寡糖的大规模酶合成的方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种UDP-Gal再生的方法及其与半乳糖基转移酶的组合使用，将半乳 糖添加至适当的受体底物。本发明进一步揭露大规模生产Globo系列寡糖的合成方法，其 中该方法可涉及糖基转移酶反应与核苷酸糖再生方法的组合。
【背景技术】
[0002] Globo 五糖（Globopentaose (Gb5))、岩藻糖 _Gb5 (Globo H)及唾液酸 _Gb5 (SSEA4) 是Globo系列的鞘糖脂（glycosphingolipid)，其是于1983年首次在经培养人类畸胎癌细 胞株中被发现 [1]，其后陆续在数种恶性肿瘤中被发现[2'3]。报告显示，在乳癌患者身上Globo H的过度表达高达61%，Gb5的过度表达达77. 5%及SSEA4的过度表达达95%。[4]另一方 面，基因 HER2 (治疗性单株抗体Trastuzumab (Herceptin)的标祀，会干扰HER2/neu受体） 在乳癌患者身上的过度表达仅达25%。[5]此比较清楚显示鞘糖脂抗原（Gb5及其衍生物， Globo H及SSEA4)乃作为发展癌症疫苗的更佳选择。因此，目前在一些国家已将Globo H 共轭至血蓝蛋白（KLH)作为癌症疫苗，并已进入第三期临床试验。[6]
[0003] 现行用来合成Gb5、Globo H及SSEA4的方法存在一些缺点。传统化学合成法过于 繁琐且费力，需要一些保护及去保护步骤才能获得高纯度及正确的型式，因此往往导致产 量极低。迄今虽有诸多关于化学合成Globo H的相关报告。[7][8][9][1°][11][12][13][14]然而，仅有 两篇报告是关于SSEA4的合成。Hsu等人发表1锅法（one-pot)化学合成法来制备SSEA-4 的多糖部分，其产率为24% [15]Zhen等人发表利用化学酶方法合成毫克规模的SSEA-4。[16] 另一方面，基于Leloir-type糖基转移酶的酶性合成Globo H仅需将活化核苷酸糖为供体 来催化糖化反应。然而，糖核苷酸成本过高，不适合大规模的合成。再者，副产物焦糖酸 盐（pyrophosphate)及核苷二磷酸盐（nucleoside diphosphate)会抑制焦糖酸化酶及 Leloir-type糖基转移酶在核苷酸糖的形成；因此，需要发展新的再生方法以克服现行技 术的限制，并且可将核苷酸再充电来达到核苷酸糖产物的构建，进而使反应继续进行。过去 数年间，有许多团队致力于解决糖核苷酸再生的主要问题，且大部分有关糖核苷酸再生的 问题已获得解决。然而，关于糖核苷酸再生的技术仍有进步改善的空间，特别在于UDP-Gal 的再生非常困难。例如，UDP-Gal的再生首次于1982年由Wong以及Whiteside所提出，通过 UDP-Glc C4表异构酶（印imerase)来将UDP-Glc与UDP-Gal交互转换（[17])。十年过后，本 发明团队发展出二级UDP-Gal再生方法。其并不使用UDP-Glc C4表异构酶，而是利用位于 大肠杆菌乳糖操纵子中的Glc-I-磷酸尿苷酰转移酶（uridylyltransferase)将Gal-I-磷 酸盐及UDP-Glc交换为Glc-I-磷酸盐及UDP-Gal。 [18]然而，在缺少适合的酶下，最后直接 将UTP及Gal-I-磷酸盐缩合形成UDP-Gal的步骤确无法完成。由于目标化合物Gb5、Globo H及SSEA4为Gal有关分子，故如何克服UDP-Gal再生的主要困难并增加其效率即为大规模 酶合成Gb5、Globo H及SSEA4的关键。
[0004] 综上所述，现行大规模合成Gb5、Globo H及SSEA4的方法仍存在诸多限制。因此， 仍需要提供一种新颖的合成方法，以更有效率地制备Gb5、Globo H、SSEA4及其中间物。
【发明内容】
[0005] 本发明是关于一种核苷酸糖再生的方法及其于糖类合成的应用。该糖类合成方法 涉及至少一种核苷酸糖再生系统（例如本文所描述的UDP-Gal再生系统）与至少一种糖 基转移酶（例如半乳糖基转移酶）的组合，且该糖类合成方法以不可预期的高效率被用于 合成各种寡糖（尾式（tailed))，包括丙烯基-尾式Gb3、Gb4、Gb5 (也被称为SSEA3)、岩藻 糖-Gb5 (也被称为Globo H)及唾液酸-Gb5 (也被称为SSEA4)。更具体的，本发明的合成方 法允许链式反应生成诸如Globo H及SSEA4等终产物，而无纯化中间物的必要。
[0006] 因此，本发明的一个方面是关于一种将半乳糖残基通过连结半乳糖转移酶与 UDP-Gal再生方法的反应添加至底物中的方法。该方法包括：（i)在UDP-Gal再生酶组存在 下，自半乳糖生成UDP-Gal，其中该UDP-Gal再生酶组包含半乳糖激酶、UDP-糖焦磷酸化酶 (UDP-sugar pyrophosphoryIase)、丙酮酸激酶及视需要的焦磷酸化酶；（ii)将UDP-Gal与 底物分子（例如多糖、寡糖、糖蛋白、糖脂或配糖基（aglycone))通过半乳糖转移酶（例如 α 1，4-半乳糖转移酶、β 1，4-半乳糖转移酶、α 1，3-半乳糖转移酶或β 1，3-半乳糖转移 酶）进行反应，在该底物分子上添加半乳糖残基；及视需要（iii)分离所生成的半乳糖化产 物。步骤（i)及（ii)可在一包含该UDP-Gal再生酶组、该半乳糖转移酶、该底物分子、半乳 糖、ATP及UTP的反应混合物中进行。在某些实施例中，该底物分子为神经酰胺或鞘糖脂。
[0007] 本发明的另一个方面是关于合成寡糖的方法，其是涉及至少一种核苷酸糖再生方 法（例如UDP-Gal再生）及至少一种通过糖基转移酶（例如半乳糖转移酶、岩藻糖转移酶、 唾液酸转移酶或N-乙酰半乳糖胺转移酶）的活性将单糖（例如半乳糖（Gal)、N-乙酰半乳 糖胺（GalNAc)、岩藻糖（Fuc)及唾液酸（Neu5Ac))添加至合适的受体的反应。
[0008] 在某些实施例中，本发明方法是利用乳糖（例如尾式）作为起始物，以酶性方式合 成寡糖。该方法包括：（i)在M)P-Gal再生酶组的存在下，自半乳糖生成UDP-Gal，其中该 UDP-Gal再生酶组包含半乳糖激酶（例如来自大肠杆菌）、UDP-糖焦磷酸化酶（例如来自 拟南芥（A. thaliana))、丙酮酸激酶（例如来自大肠杆菌）及视需要的焦磷酸化酶（例如来 自大肠杆菌）；（ii)在M)P-Gal及α-1，4半乳糖转移酶（例如LgtC(诸如来自脑膜炎双球 菌（N. meningitides))存在下，将Lac-〇R1A转换为Gb3-0R1A，其中R ia为氢、经取代或未经取 代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的环碳 基（carbocyclyl)、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经 取代的杂芳基或氧保护基团。
[0009] Ria的实施例包括，但不限于氢、丙烯基、生物素、神经酰胺、或非氢基团（如烷基）， 其是进一步被经取代或未经取代的硫、经取代或未经取代的氨基、羰基（例如，羧酸）、迭 氮、烯基（例如，丙烯基）、炔基（例如，丙炔基）、生物素或神经酰胺所取代。某些特定的实 施例中，R ia是氢、丙烯基、经取代的烷基、生物素或神经酰胺。
[0010] 如需要，Gb3-0R1A可自反应混合物中分离。
[0011] 步骤（i)及（ii)可在Gb3-合成反应混合物中进行，该Gb3-合成反应混合物包括 半乳糖、PEP、ATP、UTP、Lac-0R 1A、α-l，4-半乳糖转移酶及UDP-Gal再生酶组。一实施例中， 在任何酶反应发生前，Lac-〇R1A与半乳糖在Gb3-合成反应混合物中的摩尔比为1 :1。
[0012] 上述任一方法可进一步包括：（iii)在UDP-GalNAc及β -1，3-N-乙酰半乳糖胺转 移酶（例如LgtD，其是来自适当生物体如流感嗜血杆菌（H. influenza))存在下将Gb3-0R1A 转换成Gb4-0R1A，该步骤可与步骤（iv)结合，步骤（iv)包括在UDP-GalNAc再生酶组存在 下，自GalNAc生成UDP-GalNAc，其中该TOP-GalNAc再生酶组包含N-乙酰己糖胺1-激酶 (N-acetylhexosamine Ι-kinase)(如来自龙根菌（B. Iongum))、N_乙酰己糖胺1-磷酸尿苷 酰转移酶（例如来自大肠杆菌）及丙酮酸激酶（例如来自大肠杆菌），及视需要的焦磷酸化 酶（例如来自大肠杆菌）。步骤（iii)及（iv)可在Gb-4合成反应混合物中进行，该反应混 合物包含 GalNAc、PEP、ATP、UTP、Gb3-0R1A、β -1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶及 UDP-GalNAc 再生酶组。本发明的一实施例中，Gb-4合成反应混合物是通过将Gb-3合成反应混合物至 少与GalNAc、β -1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰己糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺 1-磷酸尿苷酰转移酶混合制得。如需要，Gb4-0R 1A可自反应混合物中分离。
[0013] 664-01^合成之后，上述方法可进一步包括：（V)在UDP-Gal及β 1，3-半乳糖转 移酶（例如LgtD，其是来自如流感嗜血杆菌）存在下，将Gb4-0R1A转换为Gb5-0R 1Α，该步骤 可与步骤（vi)结合，步骤（vi)包括在本发明所述UDP-Gal再生酶组存在下，自半乳糖生成 UDP-Gal。本发明的一实施例中，步骤（V)及（vi)是在Gb5-合成反应混合物中进行，该反 应混合物包含半乳糖、PEP、ATP、UTP、Gb4-0R 1A、βl，3-半乳糖转移酶及UDP-Gal再生酶组。 产物Gb5-0R1A可自反应混合物中分离。
[0014] 上述方法可进一步包括转换Gb5-0R1A的步骤，以获得岩藻糖-Gb5-0R 1A(Globo H) 或唾液酸-Gb5-0R1A(SSEA4)。
[0015] 有关Globo H的合成，该方法可进一步包括：（vii)在⑶P-Fuc及α 1，2-岩藻糖基 转移酶（如来自幽门螺旋杆菌（H.pylor))存在下，将Gb5-0R1AR换为岩藻糖基-Gb5-0R 1A， 该步骤可与步骤（viii)结合，步骤（viii)包括在GDP-Fuc再生酶组存在下，自岩藻糖生成 ⑶P-Fuc，其中该⑶P-Fuc再生酶组包含L-岩藻糖激酶/⑶P-岩藻糖焦磷酸化酶（例如来 自脆弱拟杆菌（B.fragilis))、丙酮酸激酶（例如来自大肠杆菌）及焦磷酸化酶（例如来 自大肠杆菌）。本发明的一实施例中，步骤（vii)及（viii)是在岩藻糖基-Gb5-合成反应 混合物中进行，该反应混合物包含岩藻糖、ATP、GTP、PEP、Gb5-0R 1A、α -1，2-岩藻糖基转移 酶及⑶P-Fuc再生酶组。岩藻糖基-Gb5-合成反应混合物是将Gb5-合成反应混合物与至 少岩藻糖、GTP、α -1，2-岩藻糖基转移酶及L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶混合而 得。如需要，产物岩藻糖基-Gb5-0R1A可自反应混合物中分离。
[0016] 有关SSEA4的合成，本发明方法可进一步包括：（ix)在CMP_Neu5Ac及α -2, 3-唾 液酸转移酶（例如来自海洋细菌（M. bacteria))存在下，将Gb5_0R1A转换为唾液 酸-Gb5-0R1A，及（X):在CMP-Neu5Ac再生酶组存在下，自Neu5Ac生成CMP-Neu5Ac，其中该 CMP-Neu5Ac再生酶组包含胞苷单磷酸激酶（例如来自大肠杆菌）、CMP-唾液酸合成酶（例 如来自多杀性巴氏杆菌（P.multocida))、丙酮酸激酶（例如来自大肠杆菌）及视需要的焦 磷酸化酶（例如来自大肠杆菌）。步骤（ix)及（X)可在唾液酸-Gb5-合成反应混合物中 实施，该反应混合物包含Neu5Ac、CTP、PEP、Gb5-0R 1A、α -2, 3-唾液酸转移酶及CMP-Neu5Ac 再生酶组。唾液酸-Gb5-合成反应混合物是将Gb5-合成反应混合物与至少Neu5Ac、CTP、 α -2, 3-唾液酸转移酶、胞苷单磷酸激酶及CMP-唾液酸合成酶混合而得。唾液酸-Gb5-0R1A 可自反应混合物中分离。
[0017] 本发明的一实施例中，Globo H合成方法的实施方式如下：（i)在本发明所述 UDP-Gal再生酶存在下，自半乳糖生成UDP-Gal ;(ii)在Gb3-合成反应混合物中将本发明 所述的Lac_OR1A转换为Gb3_0R1A，其中该反应混合物包含至少UDP-Gal、α -1，4半乳糖基转 移酶及UDP-Gal再生酶；（iii)将Gb3-合成反应混合物与至少GalNAc、β -1，3-Ν-乙酰半 乳糖胺转移酶、N-乙酰己糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶混合以形成 Gb4-合成混合物；（iv)在允许转换Gb3-0R1AS GbfOR1M^]条件下，培养Gb4-合成反应混合 物；（V)进一步在允许Gb4-0R1A转换为GbS-OR 1M^]条件下，在1，3-半乳糖转移酶存在下培养 Gb4_合成反应混合物；（vi)将含有GbS-OR1M^]反应混合物与至少岩藻糖、GTP、α -1，2-岩 藻糖转移酶及L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶混合以形成岩藻糖-665-01^反应 混合物；（vii)在允许转换Gb5-0R 1AS岩藻糖-Gb5-0R 14的条件下，培养岩藻糖-Gb5-0R 14反 应混合物；及视需要（viii)分离岩藻糖-Gb5-0R1A。
[0018] 本发明另一实施例中，Globo H的合成方法的实施方式如下：⑴如本发明所述， 在UDP-Gal再生酶存在下，自半乳糖生成UDP-Gal ;(ii)如本发明所述，在Gb3-合成反应混 合物中将Lac-〇R1A转换为Gb3_0R1A，其中该反应混合物包含至少UDP-Gal、α -1，4半乳糖转 移酶及UDP-Gal再生酶；（iii)将Gb3-合成反应混合物与至少GalNAc、β 1，3-Ν-乙酰半乳 糖胺转移酶、N-乙酰己糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶混合以形成 Gb4-合成混合物；（iv)在允许转换Gb3-0R1AS Gb4-0R 14的条件下，培养Gb4-合成反应混 合物；（V)分离Gb4-0R1A; (vi)将Gb4-0R 14与β 1，3-半乳糖转移酶及UDP-Gal再生酶组予 以混合以形成Gb5-合成反应混合物；（vii)在允许转换Gb4-0R 1AS Gb5-0R 14的条件下，培 养Gb5_合成反应混合物；（viii)将Gb5_合成反应混合物与至少岩藻糖、GTP、α 1，2-岩藻 糖转移酶及L-岩藻糖激酶/⑶P-岩藻糖焦磷酸化酶混合以形成岩藻糖-665-01^反应混合 物；（ix)在允许转换Gb5-0R 1AS岩藻糖-Gb5-0R 14的条件下，培养岩藻糖-Gb5-0R 1Α反应混 合物；及视需要（X)分离岩藻糖-Gb5-0R1A。
[0019] 一种合成SSEA4方法的实施方式是如下：（i)如本发明所述，在UDP-Gal再生酶存 在下，自半乳糖生成M)P-Gal ;(ii)如本发明所述，在Gb3-合成反应混合物中，将Lac-〇R1A 转换为Gb3-0R1A，其中该反应混合物包含至少UDP-Gal、α -1，4半乳糖转移酶及UDP-Gal再 生酶；（iii)将Gb3-合成反应混合物与至少GalNAc、β 1，3-Ν-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙 酰己糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶予以混合以形成Gb4-合成反应 混合物 ；（iv)在允许转换Gb3-0R1A为Gb4-0R1A的条件下，培养Gb4-合成反应混合物 ；（V)在 允许转换Gb4-0R1AS Gb5-0R 14的条件下，在1，3-半乳糖转移酶存在下，进一步培养Gb4-合 成反应混合物；（vi)将G