β-己糖基转移酶及其应用
【专利说明】
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求Bruno-Barcena等人于2012年12月7日提交的美国临时申请 61/734, 742的优先权，名称为" β -己糖基转移酶及其应用"，律师卷号为NS12009USV，其全 部内容通过引用合并于此。 1.
技术领域
[0003] 本申请总体上涉及发现了 β-己糖基-转移酶（BHT)的一种新型重组形式及其用 于生产低聚半乳糖（GOS)的用途。 2.
【背景技术】
[0004] 2. 1 介绍
[0005] 饮食、正常肠道微生物群和健康之间的复杂相互作用促使人们开发改善有益微生 物在人体胃肠道中的选择性增殖的策略。由于其具有强大的抗病原菌和抗炎性质，因而益 生菌是积极影响人类健康的微生物（27)(表1)。
[0006] 表1.益生菌的健康益处
[0007]
[0008] 而且，多年的益生菌研宄表明，肠道微生物群的选择性改性及其相关的生物化 学活性能够通过选择性益生元来得到改善。Osborn DA, Sinn JK.益生元在婴儿中针对 变应性疾病和食物超敏反应的预防进行了研宄。Cochrane Database of Systematic RevieWS2007。益生元是具有双重功能的不易消化的低聚糖（NDO)。其一是其降低有害细菌 的肠道定植效率，其二是其起到选择性底物的作用以促进生长并从而增加特定益生菌的数 目。
[0009] 另外，越来越多的研宄已经显示出，当与益生元组合时，益生菌的效果最好。Mayer 等人2003关于具有双歧杆菌的功能性食品的制造的研宄。Acta Alimentaria 3227-39。这 种组合形式的递送被称为合生元（synbiotic)。Gibson GR, Roberfroid MB. 19%Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota-Introducing the Concept of Prebiotics. Journal of Nutrition 125:1401_12〇
[0010] 低聚半乳糖（GOS)被认为是益生元的优选选择之一，并且在胃肠道中GOS是耐酶 降解的且通过小肠运送而不会被消化，但在大肠中GOS被发酵并且能够激活肠道双歧杆菌 的生长例如嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus)和干酪乳酸杆菌（L.casei)，因而 起到益生菌的作用（26, 27, 37)。
[0011] GOS是不易消化的低聚糖，由于其异头C原子（Cl或C2)的构造体，使得其糖 苷键避免被胃或小肠中的消化酶水解。在所有胎盘哺乳动物的乳汁中发现了游离低聚 糖，其提供了在婴儿期中提供益生菌的天然实例。根据国际益生菌和益生素科学委员会 (International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics，I SAPP)的 最新定义，"膳食益生菌是使得胃肠道微生物群的组成和/或活性发生特定改变从而为宿 主健康提供益处的选择性发酵的成分"（30)。人乳低聚糖（HMO)的组成非常复杂，这使得 不太可能找到类似组合物的含低聚糖的可替代来源。母乳喂养的婴儿中改善的结肠健康 归因于母乳中存在G0S(2)。事实上，添加了 GOS的婴儿配方食品复制了人乳的双歧效应 (bifidogenic effect)，其与结肠微生物群的代谢活性和细菌数目有关（6,21)。在非-乳 低聚糖中GOS具有特殊的益处，因为其结构类似于HMO的核心分子（3)。然而，GOS浓度和 组成随其产生时所施用的方法和酶而不同，这又会影响其益生菌效应和结肠益生菌菌株的 增殖（29)。传统上，GOS是利用β-半乳糖苷酶由嗜维微生物生产的。嗜温β-半乳糖苷 酶需要较高的乳糖初始浓度来驱动反应远离乳糖水解并朝向GOS合成。由于乳糖在高温下 的可溶性更好，因此耐热的β -半乳糖苷酶显示出较高的初始速度并且利用增加的半衰期 以达到半乳糖基转移反应（transgalactosylation reaction)的有利平衡（27, 37)。然而， 葡萄糖和/或半乳糖引起的竞争性抑制是仍然存在的另一个障碍，其可通过在反应中结合 细胞而得到克服（16, 20, 25, 27, 35)。
[0012] 担子菌类酵母独特掷孢酵母（formerly Bullera singularis)不能利用半乳糖 来生长，而是由于其β-己糖基-转移酶（BHT，EC 3.2. 1.21)活性在乳糖上繁殖。研宄已 经显示，BHT甚至是在低乳糖浓度和非常有限的乳糖水解条件下也具有半乳糖基转移活性。 另外，该酶似乎不受到高于20%乳糖浓度的抑制，并且具有以接近最大理论值75%转化为 GOS的潜力（1，9, 10, 28)。与β-半乳糖苷酶不同，来自独特掷抱酵母的BHT同时执行糖 基-水解酶和β -己糖基-转移酶活性，将乳糖转化为GOS而没有细胞外半乳糖累积。在 半乳糖基转移事件中需要两种分子的乳糖：一种分子被水解而第二种分子起到半乳糖受 体的作用，产生三糖半乳糖基-乳糖（β-D-Gal (1-4)-β-D-Gal (1-4)-β-D-Glc)和残余 葡萄糖。半乳糖基-乳糖能够起到新的半乳糖的受体的作用，以产生四糖半乳糖基半乳糖 基-乳糖（β -D-Gal (1-4) - β -D-Gal (1-4) - β -D-Gal (1-4) - β -D-Glc)，并且对于四糖和 随后的产物而言也是相似的。在独特掷孢酵母中累积的三糖、四糖和五糖已全体被命名为 GOS(9, 10)〇
[0013] 出于实际利益，重组分泌的BHT相对于天然酶能够具有若干优点，包括改进的大 规模生产和纯化。目前，来自独特掷孢酵母的活性酶的纯化要求细胞裂解，之后还需要多个 层析步骤（1，4, 16)。之前尝试在大肠杆菌BL21中表达重组β -己糖基-转移酶已经得到 了高水平的生产，但该酶是无活性的且不可溶的（16)。 3.
【发明内容】
[0014] 在特定的非限制性实施方式中，本发明提供了编码具有SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、 12、14、16、18或20中列出的氨基酸序列的重组β-己糖基-转移酶（rBHT)蛋白的分离的 DNA。该编码重组β-己糖基-转移酶（rBHT)蛋白的分离的DNA可以具有SEQ ID NO. 1、3、 5、7、9、11、13、15、17或19中列出的核酸序列。
[0015] 本发明还提供了酶活性重组β-己糖基-转移酶（rBHT)蛋白，其中该蛋白具有 SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中列出的氨基酸序列。该池!11'蛋白可以是膜结 合的或可以是可溶性酶。
[0016] 产生GOS的酶活性rBHT可以被半乳糖抑制或可以不被半乳糖抑制。
[0017] 本发明还提供了用于在真核宿主细胞中生产酶活性重组己糖基-转移酶 (rBHT)蛋白的方法，包括用在适合的启动子的控制下的质粒转化所述真核宿主细胞，其中 该质粒含有编码rBHT蛋白的分离的DNA，所述rBHT蛋白具有SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12、 14、16、18或20中列出的氨基酸序列。
[0018] 在一些实施方式中，分离的DNA连接于编码信号肽的DNA。信号肽可以是啤酒酵母 (S. cerevisiae) α -因子信号肽且适合的启动子可以是乙醇氧化酶启动子。
[0019] 在一些实施方式中，酶活性rBHT蛋白在20°C具有约8U. mg-1的比活性。
[0020] 真核宿主细胞可以是酵母细胞，例如毕赤酵母（Pichia. pastoris)。
[0021] 本发明还提供了用于生产低聚半乳糖（GOS)的方法，包括在适合的条件下使乳 糖与具有SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中列出的氨基酸序列的酶活性重组 β -己糖基-转移酶（rBHT)蛋白反应，以产生G0S。
[0022] 该酶活性rBHT蛋白可以被固定在固体支持物上。该固体支持物可以位于分批或 连续的搅拌罐式反应器、填充床反应器或超滤膜反应器中。或者，该酶活性rBHT蛋白可以 在分批或连续的搅拌罐式反应器、填充床反应器或超滤膜反应器中直接使用。该方法可以 进一步包括葡萄糖清除系统以避免竞争性葡萄糖抑制，如通常被认为安全的（GRAS)生物 体。该葡萄糖清除系统可以与酶活性rBHT蛋白同时使用。
[0023] 本发明还涉及包含具有SEQ ID NO. 2、4、6、8、10、12、14、16、18或20中列出的氨基 酸序列的重组β-己糖基-转移酶（rBHT)蛋白的改良的含乳糖食品或食品副产物。含乳 糖食品或食品副广物可以是乳制品或副广物，例如乳清。在一些实施方式中，食品或食品副 产物为婴幼儿甜点、婴幼儿果汁、婴幼儿零食、婴幼儿酸奶饮品、能量饮料、健身饮用水或解 渴饮品、冷冻含乳甜品、果味饮料（维生素/矿物质强化）、水果派馅料、水果制品、婴儿配方 食品、婴儿代餐饮品、果酱、代餐饮品、乳品、乳基饮料、乳替代品、为乳品增加风味的糖浆、 酸奶、或乳清。 4.【附图说明】
[0024] 图1A-1C.在毕赤酵母中表达的纯化的rBHT的凝胶电泳。（IA)银染色的纯化的 rBHT 的 SDS-PAGE :泳道 1，0· 5 μ g rBHT ;泳道 2,0· 1 μ g rBHT。（IB)具有抗-rBHT 抗血清 的Western印迹分析。泳道M表示标志物蛋白的分子量（kDa)，其在图A的右侧示出。（1C) rBHT的酶谱。泳道1，在大肠杆菌BLR培养物中表达的纯化的rBHT-6XHIS ;泳道2,来自未 转化的甲醇诱导的GS115的肉汤培养基；泳道3,来自甲醇诱导的重组GS115/rBHT的肉汤 培养基。通过由于X-GAL的酶切造成的蓝色沉淀的形成来表现活性。
[0025] 图2A至2D.根据（2A)pH ; (2B) 20°C至80°C的温度；（2C)半乳糖（实心圆形）和 葡萄糖（实心方形）浓度；（2D)在20°C至50°C的热稳定性的rBHT相对活性。每12小时 取出样品并在20°C对活性进行分析。除了（A)使用磷酸钠 （pH 5至11)或柠檬酸钠 （pH 2 至5)缓冲液之外，在含有I. 3mM ONP-Glu的50mM磷酸钠 （pH 5. 0)中在20°C下进行酶活 性分析。相对于在时间为零（100%)时获得的值计算酶活性。待测酶的初始浓度为0.2U. πιΓ1，在20°C (Km=0. 37mM和Vmax=0.09mM. min4)下进行分析。数据表示可靠性为±5% 的两次实验的平均值。
[0026] 图3.在5mM磷酸钠缓冲液中（pH 5. 0)利用部分纯化的rBHT (0· 5U. g-1乳糖）由 乳糖（2 % )合成半乳糖基-乳糖，在42°C下孵育。乳糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖基-乳糖 的浓度以g.r1表示。残余的未量化GOS物质作为折射率检测器的信号强度读数示出。数 据表示可靠性为±5%的两次实验的平均值。
[0027] 图4A至4B.在5mM磷酸钠缓冲液中（pH 5. 0)利用毕赤酵母静止细胞（在0· 5U. 乳糖条件下包藏膜结合rBHT)由乳糖（20%)合成低聚半乳糖，在42°C (4A)或30°C (4B) 下孵育。乳糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖基-乳糖的浓度以g.r1表示。残余的未量化GOS 物质作为折射率检测器的信号强度读数示出。数据表示可靠性为±5%的两次实验的平均 值。
[0028] 图5.示出了在30°C下包括由本文中描述的rBHT产生的G0S(G0S NCSU)和两种可 商购获得的酶 Vivinal GOS 和Oligomate 55NP(购自 Yakalt Pharmaceuticals, Inc.)产 生的GOS的糖和酶活性的比较。参见第6. 3节中所述的程序。
[0029] 图6A-6B. BHT的Kyte和Doolittle亲水性图。对预测的膜锚着点/信号序列的氨 基酸序列进行扩增。跨膜区预测算法（www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html) 还预示BHT中对完整穿膜蛋白来说典型的一段疏水残基1-17,且SignalP算法（www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)预示着对于相同残基的可能的信号序列以及残基17和18之 间和残基22和23的可能的剪切位点。在构造体1，2, 3, 4and 7中保留信号序列以起到天 然膜锚着点的作用。
[0030] 图7A至7C. BHT的序列分析。（7A)来自独特掷孢酵母的BHT多肽的图示，其是 通过基于网络的SMART程序（http://smart.embl-heidelberg.de)来确定的。由实心方 形表示的先导肽是通过SignalP程序确定的。由实心圆形表示的低组合复杂性的部分是 通过 SEG 程序（ http://mendel.imp.ac.at/METHODS/seg.server.html)来确定的。仅通 过BLAST发现的中签物（hits)由甘油水解酶结构域表示。实心三角形表示通过NetNGlyc I. 0(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/)确定的三个推定的 N-糖基化位点的 位置。（7B)通过RHYTHM跨膜预测方法计算的先导肽的图示。已对预测的膜锚着点序列的 氨基酸序列进行扩增。膜接触氨基酸以大号黑体字表示，螺旋接触氨基酸以大号字体表示 并加下划线。还示出了预测的胞质区和胞外区的位置。箭头指示可能的剪切位点。（7C)亲 水性图。利用在九个氨基酸的窗口长度上计算亲水性的Kyte-Doolittle方法来产生该图。 在X-轴下方示出了氨基酸的数目。Y-轴上的零将疏水性和亲水性氨基酸分离。
[0031] 图8A至8D.每一重组毕赤酵母菌株分泌的蛋白的浓度。在点图的左侧（8A))和 右侧（8D)分别示出了含有rBht和scFvl3R4的重组菌株的图示。（8B)分泌rBHT-HIS的。 (8C)分泌ScFvl3R4-HIS的。分泌蛋白的值被归一化用于OD6tltl并且表示为平均值土SE。 分析由以下的重组菌株分泌的蛋白：（8A和8B)第1行，GS115: : aMF-rBht((23_594)-HIS ;第 2 行，GS115: :rBht-HIS ;第 3 行，GS115: :rBht(23_594厂HIS ;第 4 行，GS115: : a MF-rBht-HIS。 (8(：和80)第1行，65115::(1]\^-8。卩￥131?4-!115;第2行，65115::沖吐( 1_11(|厂8。卩￥131?4-!115;第 3 行，GS115: :rBht(23_11Q)-scFvl3R4-HIS ;第 4 行，GS115: :scFvl3R4-HIS。
[0032] 图9A至9C.显示出抗-His抗血清的SDS-PAGE(8% )分离和Western印迹，其显 示出由不同毕赤酵母GS115重组体表达的分泌的、细胞相关的或纯化的rBHT-HIS。（9A) 将通过所有重组体产生的蛋白无细胞提取物（分泌的蛋白）浓缩20倍。（9B)由在IX Laemmli缓冲液中用玻璃珠破坏的五个0D_重组细胞获得的细胞相关的蛋白。泳道1， GS115: : a MF-rBht-HIS ;泳道 2, GS115: : a MF-rBht(23_594厂HIS ;泳道 3, GS115: :rBht-HIS ; 泳道4，GS115: :rBht(23_594)-HIS ;和泳道5，GS115对照。（9C)由利用镍亲和层析纯化并溶解 于 SDS-PAGE(8% )的 GS115: : a MF-rBht(23_594)-HIS 表达的 rBHT-HIS 的银染色。M 表示标 志物泳道。在图的左侧示出了标志物蛋白的分子量（kDa)。
[0033] 图IOA至10B.利用可溶性rBHT或含有膜结合rBHT (0. 5U rBHT. g-1乳糖）的毕赤 酵母静止细胞进行半乳糖基-乳糖合成的时程。（IOA)通过由GS115:: aMF-rBht(23_594)-HIS 表达的分泌的rBHT-HIS(实线）和由GS115: : aMF-rBht(23_594)表达的rBHT(虚线）的合成。 (IOB)通过静止细胞 GS115: : a MF-rBht(23_594厂HIS(实心方形）和 GS115: : a MF-rBht(23_594) (空心方形）合成半乳糖基-乳糖的速率。在30°C孵育在5mM磷酸钠缓冲液（pH 5. 0)中 含有200g. Γ1乳糖和纯化的酶或毕赤酵母静止细胞的测试。周期性取出样品并通过HPLC 进行分析。乳糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖基-乳糖的浓度以g.P表示。残余的未量化GOS 物质表示为折射率检测器的信号强度读数。数据代表两次独立实验的平均值。 5.【具体实施方式】
[0034] 本发明报告了用于表达独特掷孢酵母BHT的若干种方法，包括，但不限于，利用在 毕赤酵母中表达的密码子最优化的、在毕赤酵母中表达的合成的rBht基因（GenBank登录 号JF29828)的方法。我们研宄了通过分泌的重组β-己糖基-转移酶（rBHT)由乳糖产生 GOS的动力学，并与包藏膜结合rBHT的毕赤酵母静止细胞进行了比较。
[0035] "rBHT蛋白"在本文中是指包括全长rBHT蛋白以及其片段和/或变体，其奥阔由 天然存在的rBHT基因的等位基因变体编码的蛋白，以及重组产生的rBHT蛋白，相对于天然 存在的rBHT蛋白其可以含有一些序列变化。
[0036] "重组体"蛋白是由基因工程技术产生的蛋白。术语"基因工程"是指用于产生细 胞的重组DNA或核酸方法，该细胞以升高的水平或降低的惠普表达基因，或表达基因的突 变体形式。换言之，已用重组多核苷酸分子对细胞进行转染、转化或转导，并从而使细胞发 生改变以使得细胞对于期望多肽的表达发生改变。
[0037] "低聚半乳糖"或"G0S"意指具有两个或更多个糖单元例如Gal-Gal或
[0038] [Gal]n_Glc(l < η < 8)的含半乳糖的多糖，包括
[0039] β -D-Gal (1 - 4) - β -D-Gal (1 - 4) - β -D-Glc、
[0040] β -D-Gal (I - 4) - β -D-Gal (I - 4) - β -D-Gal (I - 4) - β -D-Glc 和
[0041] β -D-Gal (1 - 4) - β -D-Gal (1 - 4) - β -D-Gal (1 - 4) - β -D-Gal (1 - 4) - β -D-G Ic0
[0042] 5· 1信号序列
[0043] 可溶性分泌的蛋白和在细胞表面上表达的蛋白通常包含N-端"信号序列"，其是 在真核细胞中介导蛋白穿过膜结合内质网（ER)的插入的疏水序列。1型跨膜蛋白还包含 信号序列。"信号序列"在本文中意指氨基端疏水序列。其通常酶除去以下部分或全部蛋 白的插入穿过ER膜进入到ER腔中。因此，本领域中已知信号序列能够作为分泌的跨膜蛋 白的前体形式的部分存在，但通常会缺少该蛋白的突变体形式。当提到蛋白包含信号序列 时，应该理解，尽管该蛋白的前体形式不含有信号序列，但该蛋白的突变体形式有可能不含 有该信号序列。信号序列可以含有邻近于且位于剪切位点（位置-1)上游的残基和位于 位置-3的其他残基，其对于这种酶促剪切而言是很重要的。Nielsen等人1997Protein Eng 10(1)1-6 ；von Heijne 1983Eur J Biochem 133 (I)7-21 ；von Heijne 1985J Mol Biol 18499-105,将描述了信号序列和如何鉴定它们的部分结合于此作为参考。能够通过 Nielsen等人（同上）的描述来鉴定信号序列。在哺乳动物宿主细胞中具有功能性的信号肽 或序列的实例包括以下：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)pre-pro_a-交配因子信 号序列；113专利4,965，195中描述的白介素-7(11^-7)的信号序列：(]〇81]^11等人1984似1：11^ 312768-771描述的白介素-2受体的信号序列；EP专利0367566中描述的白介素-4受体信 号肽；US专利4, 968, 607中描述的1型白介素-1受体信号序列；EP专利0460846中描述的 II型白介素-1受体信号肽。许多其他的信号序列是本领域已知的。
[0044] 5.2rBHT 蛋白
[0045] 本发明包括分泌的、可溶性形式的rBHT，以及能够在细胞表面上表达的包含跨膜 结构域的形式。这样的蛋白能够被分离，即，作为纯化蛋白制备的一部分，其中rBHT蛋白构 成制备过程中存在的蛋白的至少80%或至少90%。本发明进一步包括由以下所述的rBHT 核酸编码的rBHT蛋白。如本文中所述的，rBHT蛋白包括包含SEQ ID NO. 2、4、6, 8、10、12、 14、16、18或20及其片段、衍生物和变体的蛋白的氨基酸序列，包括，融合蛋白。SEQ ID NO. 2、4、6, 8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列包括信号序列。
[0046] 5. 3保守置换
[0047] 在一些实施方式中，置换可以是保守氨基酸置换。不太可能影响氨基酸活性的保 守氨基酸置换的实例包括如下置换：用丙氨酸置换丝氨酸、用缬氨酸置换异亮氨酸、用天 冬氨酸盐/酯置换谷氨酸盐/酯、用苏氨酸置换丝氨酸、用丙氨酸置换甘氨酸、用丙氨酸置 换苏氨酸、用丝氨酸置换天门冬酰胺、用丙氨酸置换缬氨酸、用丝氨酸置换甘氨酸、用酪氨 酸置换苯基丙氨酸、用丙氨酸置换脯氨酸、用赖氨酸置换精氨酸、用天冬氨酸盐/酯置换天 门冬酰胺、用亮氨酸置换异亮氨酸、用亮氨酸置换缬氨酸、用丙氨酸置换谷氨酸盐/酯、用 天冬氨酸盐/酯置换甘氨酸，以及用这些变化的反向置换。参见例如，Neurath等人，The proteins, Academic Press, New York (1979)，其相关部分结合于本文作为参考。