NA 测定试剂盒"Otsuka"（大塚制药株式会社）实施两步式RT-PCR法。
[0131] ⑴引物和探针的序列
[0132] 利用一步式RT-PCR法的WTl mRNA测定及GAPDH mRNA测定中使用的引物及探针的 序列示于表6。需要说明的是，两步式RT-PCR法由于使用了WTl mRNA测定试剂盒"Otsuka"， 故引物及探针不明。
[0133] [表 6]
[0134] 用于扩增WTI mRNA和GAPDH mRNA的引物序列及探针序列（序列组A)
[0135]
[0136] (2)标准品的制各
[0137] 作为标准品（WT1 mRNA、GAPDH mRNA)，一步式RT-PCR法中使用了通过与实施例 1记载的方法相同的方法制备的RNA标准品。将WTl RNA标准品的浓度调整为2. 5X 101、 2. 5X103、2. 5X105、2. 5X107个拷贝/测试。将GAPDH RNA标准品的浓度调整为I. 0X103、 1. OXlO5U. OXlO7U. OX IO9个拷贝/测试。两步式RT-PCR法中，使用了 WTl mRNA测定试 剂盒"Otsuka"中配备的标准品。
[0138] ⑶被测I试样
[0139] 作为被测试样，使用了从WTl阳性白血病细胞株K562中提取的RNA。具体而言，为 了防止核酸非特异性地吸附于PCR管，使用TE缓冲液（其中预先添加了作为载体RNA的大 肠杆菌转运RNA (最终浓度为50ng/ μ L))将从K562提取的总RNA稀释至最终浓度为2、5、 IOpg/μ L，由此得到被测试样。
[0140] (4) RT-PCR 反应
[0141] -步式RT-PCR法反应通过与实施例1相同的方法进行。两步式RT-PCR法使用 WTl mRNA测定试剂盒"Otsuka"（大塚制药株式会社），依照其所附说明书实施。针对各被 测试样进行2次重复测定。根据WTl mRNA测定试剂盒"Otsuka"的所附说明书，以拷贝数 / μ g RNA(其为每1 μ g总RNA的WTl mRNA数）的形式算出测定结果。
[0142] (5)结果
[0143] (5-1)使用提取自K562的RNA的稀释测定结果
[0144] 将从K562提取的RNA作为被测试样、使用一步式RT-PCR法和两步式RT-PCR法实 施的稀释试验的结果示于表7。
[0145] [表 7]
[0146] K562RNA 测定结果
[0147]
[0148] 由表7可知，在一步式RT-PCR法中，即使从K562提取的RNA被稀释至RNA浓度为 2. 5pg/ μ L，也能够对其进行测定；而与之相对，在两步式RT-PCR法中，从K562提取的RNA 被稀释至RNA浓度为2. 5pg/ μ L时，检测不到由PCR产生的扩增信号，为5pg/ μ L时，2次 重复测定的数据显示出17. 2及I. 95pg/ μ L的偏差，因此认为可作为有效值测定的范围为 IOpg/ μ L以上。由上述结果可以判定，与两步式RT-PCR法相比，一步式RT-PCR法的测定灵 敏度更高。
[0149] 「实施例31
[0150] 夺叉反应件试骀
[0151] 本实施例中，将表8所示的组（序列组Β)及表9所示的组分别用作引物及探针， 实施同时对WTl mRNA和GAPDH mRNA进行扩增的一步式RT-PCR法，评价交叉反应性。
[0152] [表 8]
[0153] 用于扩增WTl mRNA和GAPDH mRNA的引物序列及探针序列
[0154] (序列组B)
[0155]
[0156] 表示人WTl基因（NM_024426. 4 :序列号1)的区域。
[0157] 、表示人GAPDH基因（NM_002046. 3 :序列号2)的区域。
[0158] [表 9]
[0159] 用于扩增WTl mRNA和GAPDH mRNA的引物序列及探针序列
[0160] (比较组）
[0161]
[0162] 表示人WTl基因（NM_024426. 4 :序列号1)的区域。
[0163] 表示人GAPDH基因（NM_002046. 3 :序列号2)的区域。
[0164] 作为被测试样，使用了 Human Genome DNA(Merck KGaA，达姆施塔特，德国，产品 编号：69237) 250叩、50叩、10叩，及从町1阳性白血病细胞株1(562(11'11(562)提取的总1?隱 250ng〇
[0165] -步式RT-PCR反应通过与实施例1相同的方法进行。进而，在下述条件下，对将 Human Genome DNA及WTl K562 mRNA进行PCR而得到的扩增产物实施琼脂糖凝胶电泳，从 而对扩增产物进行确认。琼脂糖凝胶电泳按照常规方法进行。
[0166] <琼脂糖凝胶电泳的条件>
[0167] 电泳条件：15分钟，4% E-gal ;
[0168] 拍照条件：SYBR用滤光片，
[0169] 利用E-gal装置直接拍照，
[0170] 快门速度：1/15，
[0171] 光圈：4.5;
[0172] 应用条件：试样 2. 5 μ L+dH20 16. 5 μ L
[0173] Marker 2. 5 μ L+dH20 16. 5 μ L
[0174] [结果]
[0175] 已知Human Genomic DNA中不存在GAPDH基因，而是存在GAPDH的伪基因 (pseudogenes)。本实施例中，如图5 (A)中的泳道1~3所示，使用表8所示的引物序列及 探针序列实施一步式RT-PCR法时，通过电泳，没有在Human Genome DNA中观察到与GAPDH 一致的条带。即，可以确认根据使用本发明的引物及探针的一步式RT-PCR法，能够明确地 识别GAPDH和GAPDH的伪基因，不会将GAPDH的伪基因误认为GAPDH。另一方面，如图5 (B) 中的泳道1~3所示，使用表9所示的引物及探针序列实施一步式RT-PCR法时，通过电泳 观察到了与GAPDH-致的条带。即，使用该引物及探针进行一步式RT-PCR法时，无法区分 GAPDH和GAPDH的伪基因。
[0176] 另外，作为参考，表10、表11分别不出使用表8(实施例）及表9(比较例）中的 引物序列及探针序列实施一步式RT-PCR法时的GAPDH的扩增循环数和WTl的扩增循环数。 表中，"ND"表示检测不到。
[0177] [表 10]
[0178] GAPDH的扩增循环数
[0179]
[0180] ND :检测不到
[0181] [表 11]
[0182] WTl的扩增循环数
[0183]
[0184] 序列表自由f本
[0185] 序列号3~12所示的碱基序列是指表3中记载的引物及探针。对应关系详述于 表3。序列号13所示的碱基序列是指表9中记载的引物的碱基序列。该碱基序列相当于人 GAPDH基因（NM_002046. 3 :序列号2)的56~74区的碱基序列。
【主权项】
1. 对人WTlmRNA的表达量进行定量的方法，所述方法是使用一步式RT-PCR法对被测 试样中的人WTlmRNA的表达量进行定量的方法，其特征在于，使人WTlmRNA及持家基因 (mRNA)的逆转录反应及延伸反应在被测试样中同时且于同一容器内连续进行。2. 如权利要求1所述的方法，其中，持家基因为GAPDHmRNA。3. 如权利要求1或2所述的方法，其中，在对人WTlmRNA的PCR扩增中使用： (a) 包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号4表示的碱基序 列构成的反向PCR引物的引物组；或 (b) 包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号10表示的碱基序 列构成的反向PCR引物的引物组。4. 如权利要求1或2所述的方法，其中，在对人WTlmRNA的PCR扩增中使用： (a'）包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号4表示的碱基 序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号5表示的碱基序列构成的探针；或 (b'）包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号10表示的碱基 序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号11表示的碱基序列构成的探针。5. 如权利要求3或4所述的方法，其中，在对人WTlmRNA的PCR扩增中还使用： (c) 包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号7或12表示的碱 基序列构成的反向PCR引物的引物组。6. 如权利要求3或4所述的方法，其中，在对人WTlmRNA的PCR扩增中还使用： (c'）包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号7或12表示的 碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号8表示的碱基序列构成的探 针。7. 用于对人WTlmRNA的表达量进行定量的实时PCR用试剂盒，包含： (a) 包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号4表示的碱基序 列构成的反向PCR引物的引物组；或 (b) 包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号10表示的碱基序 列构成的反向PCR引物的引物组。8. 用于对人WTlmRNA的表达量进行定量的实时PCR用试剂盒，包含： (a'）包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号4表示的碱基 序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号5表示的碱基序列构成的探针；或 (b'）包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号10表示的碱基 序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号11表示的碱基序列构成的探针。9. 如权利要求7或8所述的用于对人WTlmRNA的表达量进行定量的实时PCR用试剂 盒，还包含： (c) 包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号7或12表示的碱 基序列构成的反向PCR引物的引物组。10. 如权利要求7或8所述的用于对人WTlmRNA的表达量进行定量的实时PCR用试剂 盒，还包含： (c'）包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由序列号7或12表示的 碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标记的由序列号8表示的碱基序列构成的探
【专利摘要】本发明提供一种用于简便且在短时间内灵敏度良好地对人WT1的mRNA的表达量进行定量的方法，该方法可用于对白血病、实体癌等癌症的诊断和对骨髓移植时期的确定。该方法使用一步式RT-PCR法对人WT1 mRNA的表达量进行定量，其特征在于，使人WT1 mRNA及持家基因(mRNA)的逆转录反应及延伸反应同时且于同一容器内连续进行。
【IPC分类】C12N15/09, C12Q1/68
【公开号】CN104937112
【申请号】CN201480005576
【发明人】西条容子, 伊藤隆太, 古贺大辅
【申请人】大塚制药株式会社
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2014年1月22日
【公告号】CA2898965A1, EP2949760A1, WO2014115779A1