Kv1.3拮抗剂及其使用方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求提交于2013年1月28日的美国临时申请61/757,389和提交于2013 年1月25日的美国临时申请61/756, 777的权益，所述美国临时申请以引用的方式全文并 入。
技术领域
[0002] 本发明涉及KvL 3拮抗剂，编码该拮抗剂的多核苷酸，以及制备和使用上述拮抗 剂和多核苷酸的方法。该拮抗剂基于OdK2肽的变体。
【背景技术】
[0003] 离子通道经由离子电流的产生来调控多种多样的细胞功能，该细胞功能包括 心脏的、CNS和免疫生理学功能。据估计5-30%之间的市售药品可调控离子通道活性 (Overington 等人，Nat Reviews Drug Discovery 5:993-6, 2006)。亚家族选择性是提高 当前非选择性药物的效率和安全性的新疗法的期望特征，并且使小分子和已知的天然存在 的肽毒素面临重大挑战（Wickenden等人，Future Med Chem 4:661-79, 2012)。在大型同源 家族中尤其如此，诸如电压门控的K+、Ca+和Na+通道。
[0004] KvL 3,即钾电压门控通道亚家族A的成员3,是在T细胞上表达的并且作用为调 控T细胞活化。持续的钙信号传导是T细胞活化所需的，以用于经由钙调磷酸酶依赖性脱 磷酸作用和活化T细胞核因子（NFAT)的核转位来上调细胞表面活化标记物和增加细胞因 子的产生和增殖。来源于内质网的细胞内钙库的肌醇三磷酸（IP3)依赖性释放激活了细 胞表面上的钙释放激活钙通道（CRAC)，从而提供细胞外钙的内流和持续的钙信号传导（在 Cahalan等人，Immunol Rev 231 :59-87, 2009中查看）。钾外流是细胞保持超级化状态和维 持钙内流以达成完全的T细胞活化所需要的。这种钾外流看起来是经由电压门控的钾通道 KvL 3和钙激活的钾通道KCa3. 1来调控的。对KvL 3具有选择性的阻滞剂已显示KvL 3是 负责调控钙信号传导的钾通道，甚至当不存在对KCa3. 1的任何抑制时也是如此。（Beeton 等人，Mol Pharmacol 67 :1369-81，2005)。阻滞KvL 3使T细胞去极化，并且抑制外钙内流、 细胞因子产生，以及活化T细胞的体外增殖（查看Cahalan等人，Immunol Rev 231:59-87， 2009)〇
[0005] KvL 3阻滞剂已经显示为减少自身免疫性模型中T细胞依赖性疾病的进展，所述 疾病为诸如实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE)、实验性关节炎、迟发型过敏（DTH)、变应性 接触性皮炎和血管球性肾炎（Rangaraju等人，Expert Opin Ther Targets 13 :909_24， 2009 ;Beeton 等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 103 :17414-9, 2006 ;Koo 等人，J Tmmunol 158 :5120-8，1997 ;Hyodo 等人，Am J Physiol Renal Physiol 299 :F1258-69,2010)。钙的 钙调磷酸酶NFAT途径抑制剂环胞素 A(新山地明、山地明、环孢霉素）和他克莫司（FK-506 或藤霉素）是用于严重的免疫障碍的获批治疗物，该免疫障碍包括移植排斥和严重的类风 湿性关节炎。钙调磷酸酶在组织如肾中的广泛分布可导致较高程度的来自药物机理本身的 毒性、使安全边际变窄，以及这些化合物的有限治疗应用。使用选择性KvL 3阻滞剂的T细 胞抑制可导致增强的药物安全性，以及T细胞介导的炎症和自身免疫性疾病的治疗的较高 效率。
[0006] KvL 3可在调控体重增长和提高胰岛素敏感性方面起作用。KvL 3缺陷型小鼠 显示出降低的体重增长，较高的胰岛素敏感性，以及降低的血浆葡萄糖水平（Xu等人，Hum Mol Genet 12:551-9,2003)。KvL 3阻滞剂已经显示为增强骨骼肌和脂肪组织中葡萄糖转 运蛋白4 (GLUT4)的细胞表面表达，并且导致正常和ob/ob肥胖小鼠中增强的胰岛素敏感 性，以及增强体外原代脂肪细胞中的葡萄糖摄入（Xu等人，Proc Natl Acad Sci USA 101 : 3112-7,2004)。在人体中，KvL 3基因的单核苷酸多态性（SNP)已与减少的胰岛素敏感性 和葡萄糖耐受性异常相关联（Tschritter，Clin Endocrinol Metab 91 :654_8, 2006)。
[0007] KvL 3可在接受血管手术诸如血管成形术之后的患者的平滑肌细胞增生性疾病如 再狭窄中具有关键的功能。KvL 3表达在人和小鼠平滑肌细胞增殖时增强。KvL 3阻滞剂 抑制外钙内流、减少平滑肌细胞迀移，并且抑制体外人静脉样本中的血管内膜增生（Cheong 等人，Cardiovasc Res 89 :282_9,2011) 〇
[0008] 越来越多的证据指示KvL 3通道在多种类型的细胞包括肿瘤细胞（Bielanska等 人，Curr Cancer Drug Targets 9 :904_14,2009)、小胶质细胞（Khanna等人，Am J Physiol Cell Physiol 280 :C796-806, 2001)的活化和/或增殖，以及神经祖细胞的分化（Wang等 人，J Neurosci 30:5020-7, 2010)中有所涉及，表明在神经炎症和神经退化疾病，以及癌症 的治疗中KvL 3阻滞剂可为有益的。
[0009] 由多种生物体产生的毒素肽已经演进成了靶离子通道。蛇、蝎子、蜘蛛、蜜蜂、蜗 牛、海葵、昆虫、蛛形纲动物、刺胞动物、爬行动物，以及软体动物是产生可充当生物活性小 毒素肽或"毒素"的丰富来源的毒液的生物体的一些示例，所述小型生物活性毒素肽或"毒 素"强效地和选择性地将离子通道和受体作为目标。在大多数情况中，这些毒素肽已经通过 以下方式而演化为离子通道的强效拮抗剂或抑制剂：通过结合至离子通道孔并物理阻滞离 子传导通路，或者通过结合至离子通道孔外部的区域（例如，电压传感器域）而拮抗通道功 能。毒素肽通常为约20-80个氨基酸长，具有不同的二硫键对，并且可基于他们的二硫键连 接和肽折叠而被划分成多个超家族。许多毒液毒素经工程改造以提高他们的特性，诸如选 择性（King，Expert Opin Biol Ther 11 :1469_84,2011 ;Escoubas 和 King，Expert Review Proteomics 6 :221_4,2009)〇
[0010] 显示出KvL 3阻滞的毒素肽包括ShK、0dK2、OsKU玛格毒素、短肤蝎毒素 等（参见 Chandy 等人，Trends in Pharmacol Sci 25 :280_9,2004)。Κν1·3 阻滞 剂0dK2和0sKl(a -ΚΤχ3. 7)是α -ΚΤχ3蝎毒素家族的同源成员，分别来源于希腊杀 人蝎（Odontobuthus doriae)和约旦柱尾蝎（Orthochirus scrobiculosus)的毒液 (Abdel-Mottaleb 等人，Toxicon 51 :1424-30, 2008 ;Mouhat 等人，Biochem J 385 (Pt 1): 95-104, 2005 ;国际专利公布TO2006/002850)。OsKl ( α -KTx3. 7)被报道为强效地阻滞 KvL 3、Kvl. 1和KvL 2通道并且适度地阻滞KCa3. 1通道（Mouhat等人，Biochem J 385 (Pt 1):95-104,2005)。0(11(2((1-1〇^3.11)被报道为阻滞1^1.3，但是对1^1.1、1^1.2、1^1.4、 KvL 5 和 KvL 6 无活性（Abdel-Mottaleb 等人，Toxicon 51 :1424-30, 2008 ;Epub 2008Mar 29) 〇
[0011] 经工程改造的毒素肽具有提高的效能、选择性和/或半衰期，所述毒素包 括已经报道的OsKl和ShK (国际专利申请公布W02006/002850 ;国际专利申请公布 W02006/042151 ;国际专利申请公布W02008/088422,国际专利申请公布W02006/116156)。
[0012] 存在对更强效和更具选择性的KvL 3阻滞剂的需求，以用于KvL 3介导的疾病的 治疗处理，所述疾病为诸如T细胞介导的炎症和自身免疫性疾病，诸如狼疮和多发性硬化 症。
【附图说明】
[0013] 图 1 是天然 0dK2(SEQ ID NO :1)和 0sKl(SEQ ID NO :2)(在图中示出为 OsK-I)的 氨基酸序列比对。半胱氨酸残基以灰色加亮显示。示出了二硫桥键和半胱氨酸对。0dK2和 OsKl之间的九个相异残基以黑色加亮显示。
[0014] 图 2 将 A)KVlC2(0dk2-Fc 融合体）和 B)KVlN2(0sKl-Fc 融合体）结合至 KvL 3E3C 细胞（实线，黑色），在10倍过量ShK的存在下结合至KvL 3E3C细胞（虚线，灰色），以及 结合至KvL 5 (阴性对照细胞；点线，灰色）。使用流式细胞术用抗人Fc-Cy5检测结合。数 据被示出为几何平均荧光强度（GMFI)的柱状图叠层（几何平均值，红色A :Cy5)。
[0015] 图3KV1C2对记忆T细胞增殖的抑制（0dK2_Fc融合体）（▼)。每一数据点是一式 三份反应的平均值土SD。阴性对照IgG4 Fc(〇）不抑制T细胞增殖。
[0016] 图4在使用表达KvL 3和KvL 1的细胞进行的结合和铊通量测定中确定的A)氨 基酸序列、B)肽变体融合蛋白的活性和选择性。
[0017] 图5A)经纯化的0dk2嵌合体Fc融合蛋白在单一 IOOnM浓度时对T细胞活化的抑 制。KV1B03 ( )与KV1C2 (0dK2Fc融合体）（□)相同。B) KV1D261对T细胞活化的浓度 依赖性抑制。阴性对照IgG4 Fc不抑制T细胞的IL-2产生。C)结合至KvL 3E3C细胞和结 合至T细胞抑制之间的相关性，用于选择变体。
[0018] 图6p261C端延伸HSA融合蛋白文库的活性。示出了 C端延伸的氨基酸序列和所 得的延伸的P261氨基酸序列，以及在结合和铊通量测定中的活性。
[0019] 图7A)p261B)p579C端延伸HSA融合蛋白的表征。
[0020] 图8选择0dK2变体融合蛋白的特征。
[0021] 图9KV1D261_34在小型猪体内的药代动力学。
[0022] 图10在小型猪体内施用KV1D261_34后，对淋巴细胞的IL-17A分泌的体外抑制。
[0023] 图11在迟发型超敏反应（DTH)小型猪模型中的抗原激发之后，在第10天引流淋 巴结中的细胞数目。
【发明内容】
[0024] 本发明提供一种分离的KvL 3肽拮抗剂，所述肽拮抗剂具有包含以下的氨基酸序 列：
[0025] (i)以SEQ ID NO :1示出的序列，其在位置10处甘氨酸被异亮氨酸置换（GlOI)， 并且任选地具有1、2、3、4、5、6或7个附加的置换；或者
[0026] (ii)与SEQ ID NO :1具有至少80%同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列还包括 GlOI置换。
[0027] 本发明还提供分离的KvL 3肽拮抗剂，该KvL 3肽拮抗剂包含SEQ ID NO :55或 SEQ ID NO :86 的序列。
[0028] 本发明还提供融合蛋白，该融合蛋白包含本发明的肽拮抗剂。
[0029] 本发明还提供分离的多核苷酸，该多核苷酸对本发明的肽拮抗剂或融合蛋白进行 编码。
[0030] 本发明还提供载体，该载体包含本发明的分离的多核苷酸。
[0031] 本发明还提供宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的载体。
[0032] 本发明还提供一种制备本发明的拮抗剂或融合蛋白的方法，该方法包括：培养本 发明的宿主细胞，以及回收由该宿主细胞表达的拮抗剂或融合蛋白。
[0033] 本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的拮抗剂或融合蛋白， 以及药学上可接受的载体。
[0034] 本发明还提供一种对具有与不期望的T细胞活化相关的病症的受试者体内的T细 胞活化进行抑制的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的本发明的拮抗剂或融合蛋白 以抑制T细胞活化。
【具体实施方式】
[0035] 本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均以引用方式 并入本文，如同在本文中完整呈现。
[0036] 说明书和权利要求书中所用的"一种"、"该"和"所述"等单数形式包括复数指代， 除非上下文清楚表明并非如此。
[0037] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的 普通技术人员通常所理解的含义相同。本文描述了示例性的组合物和方法，不过类似或等 同于本文所述的组合物和方法的任何组合物和方法都可用于本发明实践或测试。
[0038] 术语"多肽"是指包含至少两个氨基酸残基的分子，该至少两个氨基酸残基由肽键 连接以形成多肽。小于约80个氨基酸长度的多肽可被称为"肽"。多肽也可被称作"蛋白 质"。
[0039] 术语"多核苷酸"是指包含由糖-磷酸主链或其他等同的共价化学方式所共价连 接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型示 例。
[0040] 术语"互补序列"是指第二分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与第一分离的多 核苷酸序列反向平行，并且包含与第一多核苷酸序列中的核苷酸互补的核苷酸。
[0041] 术语"载体"是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载 体多核苷酸通常包含有要素诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记，其功能是促进这 些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的示例可包括细胞、病毒、动物、植 物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA分子或 RNA分子或这些分子的杂合体。
[0042] 术语"表达载体"是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载 体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
[0043] 如本文所用的术语"野生型0dK2"或"0dK2"或"天然0dK2"是指具有以SEQ ID NO :1(GVPTDVKCRGSPQCIQPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK)所示的序列的蝎子（希腊杀人蝎）0dK2 多肽。
[0044] 如本文所用的术语"野生型OsKr'或"OsKl"或"天然OsKl"是指具有以SEQ ID NO :2(GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK)所示的序列的蝎子（约旦柱尾蝎）0sKl 多肽。
[0045] 如本文所用的术语"变体"或"0dK2变体"是指与SEQ ID NO : 1所示的野生型0dK2 多肽相差一个或多个修饰（例如，核苷酸或氨基酸的置换、插入或缺失）的多肽。
[0046] 在整个说明书中，0dK2变体的残基编号根据SEQ ID NO :1。例如，本说明书中的 "G10"是指在SEQ ID NO :1的位置10处的甘氨酸残基。因此，0dK2G10I是指在位置10处 甘氨酸被置换为异亮氨酸的0dK2变体，以及0dK2G10I，P12R是指在位置10处甘氨酸被置 换为异亮氨酸并且在位置12处脯氨酸被置换为精氨酸的0dK2变体。
[0047] 当任意给定氨基酸残基或核苷酸残基的位置是通过参考选定的氨基酸或多核苷 酸序列中的相同或等同位置来指定，而不是通过该序列中所述成分的实际计数位置指定 时，给定氨基酸或多核苷酸序列的编号"对应于"或者是"相对于"选定的氨基酸或多核苷 酸序列的编号。因此，例如，给定多肽序列中给定氨基酸位置的编号对应于用作参考序列的 选定多肽序列中的相同或等同氨基酸位置。
[0048] "等同位置"（例如，"等同氨基酸位置"或"等同核酸位置"或"等同残基位置"）在 本文中被定义为测试多肽（或测试多核苷酸）序列的位置（诸如，氨基酸位置或核酸位置 或残基位置），该位置当使用如本文所描述的比对算法进行最佳比对时，与参考多肽（或参 考多核苷酸）序列的对应位置比对。测试多肽的等同氨基酸位置无需具有与参考多肽的对 应位置相同的计数位置编号；同样，测试多核苷酸的等同核酸位置无需具有与参考多核苷 酸的对应位置相同的计数位置编号。
[0049] 当两个多核苷酸序列使用定义的参数，即定义的氨基酸置换矩阵、空位存在罚 分（也被称为空位开放罚分）和空位延伸罚分比对以便达到该对序列可能达到的最高 相似性分数时，所述两个多核苷酸序列是"最佳比对的"。BL0SUM62矩阵（Henikof f和 Henikoff(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22) :10915-10919)通常被用作多肽序列比 对算法（诸如BLASTP)中的默认评分置换矩阵。将空位存在罚分施加用于将单氨基酸空位 引入比对序列中的一个序列中，并且将空位延伸罚分施加于空位中的每个残基位置。除非 另外指明，否则本文所采用的比对参数为：BL0SUM62评分矩阵、空位存在罚分=11、以及空 位延伸罚分=1。比对分数由比对开始和结束（例如，比对窗口）处的每个序列的氨基酸位 置限定，并且任选地通过向一个或两个序列插入一个或多个空位来限定，以便达到最高可 能的相似性分数。
[0050] 如本文所使用的"Kvl. 3"（也被称为KCNA3、HPCN3、HGK5、HuKIII或HLK3)是指熟 知的人钾电压门控通道亚家族A成员3,其具有以Uniprot登录号P22001和以SEQ ID NO: 418示出的序列。
[0051 ] 如本文所用的"Kvl. 3拮抗剂"或"拮抗剂"是指本发明的0dK2变体或0dK2变体融 合蛋白，该0dK2变体或0dK2变体融合蛋白抑制或阻滞KvL 3功能达至少10 %、20 %、30 %、 40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。野生型0(11(2的氨基酸序列示 出于 SEQ ID NO :1 中。
[0052] 如本文所用的"融合蛋白"是指包含多肽或肽成分的蛋白，该多肽或肽成分来源于 多于一种的亲本多肽或肽。
[0053] 如本文所用的"半衰期延长部分"是指当缀合至OdK2变体时相较于自由肽延长所 得OdK2变体融合蛋白的体内半衰期的分子或蛋白或结构域。
[0054] 如本文所用的"结合百分比"或"结合％ "是指OdK2变体融合蛋白相较于对照的 几何平均荧光强度（Geo. MFI或GMFI)比率，该比率是使用表达Kvl. 3或KvL 1通道的细胞 通过FACS测定获得的。
[0055] 如本文所用的"结合选择性"是指所获得的KvL 3结合％与所获得的KvL 1结合％ 的比率。
[0056] 如本文所用的"选择性的"或"选择性"是指0dK2变体融合蛋白或0dK2变体的 KvL 1的IC5tl值与KvL 3的IC5tl值的比率。选择性可使用多种方法来评估，例如如本文所 述的电生理膜片钳测定或铊通量测定。选择性可根据选择用于测量的测定法而略有差异。
[0057] KvL 3 阻滞肽 0dk2 (SEQ ID NO :1)和 Oskl (SEQ ID NO :2)是 α -KTx3 蝎毒素家族 的成员，两者之间存在九个位置的氨基酸序列差异。0dK2和Oskl都是38个氨基酸长度， 并且各自通过三个二硫键在Cys8_Cys28、Cysl4_Cys33和Cysl8_Cys35之间配对来稳定化 (Abdel-Mottaleb 等人，Toxicon 51 :1424-30, 2008 ;Mouhat 等人，Biochem J. 385 (Pt 1): 95-104, 2005;国际专利公布W02006/002850)。折叠肽形成α螺旋，该螺旋通过二硫键保 持为接近3个成链的反向平行的β片。0dK2和OsKl是孔阻滞剂，通过结合至孔区域的 外孔腔，将赖氨酸27插入水性孔道，并且阻断离子流来抑制通道功能。OsKl ( α -KTx3. 7) 被报道为强效地阻滞KvL 3、KvL 1和KvL 2通道以及适度地阻滞KCa3. 1通道，分别具有 0·014ηΜ、0·6ηΜ、5·4ηΜ和 225nM 的 IC5tl (Mouhat 等人，Biochem J 385 (Pt 1) :95-104, 2005)。 0dK2(a-KTx3.il)被报道为阻滞非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus laevis oocytes)中的 KvL