方案实现的本发明根据猪链球菌的GDH基因的序列，设计一对特异性引物F1、R1和TaqMan探 针，探针5'端标记的荧光报告基团为FAM，3'端标记的淬灭基团为Eclipse，扩增目的片 断长度为81bp ；将含有目的基因的片段克隆到pMDIS-T载体中，转化到JM109感受态细胞， 挑取阳性克隆鉴定；提取阳性质粒，用分光光度计测定0D260nm值，并将质粒浓度换算成拷 贝数/ μ L，质粒标准品10倍梯度稀释作为模板，在Mastercycler ep realplex荧光定量 PCR仪上检测，得出标准曲线；采集猪血液并提取血液全基因组DNA，采用已建立的荧光定 量PCR方法，根据标准曲线计算出待检样品中猪链球菌含量。此方法检测样本DNA浓度在IO2 IO8Copies/μ L范围内，Ct值与质粒拷贝数 的对数之间呈现很好的线性关系，扩增效率达到1.07，相关系数R2 = 0.999。以不同细菌 (葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、猪链球菌、停乳链球菌，其中，猪链球菌采用文献“沈艳，华 修国，崔立，朱建国，杨志彪.猪链球菌2型感染SPF小型猪模型的构建.动物医学进展， 2008,29(2) :17-20”其余菌株均采用文献“易明梅，上海地区奶牛乳房炎主要致病菌分析 及基因治疗初探，上海交通大学硕士论文，2008，中国优秀硕士学位论文全文数据库，DOI CNKI =CDMD 2. 2008. 054652，网址http//dlib. cnki. net/kns50/detail. aspx ？ QueryID =27&Cur Rec = 7”)的DNA作为模板，同时设阴性和阳性对照，进行荧光定量PCR检测。 结果显示只有阳性对照出现扩增曲线，其他均未出现扩增曲线，表明该方法特异性强。在同一反应体系进行批间重复，每个样品4个重复，得出Ct值，进行统计变异系数(0. 85%和 0. 002%)均小于5%。表明误差都非常小，扩增效率稳定。猪链球菌2型GDH基因的荧光定量PCR检测方法，具体步骤如下(1)设计、合成引物和探针根据猪链球菌的GDH基因的序列，设计一对特异性引物 FURl 禾口 TaqMan 探针。(2) PCR扩增⑶H基因，获得目的片断，PCR产物割胶回收。(3)构建重组质粒，将目的片段与pMDIS-T载体连接，转化到JM109感受态细胞，挑 取阳性克隆进行PCR和酶切鉴定。(4)荧光定量PCR反应体系和反应条件的确立，经过反复实验，确定最优化荧光定 量PCR反应体系和反应条件。(5)建立标准曲线，提取阳性质粒，用分光光度计测定0D260nm值，并将质粒浓度 换算成拷贝数/ μ L，质粒标准品10倍梯度稀释作为模板，以7个稀释度的质粒标准品建立 标准曲线。同时对样本进行处理，处理后提取基因组DNA作荧光定量PCR，根据结果计算原 始样品中猪链球菌的含量。所述的引物，是指序列为Fl 5' -CCAAAGCTTCATGACTGAATTGC-3‘；Rl 5' -CGACCACCGACACCGATG-3‘。所述的探针，是指5' -(FAM)ACACATCGGACCTTCACTTGACGCC(Eelipse)-3'。所述的荧光定量PCR反应体系如下总体积25μ1:包括 Premix Ex Taq (2 X), 12. 5 μ L ;F1 (10 μ Μ), 0. 5 μ L ； Rl (10 μ Μ)，0· 5 μ L ；探针(3 μ Μ)，1 μ L ；DNA 模板，2 μ L ；dH20,8· 5 μ L。所述的荧光定量PCR反应条件如下94°C预变性 30s ；94°C变性 5s，60°C退火 30s，72°C延伸 40s ；共 40 个循环；72°C延 伸 5min。所述的样品，待检时应用Easy Pure Blood Genomic DNA Extraction Kit 提取 基因组DNA，操作方法参见该试剂盒说明书。在本发明中的术语“探针”、Taqman探针、淬灭、荧光阈值、CT值和荧光定量PCR，在 "MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌0157的方法”(200610028327. 5)上均有记载。本发明使用外参照物作为定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，按一定的倍比 稀释，然后作出标准曲线图，未知的样本按标准曲线找出对应的拷贝数。本发明突破了以往 检测方法中仅能进行定性检测的缺点，可以实时定量检测血液中细菌含量，灵敏度高、特异 性强、重复性好，易于推广应用。
图IPCR扩增结果，M =DNAMaker ； 1 阴性对照；2 目的片段；图2荧光定量扩增曲线；图3荧光定量PCR标准曲线；图4敏感性试验扩增曲线，从左至右依次为拷贝数107 μ 1，IO6/μ 1，IO5/μ 1，IO4/μ 1， ο3/μ 1， ο2/μ 1，ιο7μ ι ；图5特异性试验结果；图6稳定性试验扩增曲线。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的实施例作详细说明以下实施例在以本发明技术方案为 前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商 所建议的条件。实施例一(1)设计、合成引物和探针根据猪链球菌的⑶H基因的全序列，利用primerf. 0等软件设计一对特异性引物 FURl 禾口 TaqMan 探针Fl 5' -CCAAAGCTTCATGACTGAATTGC-3‘Rl 5' -CGACCACCGACACCGATG-3‘探针5'-(FAM)ACACATCGGACCTTCACTTGACGCC(Eelipse)-3'均由宝生物工程(大连)有限公司合成，探针5'端标记的荧光报告基团为FAM， 3'端标记的淬灭基团为Eclipse，扩增目的片段长度为81bp。(2)⑶H基因的克隆如图1所示，以提取的猪链球菌2型基因组DNA为模板，以Fl，Rl为引物，扩增目 的基因。反应结束后，取5μ L PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在约Slbp处 可以清晰地看到一条带。目的片断的回收按照Omega公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒使用 说明书进行。将目的片段连接到PMD18-T载体中，按照说明书进行反应。(3)重组质粒的构建感受态细胞的制备，具体步骤如下①将E. coli JM109于LB平板上划线，37°C培 养16 20h，挑取单个菌落，接种至含2mL LB液体培养基的试管中，37°C、200rpm振荡培 养过夜。②取ImL菌液转接于IOOmL新鲜LB液体培养基，37°C、200rpm振荡培养2 3h 至菌液0D600 = 0. 4 0. 6。③将菌液置于冰上放置30min，然后分别移入预冷的1. 5mLEp 管中，4°C、4000rpm离心IOmin，无菌弃去上清液，将Ep管倒置于纸巾上，流尽其中的液体。 ④在无菌条件下，用200 μ L冰预冷的0. IMCaCl2重悬每份细胞沉淀，冰上放置30min，4°C、 4000rpm离心IOmin,弃去上清液，使Ep管倒置Imin0⑤用100 μ L冰预冷的0. IMCaCl2重 悬每份菌体沉淀，混勻后置_20°C保存。将连接产物转化于大肠杆菌感受态细胞JM109，具体步骤如下①在无菌条件下， 取5 μ L连接产物PMD-GDH，加入100 μ L感受态细胞JM109中，充分混勻后，冰浴30min。 ②42°C水浴热激90s，冰上放置2min。③取600 μ L的LB液体培养基加入上述Ep管中， 370C、150rpm振荡培养lh。④取200 μ L上述菌液均勻涂布于含100 μ g/mL氨苄西林的LB 琼脂平板上。⑤将上述平板置于37°C温箱中培养12 16h。⑥挑选疑似阳性的单个菌落， 在无菌条件下接至ImL含氨苄西林的LB液体培养基中，37°C、200rmp振荡培养12 16h。
以疑似阳性菌落作为模板进行菌液PCR鉴定，按已优化好的反应体系和反应条件 加入各组分混勻，进行PCR鉴定。经PCR鉴定为阳性的菌液进行增菌培养，按照质粒提取试 剂盒使用说明书进行质粒的提取并对提取的质粒送上海生工进行测序。将提取的阳性质粒PMD-GDH作为标准品，用分光光度计测定0D260nm值，并将质粒 浓度换算成拷贝数/ μ L，以10倍系列稀释的标准品(1 X 102copies/ μ L 1 X 108copies/ μ L)为定量检测模板，每个浓度2 μ L，各3个重复，在荧光定量PCR仪上检测，得到动力学 曲线和标准曲线，如图2、3所示，可知模板DNA浓度在102 108cOpieS/μ L范围内，Ct值 与质粒拷贝数的对数之间呈现很好的线性关系，扩增效率达到1. 07，相关系数R2 = 0. 999。(5)敏感性试验将重组质粒做倍比稀释(1\101(30 丨68/^1^ 1\107(0 丨68/^0，在荧光定量 PCR仪上测试其灵敏度。结果表明，最低检测限度为lXlOlcopies/yL，如图4所示.(4)特异性试验以不同细菌全基因组DNA作为模板，同时设有阴性和阳性对照，进行荧光定量PCR 的检测，结果显示只有阳性对照出现扩增曲线，其它均未出现扩增曲线，如图5所示，表明 该方法特异性强。(6)稳定性试验在同一反应体系进行批间重复，每个样品4个重复，得出Ct值并进行统计学分析， 变异系数(0. 85%和0. 002% )均小于5%，如图6和表1所示。表明误差都非常小，扩增效 率稳定。表 权利要求
一种链球菌2型GDH基因荧光定量PCR检测方法，其特征在于，根据猪链球菌的GDH基因的序列，设计一对特异性引物F1、R1和TaqMan探针，探针5′端标记的荧光报告基团为FAM，3′端标记的淬灭基团为Eclipse，扩增目的片断长度为81bp；将含有目的基因的片段克隆到pMD18 T载体中，转化到JM109感受态细胞，挑取阳性克隆鉴定；提取阳性质粒，用分光光度计测定OD260nm值，并将质粒浓度换算成拷贝数/μL，质粒标准品10倍梯度稀释作为模板，在荧光定量PCR仪上检测，得出标准曲线；采集猪血液并提取血液全基因组DNA，采用已建立的荧光定量PCR方法，根据标准曲线计算出待检样品中猪链球菌含量；所述的引物，是指序列为F15′ CCAAAGCTTCATGACTGAATTGC 3′，R15′ CGACCACCGACACCGATG 3′；所述的探针，是指5′ (FAM)ACACATCGGACCTTCACTTGACGCC(Eclipse) 3′。
2.根据权利要求1所所述的链球菌2型GDH基因荧光定量PCR检测方法，其特征是，具 体步骤如下(1)设计、合成引物和探针根据猪链球菌的GDH基因的序列，设计一对特异性引物F1、 Rl 禾口 TaqMan 探针；⑵PCR扩增⑶H基因，获得目的片断，PCR产物割胶回收；(3)构建重组质粒，将目的片段与pMDIS-T载体连接，转化到JM109感受态细胞，挑取阳 性克隆进行PCR和酶切鉴定；(4)荧光定量PCR反应体系和反应条件的确立，经过反复实验，确定最优化荧光定量 PCR反应体系和反应条件；(5)建立标准曲线，提取阳性质粒，用分光光度计测定0D260nm值，并将质粒浓度换算 成拷贝数/ μ L，质粒标准品10倍梯度稀释作为模板，以7个稀释度的质粒标准品建立标准 曲线，同时对样本进行处理，处理后提取基因组DNA作荧光定量PCR，根据结果计算原始样 品中猪链球菌的含量。
3.根据权利要求1所所述的链球菌2型GDH基因荧光定量PCR检测方法，其特征是，所 述的荧光定量PCR反应体系如下总体积 25 μ 1 包括 Premix Ex Taq (2 X), 12. 5 μ L ;F1 (10 μ Μ), 0. 5 μ L ；Rl (10 μ Μ), 0· 5 μ L ；探针(3 μ Μ)，1 μ L ；DNA 模板，2 μ L ；dH20,8· 5 μ L。
4.根据权利要求1所所述的链球菌2型GDH基因荧光定量PCR检测方法，其特征是，所 述的荧光定量PCR反应条件如下94°C预变性30s ；94°C变性5s，60°C退火30s，72°C延伸40s ；共40个循环；72°C延伸 5min。
全文摘要
一种生物技术领域的猪链球菌2型GDH基因的荧光定量PCR检测方法，根据猪链球菌的GDH基因的序列，设计一对特异性引物F1、R1和TaqMan探针，探针5′端标记的荧光报告基团为FAM，3′端标记的淬灭基团为Eclipse，扩增目的片断长度为81bp；将含有目的基因的片段克隆到pMD18-T载体中，转化到JM109感受态细胞，挑取阳性克隆鉴定；提取阳性质粒，用分光光度计测定OD260nm值，并将质粒浓度换算成拷贝数/μl，质粒标准品10倍梯度稀释作为模板，在荧光定量PCR仪上检测，得出标准曲线；采集猪血液并提取血液全基因组DNA，采用已建立的荧光定量PCR方法，根据标准曲线计算出待检样品中猪链球菌含量；本发明可以实时定量检测血液中细菌含量，灵敏度高、特异性强、重复性好，易于推广应用。
文档编号C12Q1/14GK101948928SQ20101051196
公开日2011年1月19日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者华修国, 崔立, 杨卫军, 杨志彪, 袁聪俐 申请人:上海交通大学