用端粒酶抑制剂治疗细胞增殖性病症的诊断标志物的制作方法
【专利说明】用端粒酶抑制剂治疗细胞増殖性病症的诊断标志物
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年11月30日提交的美国临时专利申请No. 61/732, 263、2013年 3月13日提交的美国临时专利申请N〇.61/780,851、2013年3月13日提交的美国专利申 请No. 13/802, 035、2013年3月15日提交的美国临时专利申请No. 61/798, 478和2013年4 月5日提交的美国临时专利申请No. 61/809, 228的优先权，通过提及将它们的公开内容完 整收入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及用于鉴定会受益于端粒酶抑制剂化合物治疗的具有或怀疑具有癌症 的个体的方法及用于治疗这些个体的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 癌症是全世界死亡的一种主要原因。尽管化学疗法领域有重大进展，但是许多最 流行形式的癌症仍然抵抗化学治疗性干预。
[0006] 端粒是存在于真核生物体的线性染色体末端处的重复核酸序列。端粒序列与端粒 结合蛋白一起对染色体赋予稳定性。一般地，端粒由短串联重复构成，重复序列单元由对于 生物体而言特定的酶端粒酶规定。端粒重复序列对于多种生物体是已知的。人端粒重复序 列单元是（TTAGGG)n。在双链重复序列外，一些端粒的3'端含有单链区，其对于人而言位于 富含G的链上。
[0007] 端粒酶是一种合成端粒DNA的核糖蛋白（riboprotein)。在缺乏端粒酶的情况中， 端粒由于DNA聚合酶不能复制线性双链体DNA的末端而逐渐缩短。端粒的逐渐缩短最终导 致细胞周期停滞或细胞死亡。在人中，由于出生前正常体细胞中的端粒酶阻抑、出生时和贯 穿整个一生的初始端粒长度、和祖细胞或干细胞中端粒酶受紧密调节的表达，可发生细胞 中的端粒长度依赖性死亡。人出生时具有"全长"端粒。由于端粒酶在体细胞组织中是下 调的，这导致端粒DNA随细胞年龄和实足年龄而损失。如此，端粒起有丝分裂钟的作用，对 正常人细胞赋予有限的分裂能力。短端粒修复干细胞增殖的能力。例如，表皮干细胞中的 短端粒修复皮肤和毛发生长。
[0008] 癌细胞一般经历重复轮次的细胞分裂，并且具有稳定但比正常细胞短的端 粒。端粒酶活化对于大多数癌细胞无限复制是必需的，并且它实现肿瘤生长和转移 (Kim et al., Science 266:2011-2015 ；Shay Jff and Wright WE., Carcinogenesis 26:867-74 (2005))。因而，认为抑制端粒酶是一种用于极其多种实体瘤类型和血液学恶性 的有希望的治疗策略（Harley CB, Nature Rev. Cancer, 8:167-179 (2008)) 〇
[0009] 不幸地，许多癌症患者没有获得来自细胞毒剂或靶向疗法（诸如端粒酶抑制剂） 的益处，但是仍然暴露于其毒性效应。出于这些原因，迫切需要用于鉴定会有利地响应这些 治疗剂治疗的癌症患者的新颖方法。
[0010] 贯穿本说明书，提及多篇专利、专利申请和其它类型的出版物（例如期刊文章）。 在此通过提及完整收录本文中引用的所有专利、专利申请、和出版物的公开内容用于所有 目的。
[0011] 发明概述
[0012] 本文中提供的发明公开了用于鉴定会受益于用端粒酶抑制剂疗法治疗的个体的 方法和用于治疗该个体的方法，等等。
[0013] 因而，在一个方面中，本文中提供了用于选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的诊 断有或怀疑具有癌症的个体的方法，所述方法包括：通过分析来自所述个体的生物学样品 中存在的癌细胞中端粒核酸的相对长度测定相对端粒长度；并在测定来自所述个体的生物 学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端 粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的个体。在 本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂包含寡核苷酸。在本文中公 开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸与端粒酶的RNA组分互补。在本文中公开 的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸的长度是10-20个碱基对。在本文中公开的 任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)。在 本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个N3' 一P5'硫代氨 基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含 N3'一 P5'硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中， 寡核苷酸包含与寡核苷酸的5'和/或3'端连接的脂质模块。在本文中公开的任何实施方 案的一些实施方案中，脂质模块经由接头与寡核苷酸的5'和/或3'端连接。在本文中公 开的任何实施方案的一些实施方案中，接头是甘油或氨基甘油接头。在本文中公开的任何 实施方案的一些实施方案中，脂质模块是棕榈酰基（C16)模块。在本文中公开的任何实施 方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂是伊美司他（Imetelstat)。在本文中公开的任何实 施方案的一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、或血液学癌症。在本文 中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导致降低的癌细胞增殖和 /或肿瘤生长。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导 致个体中延长的无进展存活。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，与药学可 接受赋形剂一起施用端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，为 口服、静脉内、皮下、肌肉内、表面、腹膜内、鼻内、吸入、肿瘤内、或眼内施用配制端粒酶抑制 剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂包 括使一种或多种癌细胞与端粒酶抑制剂接触。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方 案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂导致降低的细胞增殖、升高的凋亡、或细胞衰老中的 一项或多项。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法进一步包括对所 述个体施用治疗有效量的一种或多种别的癌症治疗剂。在本文中公开的任何实施方案的一 些实施方案中，通过qPCR、tel〇-FISH、或Southern印迹测定平均端粒长度。在本文中公开 的任何实施方案的一些实施方案中，个体是人。在本文中公开的任何实施方案的一些实施 方案中，所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的 一些实施方案中，细胞系选自下组：MHMel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细 胞。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征的细胞系选自代表本文中公 开的任何实施方案的生物学样品的类型的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实 施方案中，经表征的细胞系是非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细胞系、或卵巢细胞系。在本文 中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是自来自多个个体 的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案 中，所述来自多个天然发生肿瘤的癌细胞是与来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞 属于相同类型的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，确定所述生物学样品 中存在的癌细胞的端粒长度在所述端粒长度范围的第40个百分位数、第35个百分位数、第 30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个百分位数、第10个百分位数、 第5个百分位数、或更小中。
[0014] 在另一个方面中，本文中提供了用于治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法， 所述方法包括：通过分析来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中端粒核酸的相对长 度测定相对端粒长度；在测定来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端 粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中 时，选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的个体；并对所述个体施用治疗有效量的端粒酶抑 制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂包含寡核苷酸。在 本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸与端粒酶的RNA组分互补。在 本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸的长度是10-20个碱基对。在 本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个 N3'一 P5'硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中， 寡核苷酸包含N3' 一 P5'硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施方案的一 些实施方案中，寡核苷酸包含与寡核苷酸的5'和/或3'端连接的脂质模块。在本文中公 开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块经由接头与寡核苷酸的5'和/或3'端连 接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，接头是甘油或氨基甘油接头。在本 文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块是棕榈酰基（C16)模块。在本文中 公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂是伊美司他。在本文中公开的任何 实施方案的一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、或血液学癌症。在本文 中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导致降低的癌细胞增殖和 /或肿瘤生长。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导 致个体中延长的无进展存活。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，与药学可 接受赋形剂一起施用端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，为 口服、静脉内、皮下、肌肉内、表面、腹膜内、鼻内、吸入、肿瘤内、或眼内施用配制端粒酶抑制 剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂包 括使一种或多种癌细胞与端粒酶抑制剂接触。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方 案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂导致降低的细胞增殖、升高的凋亡、或细胞衰老中的 一项或多项。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述方法进一步包括对所 述个体施用治疗有效量的一种或多种别的癌症治疗剂。在本文中公开的任何实施方案的一 些实施方案中，通过qPCR、tel〇-FISH、或Southern印迹测定平均端粒长度。在本文中公开 的任何实施方案的一些实施方案中，个体是人。在本文中公开的任何实施方案的一些实施 方案中，所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的 一些实施方案中，细胞系选自下组：MHMel细胞、A549细胞、SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细 胞。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征的细胞系选自代表本文中公 开的任何实施方案的生物学样品的类型的细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实 施方案中，经表征的细胞系是非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细胞系、或卵巢细胞系。在本文 中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是自来自多个个体 的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案 中，所述来自多个天然发生肿瘤的癌细胞是与来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞 属于相同类型的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，确定所述生物学样品 中存在的癌细胞的端粒长度在所述端粒长度范围的第40个百分位数、第35个百分位数、第 30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个百分位数、第10个百分位数、 第5个百分位数、或更小中。
[0015] 在又一个方面中，本文中提供了用于治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法， 所述方法包括：在测定来自所述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端粒长度 在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中时，对 所述个体施用治疗有效量的端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案 中，端粒酶抑制剂包含寡核苷酸。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷 酸与端粒酶的RNA组分互补。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸 的长度是10-20个碱基对。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包 含序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO:3)。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中， 寡核苷酸包含至少一个N3' 一 P5'硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公开的任何实施 方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含N3'一 P5'硫代氨基磷酸酯核苷间连接。在本文中公 开的任何实施方案的一些实施方案中，寡核苷酸包含与寡核苷酸的5'和/或3'端连接的 脂质模块。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块经由接头与寡核苷 酸的5'和/或3'端连接。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，接头是甘油 或氨基甘油接头。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，脂质模块是棕榈酰基 (C16)模块。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂是伊美司他。 在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、 或血液学癌症。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，端粒酶抑制剂的施用导 致降低的癌细胞增殖和/或肿瘤生长。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中， 端粒酶抑制剂的施用导致个体中延长的无进展存活。在本文中公开的任何实施方案的一些 实施方案中，与药学可接受赋形剂一起施用端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案 的一些实施方案中，为口服、静脉内、皮下、肌肉内、表面、腹膜内、鼻内、吸入、肿瘤内、或眼 内施用配制端粒酶抑制剂。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，施用治疗有 效量的端粒酶抑制剂包括使一种或多种癌细胞与端粒酶抑制剂接触。在本文中公开的任何 实施方案的一些实施方案中，施用治疗有效量的端粒酶抑制剂导致降低的细胞增殖、升高 的凋亡、或细胞衰老中的下列一项或多项。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案 中，所述方法进一步包括对所述个体施用治疗有效量的一种或多种别的癌症治疗剂。在本 文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，通过qPCR、tel〇-FISH、或Southern印迹测定 平均端粒长度。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，个体是人。在本文中公 开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已知标准品是经表征的细胞系。在 本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，细胞系选自下组：MHMel细胞、A549细胞、 SK-Mel-5细胞、和Ovcar-5细胞。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征 的细胞系选自代表本文中公开的任何实施方案的生物学样品的类型的细胞系。在本文中公 开的任何实施方案的一些实施方案中，经表征的细胞系是非小细胞肺癌细胞系、肝细胞细 胞系、或卵巢细胞系。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种已 知标准品是自来自多个个体的多个天然发生肿瘤建立的端粒长度范围。在本文中公开的任 何实施方案的一些实施方案中，所述来自多个天然发生肿瘤的癌细胞是与来自所述个体的 生物学样品中存在的癌细胞属于相同类型的。在本文中公开的任何实施方案的一些实施方 案中，确定所述生物学样品中存在的癌细胞的端粒长度在所述端粒长度范围的第40个百 分位数、第35个百分位数、第30个百分位数、第25个百分位数、第20个百分位数、第15个 百分位数、第10个百分位数、第5个百分位数、或更小中。
[0016] 附图简述
[0017] 图IA描绘了基于使用定量PCR(qPCR)测定的平均端粒长度，伊美司他非小细胞 (NSC)肺癌II期（CP14B-012)研宄的短端粒亚组（33个百分位数）的无进展存活（PFS)分 析，如实施例2中显示的。
[0018] 图IB描绘了基于使用定量PCR(qPCR)测定的平均端粒长度，伊美司他非小细胞 (NSC)肺癌II期（CP14B-012)研宄的中等-长端粒亚组（相对端粒长度的较长67% )的 无进展存活（PFS)分析，如实施例2中显示的。
[0019] 图2描绘了来自伊美司他非小细胞（NSC)肺癌II期（CP14B-012)研宄的伊美司 他治疗分组中具有相对端粒长度的最短第25个百分位数的15名患者的数据的无进展存活 (PFS)分析。使用端粒荧光原位杂交（Tel0-FISH)完成这些患者的个体端粒长度的分析。
[0020] 图3A描绘了福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE)人肿瘤细胞系M14Mel、OVCAR-8、 A549、SK-Mel-5、MDA-MB-231、MDA-MB435、OVCAR-5、A498 和 CAKI-I 中的末端限制性片段 (TRF)长度，如通过Southern印迹测定的。
[0021] 图3B描绘了福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE)人肿瘤细胞系M14Mel、0VCAR-8、 A549、SK-Mel-5、MDA-MB-231、MDA-MB435、OVCAR-5、A498 和 Caki-I 中的平均 T/S 比，如通 过定量PCR (qPCR)测定的。
[0022] 图4A描绘了福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE)人肿瘤细胞系M14Mel、0VCAR-8、 A549、SK-Mel-5、MDA-MB-231、MDA-MB435、OVCAR-5、A498 和 CAKI-I 中的末端限制性片段 (TRF)长度，如通过Southern印迹测定的。
[0023] 图 4B 描绘了人细胞系机41^1、六549、51(-]^1-5、和仍^^-5(0￥5)的了61〇-卩15!1结 果。
[0024] 图5描绘了相对于患者端粒长度百分位数绘图的来自伊美司他非小细胞（NSC) 肺癌Π 期（CP14B-012)研宄的患者的无进展存活（PFS)危害比（HR)，其中通过定量 PCR(qPCR)测定相对端粒长度。
[0025] 图6描绘了相对于患者端粒长度百分位数绘图的来自伊美司他非小细胞（NSC)肺 癌II期（CP14B-012)研宄的患者的无进展存活（PFS)危害比（HR)，其中通过端粒荧光原位 杂交（Tel0-FISH)测定相对端粒长度。
[0026] 图7描绘了基于使用前瞻性端粒荧光原位杂交（Tel0-FISH)测定法测定的相对端 粒长度，对伊美司他非小细胞肺癌II期（CP14B-012)研宄的所有114名患者的无进展存活 (PFS)分析。
[0027] 图8A描绘了基于使用前瞻性Telo-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司他 非小细胞肺癌Π 期（CP14B-012)研宄的短端粒亚组（N = 20)的无进展存活（PFS)分析。
[0028] 图8B描绘了基于使用前瞻性Telo-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司他 非小细胞肺癌Π 期（CP14B-012)研宄的中等-长端粒亚组（N = 39)的无进展存活（PFS) 分析。
[0029] 图9描绘了基于使用前瞻性Telo-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司他 非小细胞肺癌II期（CP14B-012)研宄中的所有患者（N = 114)的总体存活（OS)分析。
[0030] 图IOA描绘了基于使用前瞻性TelO-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司 他非小细胞肺癌Π 期（CP14B-012)研宄中的短端粒亚组（N = 20)的总体存活（OS)分析。
[0031] 图IOB描绘了基于使用前瞻性Tel0-FISH测定法测定的相对端粒长度，对伊美司 他非小细胞肺癌Π 期（CP14B-012)研宄中的中等-长端粒亚组（N = 39)的总体存活（OS) 分析。
[0032] 图IlA描绘了基于使用定量PCR(qPCR)测定的平均端粒长度，对伊美司他非小细 胞（NSC)肺癌II期（CP14B-012)研宄的短端粒亚组（33个百分位数）的无进展存活（PFS) 分析，如实施例4中显示的。
[0033] 图IlB描绘了基于使用定量PCR(qPCR)测定的平均端粒长度，对伊美司他非小细 胞（NSC)肺癌II期（CP14B-012)研宄的中等-长端粒亚组（相对端粒长度的较长67% ) 的无进展存活（PFS)分析，如实施例4中显示的。
[0034] 发明详述
[0035] 本发明特别提供了用于鉴定会受益于用端粒酶抑制剂化合物治疗的怀疑具有或 已经诊断有细胞增殖性病症的个体的方法以及用于治疗这些个体的方法。癌细胞中的端 粒长度可以在肿瘤间变化。发明人已经观察到与具有较长端粒长度的癌细胞相比，具有较 短端粒长度的癌细胞对用端粒酶抑制剂化合物（例如伊美司他）治疗更具响应性。因而， 本文中提供了用于选择会受益于用端粒酶抑制剂治疗的诊断有或怀疑具有癌症的个体的 方法。本文中还提供了在测定来自下述个体的生物学样品中存在的癌细胞中的平均相对端 粒长度在自一种或多种已知标准品测定的相对端粒长度范围的第50个百分位数或更小中 时，用端粒酶抑制剂治疗诊断有或怀疑具有癌症的个体的方法。
[0036] L通用技术
[0037] 除非另有指示，本发明的实施会采用核酸化学、分子生物学、微生物学、细胞 生物学、生物化学、和免疫学中的常规技术，其是本领域技术人员公知的。在文献中完 整解释了此类技术，所述文献诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二 版(Sambrook et al. , 1989)和 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版 (Sambrook and Russel, 2001)(在本文中共同称为"Sambrook"）；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al.，eds·，1987，包括到 2001 的增刊）；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al.，eds·，1994)。可以通过公知的化学合成 技术体外合成核酸，如记载于例如 Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 ；Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661 ；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:3440-3444 ；Frenkel(1995)Free Ra