D NO :423)、食蟹猴（Macaca fascicu/aris)通道 cynoKvL 3 (SEQ ID NO :424)、hKvl. 3/hKvL 5 尾部嵌合体（具有人 KvL 5 氨基酸 1-250 和 497-593,以及KvL 3氨基酸序列251-496 (Kvl. 3尾部嵌合体），以及hKvl. 1/hKvl. 5尾部嵌 合体（具有人KvL 5氨基酸1-250和492-588,以及Kvl. 1氨基酸序列251-491 (Kvl. 1尾部 嵌合体）的那些cDNA。对于HEK细胞中的通道表达，将Kv基因克隆到CMV启动子驱动的 表达载体中，该表达载体编码新霉素抗性标记。使用标准技术将HEK 293-F(Invitrogen， Carlsbad，CA)细胞稳定地转染并在DMEM 10% FBS和600 μ g/ml的Geneticin选择培养基 中培养以产生表达Kv通道的克隆细胞系。
[0201] 对于CHO稳定表达，CHO-TREx细胞（Invitrogen)是使用标准技术以pcDNA4/ TO-KvL X稳定转染的，以便产生以可用四环素诱导的方式表达每个钾通道的克隆细胞系。 培养基是Ham' s F-12,其补充有10%胎牛血清、2mM的L-谷氨酰胺、5 μ g/ml的杀稻瘟菌 素和200 μ g/ml的博莱霉素。在一些实验中，使用在CHO细胞中使用脂质体2000进行的瞬 时转染。对于电生理学实验，使细胞与表达截短的CD4的表达载体共转染，以进行表达控制 (pMACs4. 1，Milteni Biotech)。在转染后24-48小、时时进行测定。
[0202] 蛋白表汰和纯化。
[0203] 将嵌合体文库表达成肽-Fc融合体或肽-HSA融合体。该文库初始是以48孔或 96孔格式在HEK 293-E细胞中转染和表达的。将细胞在DMEMUO% FBS和250 μ g/ml的 Geneticin中培养以进行选择。对于48孔表达，将0. 5ml/孔的3. OX IO5个细胞/ml接 种在48孔培养板中。所述文库使用脂质体2000、使用利用300ng的质粒DNA、25yl的 0ptiPR0?SFM 培养基和 2. 4μ1 的脂质体 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)的常规方法来 转染。在第二天，将转染培养基吸出，并将0. 5ml的293FreeStyleTM培养基（Invitrogen， Carlsbad，CA)添加至每一孔中。随后将细胞再温育96小时，接着收集上清液并使其通过 0· 2 μπι的过滤器（Varian)过滤。
[0204] 对于96孔转染，将细胞以500xg旋转减慢5min，去除上清液，在ZgSFreeStyle ixIt 养基中重悬细胞，以及将所述细胞以在0. 2ml/孔中0. 6X IO6个细胞/ml接种到96孔培养 板中。将该文库以与48孔转染相同的方法转染。
[0205] HEK 293-F细胞被用于所有小规模和中试规模的转染。
[0206] 肽-Fc融合体的小规模表达是使用常规方法，用蛋白A琼脂糖4FF树脂分批纯化 的。简而言之，将20ml的澄清表达上清液与已在pH 7. 2的DPBS中平衡的约0. 5ml的树脂 混合，并且在室温下搅拌不少于1小时。将蛋白A树脂用Iml的pH 7. 2的DPBS洗涤，并且 将结合蛋白用450 μ 1的0.1 M乙酸钠 （pH 3. 0)洗脱，用50 μ 1的2M tris (pH 7. 0)中和， 以及用IxDPBS(pH 7.2)在4°C下透析过夜。
[0207] 中试规模的表达是在AKTA Xpress?色谱系统（GE Healthcare)上亲和纯化的。 在转染后第4天采集来自瞬时转染的HEK293-F细胞的表达上清液，以6000rpm离心澄清， 然后过滤（0. 2 μ m PES膜，Corning，Acton，MA)。肽-Fc融合体的相对含量是通过Octet 仪器（ForteBio)使用加标到消耗性培养基中以产生标准曲线的对照毒素-Fe融合蛋白来 确定的。样本随后用pH 7. O的IOx PBS稀释至pH 7. O的lx PBS的最终浓度，并再次过滤 (0. 2 μ m PES膜）。将经稀释的上清液上样到已用pH 7. 0的PBS在每ml树脂约IOmg蛋 白质的相对浓度下预平衡的HiTrap MabSelect Sure蛋白A柱（GE Healthcare)上。在 上样之后，用pH7. 0的PBS洗涤该柱，以及用10个柱体积的pH 3的0.1 M乙酸钠洗脱蛋 白。该蛋白级份通过以20%级份体积洗脱到包含pH 7的2. OM Tris的试管中而被立即中 和。使用具有IOk MWCO膜的离心超滤装置（Millipore)汇集和浓缩峰值级分。使用AKTA FPLC，使经浓缩的样本通过已在pH7. 0的PBS中平衡并跑柱的Superdex 200 (16/60)柱（GE Healthcare)。通过非还原性的SDS-PAGE分析峰值级分，并汇集包含单体蛋白的级份。蛋 白浓度是通过在BioTek SynergyHT?分光光度计上在280nm和310nm处的吸光度来确定 的。可根据需要，用IOK MWCO离心式浓缩仪（Millipore)浓缩纯化的蛋白。经纯化的蛋白 的品质是通过SDS-PAGE、分析尺寸排阻HPLC(Dionex HPLC系统），以及所测量的内毒素水 平（LAL测定）来评估的。将经纯化的蛋白贮存在4°C下。
[0208] 对于肽-HSA融合体，采集上清液，澄清，以及通过0. 2 μπι过滤器过滤。在上样到预 平衡的ImL HisTrap柱上之前，将IOx DPBS添加至Ix的最终浓度。使用咪唑的不连续梯 度来洗脱蛋白。收集包含融合体的级分，并通过SDS-PAGE进行分析。汇集和浓缩包含所感 兴趣蛋白的级分，以及在Superdex 200 26/60柱上跑柱。同样，收集级分，并通过SDS-PAGE 进行分析。分别汇集包含肽-HSA融合体的单体和二聚体的级分，以获得最终产物。如上文 所述地分析经纯化的蛋白，并将所述蛋白贮存在4°C下。
[0209] 肽融合蛋白言接结合测宙（"结合测宙"）。
[0210] 肽-Fc融合蛋白。所有的细胞培养试剂均购自Invitrogen。将用表达各种Kv 通道的质粒来稳定转染的贴壁HEK 293F细胞在DMEM中培养，该DMEM补充有10% FBS 和600 μ g/ml的Geneticin。Kv通道HEK细胞的单细胞悬浮液是通过以下方式制备的： 用lx PBS冲洗贴壁培养物，随后用0.25 %的胰蛋白酶EDTA冲洗培养物，以及在补充有 2% FBS (FACS缓冲液）的冷lx PBS中重悬细胞至2 X IO6个细胞/ml的最终密度，以及将 100 μ 1/孔分配到96孔V型底的聚丙烯培养板（Costar)中。从此刻开始，步骤是在冰上或 者是在4°C下进行的。将细胞以450xg离心2分钟，然后滗出上清液。将在消耗性Freestyle 293培养基中或在FACS缓冲液中归一化至16nM的100 μ 1的肽-Fe样本添加至指定孔内 的细胞沉淀物中并混合。为了区分特异性结合和非特异性背景，将10倍摩尔过量的合成性 ShK肽（Bachem)添加至阴性对照反应物中，以竞争与肽-Fc融合蛋白的结合。将反应物在 4°C下温育60-90分钟。在200 μ 1的FACS缓冲液中冲洗细胞，以及随后在4°C下用100 μ 1 的山羊Fab' 2抗人Fe Cy5缀合抗体（Jackson ImmunoResearch Inc.)温育细胞1小时， 该抗体已在FACS缓冲液中按1 : 200稀释。在200 μ 1的FACS缓冲液中冲洗细胞，随后用 100μΙ的BD Cytofix?固定缓冲液（BD Biosciences)重悬细胞，然后在4°C下贮存过夜。 在FACSArray 96孔自动采样流式细胞仪（BD Biosciences)上读取反应物。用FloWJo软 件（Treestar)分析数据，以获得各个反应物的几何平均荧光强度（Geo. MFI)。对于初步筛 查结合测定，将每一变体的Geo. MFI直接与瞬时转染的野生型0dk2-Fc融合体（KV1C2)对 照作比较，并且报告为亲本％。
[0211] 肽-HSA融合蛋白。与用于肽-Fc融合体的直接结合测定相同地执行该测定，但是 具有以下区别：细胞被悬浮至IX IO6个细胞/ml的最终密度，然后将100 μ 1/孔分配到96 孔V型底聚丙烯培养板（Costar)中，以及将50 μ 1的肽-HSA融合体样本添加至所述细胞。 使用50 μ 1的山羊抗人HSA生物素缀合物（AbCam产品目录号ab40378)检测HSA融合体， 该山羊抗人HSA生物素缀合物已在FACS缓冲液中按1 : 200稀释至2 μ g/ml并且预混有 链霉抗生物素蛋白-PE缀合物（）。在150 μ 1的FACS缓冲液中冲洗细胞，随后用50 μ 1的 BD Cytofix?固定缓冲液（BD Biosciences)重悬细胞，然后在4°C下温育30分钟。如上文 所述地读取反应物和分析数据。对于初步筛查结合测定，将每一变体的Geo. MFI直接与对 照KV1D261_26融合蛋白（经由GS(G4S)8接头（SEQ ID N0:120)缀合至HSA的肽261)进行 比较并且报告为结合％。
[0212] 竞争件结合测宙（"竞争件结合"）。所有的细胞培养试剂均购自Invitrogen。将 用Kv通道表达构建体稳定转染的贴壁HEK 293F细胞在DMEM中培养，该DMEM补充有10% FBS和600 μ g/ml的Geneticin。Kv通道HEK细胞的单细胞悬浮液是通过以下方式制备 的：用lx PBS冲洗贴壁培养物，随后用0. 25%的胰蛋白酶EDTA冲洗培养物，以及在补充有 2% FBS (FACS缓冲液）的冷lx PBS中重悬细胞至2 X IO6个细胞/ml的最终密度，以及将 100 μ 1/孔分配到96孔V型底的聚丙烯培养板（Costar)中。从此刻开始，步骤是在冰上或 者是在4°C下进行的。将细胞以450xg离心2分钟，然后滗出上清液。将在消耗性Freestyle 293培养基中或在FACS缓冲液中的45 μ 1的肽或肽融合蛋白样本添加至指定孔内的细胞沉 淀物中并混合。将反应物在4°C下温育30分钟。将在细胞培养基或FACS缓冲液中的5 μ 1 的IOOnM抗毒素-2-Cys-TAMRA(Alomone labs)添加到每一孔中，接着混合，然后将反应物 在4°C下温育60分钟。作为冲洗步骤将200 μ 1的FACS缓冲液添加至每孔，以及将细胞以 450xg离心2分钟，然后滗出上清液。用50 μ 1的FACS缓冲液重悬细胞，并且在FACSArray 96孔自动采样流式细胞仪（BD Biosciences)上读取反应物。用FloWJo软件（Treestar)分 析数据，以获得各个反应物的几何平均荧光强度（Geo. MFI或GMFI)。要获得浓度响应曲线， 将跨每一化合物的浓度范围的Geo. MFI值变化用Graphpad Prism绘图，并且使用非线性回 归以及s形剂量响应（可变斜率）曲线得到IC5tl和Ki值。为了计算Ki，为抗毒素-2-Cys-T MRA 指定 0·20ηΜ 的 Kvl. 3KD 值（David Triggle (编辑），Voltage_Gated Ion Channels as Drug Targets，第 29 卷，第 216 页，Tab. 7· 2· 2) 〇
[0213] 铊通量测宙。Kv构建体在G418选择下在HEK293F中稳定地表达。培养基是HyQ DME/高葡萄糖，培养基补充有10% FBS和600 μ g/mL的G418。将细胞按每孔IOK个细胞接 种到涂覆有聚赖氨酸的384孔微量滴定板中，随后在37°C下温育12-36小时。使用测定缓 冲液以及使用Biotek EL405 (4个周期，抽出至25 μ L/孔，随后添加100 μ L/孔）来冲洗细 胞培养板。测定缓冲液包含（单位为mM) :130ηΜ的NaCl、4mM的KCl、2mM的CaCl2UmM的 MgC12、IOmM的HEPES、5mM的葡萄糖。按照制造商的说明将FluxOR染料（Invitrogen)在测 定缓冲液加2mM的丙磺舒中溶解，随后添加至细胞。在室温下于黑暗中对细胞染色30分钟。 随后用测定缓冲液冲洗掉染料。在测定缓冲液加0.2%的牛血清白蛋白（BSA)和2mM的丙 磺舒中制备2X测试浓度的测试化合物。在添加25 μ L/孔的测试化合物溶液之后，将细胞 在室温下于黑暗中温育30分钟。当细胞通过添加20 μ L/孔的刺激缓冲液而被激发时，在 Tetra(Molecular Devices)中监测铊染料荧光。刺激缓冲液包含180mM的HEPES、90mM的 K0H、2mM的CaCl2UmM的MgCl2、5mM的葡萄糖、ImM的Tl2SO 4。在添加所述激动剂后20秒时 测量荧光变化。将数据根据对照孔（N= 16,每一 IOnM ShK用作全抑制对照，并且仅有缓冲 液用作零抑制对照）的平均响应进行归一化。
[0214] T细朐抑制测宙（"T细朐抑制测宙"）。对IL-2分泌的抑制被用作T细胞抑制的 指示。将冻存的经纯化的原代正常人⑶4+和⑶8+T细胞（AllCells LLC)解冻并且在补充 有 1%正常人 A/B 血清（Valley Biomedical Prod&Srv Inc.)的 RPMI 1640(Invitrogen) 中悬浮，最终密度为2X IO6个细胞/ml，并且将100 μ 1的细胞分配到96孔平底组织培养板 (NUNC)中。对于肽-HSA融合蛋白，将经纯化的正常人血清白蛋白（SIGMA)添加至细胞培养 基中，最终浓度为3%，以便在整个浓度响应实验期间维持恒定的HSA浓度。将肽融合蛋白 和对照在细胞培养基中稀释，以及将50 μ 1/孔添加至T细胞培养物中，然后在37°C /5% CO2下温育30分钟。使用在细胞培养基中按I : 1的珠比细胞的比率稀释的抗人⑶3/⑶28T细 胞扩增珠 （Miltenyi Biotec)活化T细胞。将培养物在37°C /5% 0)2下温育约16小时，然 后将上清液采集到96孔V底聚丙烯培养板（Costar)上，以及通过离心澄清。通过采用人 IL-2Quantikine试剂盒（RnD Sytems)的化学发光免疫测定法分析澄清上清液的IL-2水 平。用Graphpad Prism绘制最终IL-2水平，并且使用非线性回归以及s形剂量响应（可 变斜率）曲线拟合得到IC5tl值。一些实验是在单点5nM、IOOnM或250nM的肽融合蛋白浓度 处进行的。
[0215] 破伤风类毒素（TTX) T细朐测宙〇人PBMC是从接种破伤风类毒素疫苗的健康供体 血液中通过使用Ficoll Pague (GE Healthcare Life Science)的不连续梯度离心纯化的。 在96孔平底培养板中用3 μ g/ml的破伤风类毒素（Univ. of Massachusetts Biologic) 在RPMI培养基中刺激IO6个细胞/孔的PBMC达3天，所述RPMI培养基补充有2%的人血 清、2mM的谷氨酰胺、ImM的丙酮酸钠、IOmM的HEPESUmM的MEM非必需氨基酸溶液，以及 各lOOU/ml的青霉素 G和链霉素 （Life Technologies)。在培养的第2天收集培养物上清 液，以及通过用IuCi/孔的3H-胸苷（Perkin Elmer)脉冲过夜来测量细胞增殖。将结合有 放射性胸苷的增殖细胞采集到玻璃纤维过滤板（Perkin Elmer)上，浸泡在闪烁体（Perkin Elmer)中以使用Topcount (Packard)对放射性活度进行计数。使用MSD检测技术（Meso Scale Discovery)来测量上清液中的细胞因子。
[0216] 电牛理学。将经转染的CHO或HEK细胞、CD4+或CD8 +T细胞用于电生理学中。将 细胞以低密度接种到玻璃盖玻片上。在实验的那天，将玻璃盖玻片放置到倒置显微镜的载 物台上的浴槽中，并且用含以下成分的细胞外溶液灌流（大约Iml/分钟）：137mM的NaCl、 2mM的CaCl2、5·4mM的KCl、lmM的MgCl2、5mM的葡萄糖，以及10mM的HEPES，0·l%牛血清 白蛋白，pH为7. 4。移液管填充有包含以下成分的细胞内溶液：40mM的KC1、IOOmM的KF、 2mM 的 MgCl2UOmM 的 EGTAUOmM 的 HEPES，pH 为 7. 3 至 7. 4,并且具有 2 至 4ΜΩ 的电阻。 所有的记录是使用Multiclamp 700A放大器和pClamp 9软件（Axon Instruments)在室 温（22-24°C )下进行的。瞬时转染的CHO细胞是使用涂覆有抗CD4的微珠（Dynabeads， InVitrogen)来鉴定的。外向钾电流是使用膜片钳技术的全细胞配置在从-80mV的细胞钳 制电位至20-40mV的测试电位处测量的。液体接界电势被计算为在20°C时为7. lmV，并且 电压命令未经校正。在2-5KHz处获得电流记录，并且在l-2KHz处对其滤波。每隔20s读 出电流一次，并且在记录之前使所述电流稳定5-10分钟。使用SF-77B快速步进程控灌流 装置（Warner Instruments)施加化合物。对每种细胞测试化合物的1-4种浓度。
[0217] 数据分析:
[0218] 浓度响应数据或剂量响应数据是通过非线性回归（Graph Pad Prism，第4· 0版）， 使用以下的四参数广义逻辑斯谛方程拟合的：
[0219]
[0220] 效能被表达为产生50%的最大效应（pIC5Q或pEC 5Q)的浓度的-log 10。
[0221] 肽合成。Fmoc-Lys(Boc)-Wang 树脂（0· 47mmol/g 的取代）可购自 Peptide International，而伪腫氨酸二肽，即 Fmoc-Ile-Ser (ΨΜθΜθ pro)-OH 可购自 Novabiochem。 所有其他的氨基酸可购自Applied Biosystems(ABI)或Anaspec。用于自动固相肽合 成（SPPS)的试剂可购自ABI。化学合成所需的其他试剂购自Sigma/Aldrich。肽合成在 Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂（222mg，0.1 (Mmmol)上通过使用ABI 433A型自动化肽合成仪 的SPPS进行。根据制造商的协议来使用用于HBTU/HOBt/DIEA活化的标准0. Ι-mmol标度 的 FastMoc MonPrevPeak 协议。将伪腫氛酸二狀，即 Fmoc-Ile-Ser (ΨΜεΜε pro)-OH 结合到 在序列 GVPINVKCKISRQCIEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-树脂（SEQ ID N0:42)中以粗体和下 划线示出的位置处。氨基酸侧链官能团是如下保护的：Arg(Pme)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、 Cys (Trt)、Glu (OtBu)、Gln (Trt)、Lys (Boc)、Ser (tBu)和 Thr (tBu)。
[0222] 在环境温度下，在（TFA(20mL)、苯酚（1.5g)、l，2-乙二硫醇（4. OmL)、苯甲硫醚 (LOmL)、水（LOmL)和三异丙基硅烷（LOmL))中从树脂裂解肽达六小时。通过过滤移除 树脂，并且用额外的TFA(2mL)冲洗该树脂。合并滤液，以及将肽用预冷的乙醚（400mL)沉 淀。通过过滤分离肽，用二乙醚冲洗肽，以及真空干燥得到370.0 mg的粗制直链产物：(GVPI NVKCKISRQCIEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK;SEQ ID N0:42)。在环境温度下，将粗制直链肽以 100 μ g/mL 的肽浓度在 0· IM 的 Tris-HCUL OM 的胍-HCL、L OmM 的 EDTA、3. OmM 的还原型 谷胱甘肽和0. 3mM的氧化型谷胱甘肽中氧化。在25小时后通过逐滴添加冰醋酸将pH降低 至3.9来终止反应，以及冷冻和冻干所述肽。通过￥7(1&(3(：-181^-即^：来纯化粗制肽。分 析性RP-HPLC、毛细管电泳和LC/MC确定了纯度和分子量。
[0223] 实例 1
[0224] 野牛塑0dK2和OsKl肽及其融合蛋白的表征
[0225] 将野生型0dK2(SEQ ID NO :1)和0sKl(SEQ ID NO :2)肽使用常规和如本文所述的 方法，使用接头GS (G4S) 4(SEQ ID NO: 119)克隆和表达为IgG4 Fc融合蛋白。所得的融合蛋 白分别被命名为KV1C2 (0dK2-Fc融合体）和KV1N2 (OsKl-Fc融合体）。天然0dK2肽是从伊 朗黄蝎（Iranian scorpion Odonthobuthus)的毒液