对WT1 mRNA的表达量进行定量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对人WTl的mRNA的表达量进行定量的新方法，该方法可用于对白 血病、实体癌等癌症的诊断和对骨髓移植时期的确定。
【背景技术】
[0002] 肾母细胞瘤-I (Wilms tumor gene-1，以下称为"WT1"。）基因是于1990年被Call 等人鉴定为小儿肾母细胞瘤的致病基因的基因（非专利文献1)。此后，还有报道显示WTl mRNA不仅在小儿肾母细胞瘤中高水平表达，而且在实体癌细胞株（例如胃癌细胞株、大肠 癌细胞株、肺癌细胞株及乳癌细胞株）等实体癌细胞中也高水平表达（非专利文献2)。目 前认为，WTl基因是不仅与小儿肾母细胞瘤有关、并且还与多种癌症有关的癌相关基因。
[0003] Call等人报道了 WTl mRNA在白血病细胞株K562细胞及CCRF-CEM细胞中的表达 (参见非专利文献I)，Miwa等人报道称，经Northern印迹分析发现，在22例急性髓细胞白 血病（acute myeloid leukemia，以下称为"AML"。）中的15例中有WTl mRNA的表达（非 专利文献3)。另外，Inoue等人报道称，在AML的初诊时在100% (45/45)的病例中均观察 到WTl mRNA表达。此外，还有报道称：诊断时的WTl mRNA表达量与预后有关（非专利文献 5);即使通过治疗使得WTl mRNA表达量一度转为阴性，但在复发时其将再度升高（非专利 文献6);并且，复发时的WTl mRNA表达量较之诊断时的表达量有所增加（非专利文献7)。
[0004] 如上所述，鉴于WTl基因以单一基因的形式在AML患者中高频度出现，以及通过治 疗转为阴性后、在复发时再度升高等事实，WTl基因因可在AML的治疗中用作为微小残留病 灶（minimal residual disease，以下亦称为"MRD"）的监测标志物，故而一直以来已作为 体外诊断用医药品而被贩售。
[0005] 作为人WTl mRNA的测定方法，以往已知有以β -肌动蛋白为基准的竞争定量法 (专利文献1)。但是，该测定方法不仅需要将WTlmRNA与β -肌动蛋白的mRNA分开测定， 而且还必须进行所谓的两步式RT-PCR法（在逆转录反应完成后再进行延伸反应），因此非 常耗费时间。
[0006] 此外，作为另一种测定人WTl mRNA的方法，专利文献2公开了针对WTl mRNA的一 步式RT-PCR法。但是，在该方法中，需要另行测定持家基因表达量（其用于对WTl基因表 达量进行校正），因此较为繁杂。
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1 :日本特开平11-89599号公报
[0009] 专利文献2 :日本特开平11-89596号公报
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献 I :Call，K.M. et al. ,Cell 1990 ;60:509-520·
[0012] 非专利文献 2 : Jpn. J. Cancer Res. 1999 ;90:194-204.
[0013] 非专利文献 3 :Miwa, Η·，et al.，Leukemia 1992 ;6:405-409.
[0014] 非专利文献 4 :Inoue，K.，et al·，Blood, 1994,84(9),3071-3079.
[0015] 非专利文献 5 :Blood 1997 ;90:1217-1225.
[0016] 非专利文献 6 :Blood 1996 ;88:2267-2278.
[0017] 非专利文献 7 :Blood 1996 ;88:4396-4398.
【发明内容】
[0018] 如前所述，作为对WTl基因表达量进行定量的方法，已知的方法存在需要大量时 间且较为繁杂的问题，需要开发出能够简便地在短时间内对人WTl基因表达量进行定量的 方法。因此，本发明的目的在于，提供一种能够简便地且在短时间内对WTl mRNA进行定量 的新方法。特别地，本发明的目的在于，通过同时对人WTl mRNA和持家基因两者的表达量 进行定量，提供能够简便地在短时间内对WTl mRNA进行定量的新方法。
[0019] 本申请的发明人为解决上述课题而进行了锐意研宄，结果发现，通过使作为目的 基因的WTl基因（mRNA)和作为校正用基因的持家基因（mRNA)的逆转录反应及延伸反应同 时且于同一容器内连续进行（一步法），可以简便地且在短时间内对作为目标的人WTlmRNA 的表达量进行定量。并且，本申请的发明人确认了通过使用该一步式RT-PCR法，能够以比 两步式RT-PCR法（其中分开对目的基因和校正基因进行扩增）更为简便的方式、并且在与 两步式RT-PCR法几乎为同等程度的短时间内以更高的灵敏度检测出目的基因。
[0020] 本发明是基于上述发现完成的，包括下述实施方式。
[0021] (I)对人WTl mRNA的表汰量讲行宙量的方法
[0022] (I-I)对人WTl mRNA的表达量进行定量的方法，其是使用一步式RT-PCR法对人 WTl mRNA的表达量进行定量的方法，其特征在于，使人WTl mRNA及持家基因（mRNA)的逆转 录反应及延伸反应同时且于同一容器内连续进行。
[0023] (1-2)如（I-I)所述的方法，其中，持家基因为GAPDH mRNA。
[0024] (1-3)如（I-I)或（1-2)所述的方法，其中，在对人WTl mRNA的PCR扩增中使用：
[0025] (a)包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号4表示的碱 基序列构成的反向PCR引物的引物组（primer set);或
[0026] (b)包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号10表示的碱 基序列构成的反向PCR引物的引物组。
[0027] (1-4)如（I-I)或（1-2)所述的方法，其中，在对人WTl mRNA的PCR扩增中使用：
[0028] (a'）包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号4表示的 碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由包含序列号5表示的碱基序列构成 的探针；或
[0029] (b'）包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号10表示的 碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号11表示的碱基序列构成的探 针。
[0030] (1-5)如（1-3)或（1-4)所述的方法，其中，在对人WTl mRNA的PCR扩增中还使 用：
[0031] (c)包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号7或12表示 的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组。
[0032] (1-6)如（1-3)或（1-4)所述的方法，其中，在对人WTl mRNA的PCR扩增中还使 用：
[0033] (c'）包含由序列号6表不的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号7或12表 示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号8表示的碱基序列构成 的探针。
[0034] (II)用于对人WTl mRNA的表汰量讲行宙量的实时PCR用试剂盒
[0035] (II-I)用于对人WTl mRNA的表达量进行定量的实时PCR用试剂盒，包含：
[0036] (a)包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号4表示的碱 基序列构成的反向PCR引物的引物组；或
[0037] (b)包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号10表示的碱 基序列构成的反向PCR引物的引物组。
[0038] (11-2)用于对人WTl mRNA的表达量进行定量的实时PCR用试剂盒，包含：
[0039] (a'）包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号4表示的 碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号5表示的碱基序列构成的探 针；或
[0040] (b'）包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号10表示的 碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号11表示的碱基序列构成的探 针。
[0041] (II-3)如（II-I)或（II-2)所述的用于对人WTl mRNA的表达量进行定量的实时 PCR用试剂盒，还包含：
[0042] (c)包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号7或12表示 的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组。
[0043] (11-4)如（II-I)或（I 1-2)所述的用于对人WTl mRNA表达量进行定量的实时PCR 用试剂盒，还包含：
[0044] (c'）包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号7或12表 示的碱基序列构成的反向PCR引物组成的引物组，及经标记的由序列号8表示的碱基序列 构成的探针。
[0045] 根据本发明的方法，可以提供一种比以往的WTl mRNA表达量的定量方法操作更简 便、所需劳力更少、并且能在更短的时间内进行测定的WTl mRNA表达量的定量方法。另外， 根据本发明的方法，还能够以比以往使用两步式RT-PCR法的测定方法更高的灵敏度进行 测定。更具体而言，通过使用本发明的方法或本发明的实时PCR用试剂盒，能够简便地且在 短时间内灵敏度良好地对人WTl mRNA的表达量进行定量。
[0046] 由此定量得到的人WTl mRNA表达量，是对白血病或实体癌的发病和复发的诊断、 及预后判断、以及骨髓移植时期的确定来说有用的指标。
[0047] 附图简沐
[0048] 图1表示以各种浓度（图中，I :2. 5X IO5个拷贝/测试，2 :2. 5X10 4个拷贝/测 试，3 :2. 5 X IO3个拷贝/测试，4 :2. 5 X 10 2个拷贝/测试，5 :2. 5 X 10 1个拷贝/测试）的 WTl RNA标准品为对象、单独扩增WTlmRNA时的WTl mRNA扩增曲线（实施例1)。
[0049] 图2表示以各种浓度（图中，I :1. OX IO8个拷贝/测试，2 :1. OX 10 7个拷贝/测 试，3 :1. 0 X IO6个拷贝/测试，4 :1. 0 X 10 5个拷贝/测试，5 :1. 0 X 10 4个拷贝/测试）的 GAPDH RNA标准品为对象、单独扩增GAPDH mRNA时的GAPDH mRNA扩增曲线（实施例1)。
[0050] 图3表示以各种浓度（图中，I :2. 5X IO5个拷贝/测试，2 :2. 5X10 4个拷贝/测 试，3 :2. 5 X IO3个拷贝/测试，4 :2. 5 X 10 2个拷贝/测试，5 :2. 5 X 10 1个拷贝/测试）的 WTl RNA标准品为对象、同时对WTl mRNA和GAPDH mRNA进行扩增时的WTl mRNA扩增曲线 (实施例1)。
[0051] 图4表示以各种浓度（图中，I :1. OX IO8个拷贝/测试，2 :1. OX 10 7个拷贝/测 试，3 :1. 0 X IO6个拷贝/测试，4 :1. 0 X 10 5个拷贝/测试，5 :1. 0 X 10 4个拷贝/测试）的 GAPDH RNA标准品为对象、同时对WTImRNA和GAPDH m