专利名称：一种新的基因定量方法
一种新的基因定量方法[技术领域]
本发明涉及分子生物学领域，更具体地，涉及一种新的基因定量方法。 [背景技术]
包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、核酸序列依赖性扩增 (NASBA)等技术的基因扩增技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA或者RNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA或RNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。
由于基因扩增技术的高灵敏性导致会出现一些假阳性，基因定量技术应运而生， 常见的定量技术包括荧光定量PCR技术，LAMP的实时浊度定量技术等，这些技术的出现为基因扩增技术的应用带来了更为广阔的前景。目前我国临床已经抛弃了普通的基因扩增定性检测，全部采用定量基因扩增技术。但是这些定量技术都需要大型的仪器设备，一台定量 PCR仪的价格是普通PCR仪价格的十多倍，因此只能够在大医院和科研院所展开相关检测和研究，基层医院和偏远地区无法享受这一高科技产品带来的福音。
因此特别需要一种简单而且不需要大型设备的基因定量技术。[发明内容]
本发明的目的是在于解决现有技术的不足之处而提供一种提供一种鉴定结果直观、操作简单、特异性好、适合基层的基因定量技术。
本发明的目的可以通过以下技术措施实现(1)通过实验鉴定出一组扩增试剂在相同条件下的灵敏度，即可以检测到的最低基因数量；( 将待定量的模板稀释不同倍数， 然后对不同浓度的模板用同一组扩增试剂进行基因扩增；C3)通过能够实现基因扩增的最大稀释倍数计算待定量的基因数量。
一组检测时间在相同的检测条件下，能够检测到的最低基因数量，即该组检测试剂的检测灵敏度。一组试剂的检测灵敏度是一个恒定的数值，具有很强的可重复性。我们可以通过实验室条件进行基因定量，等比稀释等方法鉴定一组基因扩增试剂的检测灵敏度。
将待定量的模板进行逐级稀释，用同一组扩增试剂对各稀释比例的模板进行基因扩增，大于该组扩增试剂灵敏度浓度的稀释管可以完成扩增反应，低于该组扩增试剂灵敏度的稀释管不会完成扩增反应。用该组扩增试剂的灵敏度乘以可以完成扩增反应的最大稀释倍数就是带定量的模板数量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的一种新的基因定量方法只需要原有的基因扩增设备，像LAMP和NASBA技术只需要一个恒温环境即可，不需要额外的实验设备，大大简化了设备投入，成本投入低，适合基层和现场使用。2.本发明的一种新的基因定量方法计算简单，只是应用了一个乘法计算，简洁明了，易懂易用。3.本发明的一种新的基因定量方法省去了荧光定量PCR所需要的荧光剂、探针等物质，成本更低。4.本发明的一种新的基因定量方法具有广泛的适用性，可以和PCR、LAMP、NASBA等现有的基因扩增技术结合，完成定量过程。[具体实施方式
]
为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施。
本实施例采用LAMP技术定量检测大肠杆菌。
实施例1
(1)按以下序列合成大肠杆菌寡聚脱氧核酸引物
ECFL :CTTCGCCACCGGTATTCC
ECBL GGATTAGATACCCTGGTAGTCC
ECBIP :GCTCAGGTGCGAAAGCGTGGACCTCCAAGTCGACATCGTT
ECFIP :TCAGTCTTCGTCCAGGGGGCCAGGTGTAGCGGTGAAATGC
ECB3 :CGTTAGCTCCGGAAGCCA
ECF3 :TCTCGTAGAGGGGGGTAGA
(2)制备工艺如下
将Bst DNA 聚合酶 10 单位 / 管，2mmol/L dNTP、50mmol/L Tris-HCl、20mmol/ LKCl、50mmol/L MgS04、0. 5 体积％ TritonX-100、lmmol/L甜菜碱、lmol/L HNB,内引物FIP/ BIP1. 6ummol/L、外引物 F3/B30. 2ummol/L、环引物 LB/LP 0. 4ummol/L。
以上物质溶于20ul水中。
(3)灵敏度的检测和未知浓度的定量检测
a.取冷藏的HBlOl大肠杆菌菌液在LB培养基上划线分离单菌株。挑单菌落接种至IOml液体LB培养基继续培养过夜，裂解法抽提大肠杆菌基因组DNA。
b.对抽提的DNA进行0D260分光光度计检测，确定DNA的含量。取部分DNA进行 10倍等比稀释，直至稀释的浓度低于1拷贝/微升。
c.分别取各稀释管中液体5ul，加入LAMP反应管，65度恒温，60分钟，最大倍数的稀释管中基因的拷贝数就是该组试剂的检测灵敏度。
d.将未知浓度的大肠杆菌按照10倍等比稀释8组，分别取各稀释管中液体5ul， 加入LAMP反应管，65度恒温，60分钟。
e.灵敏度乘最大稀释倍数的数值就是该未知浓度检测管的大肠杆菌浓度。
(4)材料
a.大肠杆菌HBlOl为分子生物学实验室常用工程菌之一，为本实验室保存。
b.Bst DNA聚合酶购买自北京纽英仑公司，HNB、甜菜碱购买自Sigma公司，引物由上海生工合成。
(5)结论
本发明方法操作简单，方便快捷，且显色结果清晰。本发明不需要特别设备和仪器，适合基层和现场使用，并且该方法具有广泛的适用性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1.本发明提供了一种新的基因定量方法，其特征在于，所述的方法包括(1)通过实验鉴定出一组扩增试剂的灵敏度，即可以检测到的最低基因数量；( 将待定量的模板稀释不同倍数，然后对不同浓度的模板用同一组扩增试剂进行基因扩增；C3)通过能够实现基因扩增的最大稀释倍数计算待定量的基因数量。
2.如权利要求1所述的一种新的基因定量方法，其特征在于，所述将模板稀释不同倍数，可以使等比稀释，也可以是不同比例的稀释，但稀释的倍数是确定的。
3.如权利要求1所述的一种新的基因定量方法，其特征在于，所述的基因扩增包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)。
4.如权利要求1所述的一种新的基因定量方法，其特征在于，所述一组扩增试剂的灵敏度，即可以检测到的最低基因数量是固定的，在只改变模板数量的条件下，这一数值不发生变化。
5.如权利要求1所述的一种新的基因定量方法，其特征在于，所述的不同倍数的模板包括可以实现扩增反应的模板浓度和不可实现反应的模板浓度。
6.如权利要求5所述的一种新的基因定量方法，其特征在于，所述的计算初始的模板浓度等于最低可以检测到的极限模板浓度乘以稀释倍数。
全文摘要
本发明提供了一种新的基因定量方法，所述的方法包括(1)通过实验鉴定出一组扩增试剂的灵敏度，即可以检测到的最低基因数量；(2)将待定量的模板稀释不同倍数，然后对不同浓度的模板用同一组扩增试剂进行基因扩增；(3)通过能够实现基因扩增的最大稀释倍数计算待定量的基因数量。本发明只需要原有的基因扩增设备，大大简化了设备投入，成本低，适合基层和现场使用；本发明只是应用了一个乘法计算，简洁明了，易懂易用；本发明具有广泛的适用性，可以和PCR、LAMP、NASBA等现有的基因扩增技术结合，完成定量过程。
文档编号C12Q1/68GK102517397SQ20121000237
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者俞国华, 李治国 申请人:俞国华, 李治国