2)的基团，其中Raa及Rbb是如本文所定义者。
[0073] 本文所指"迭氮化物"或"迭氮基"是指-N3基团。
[0074] 本文所指"硫化物"或"硫基"是指-SH基团。"经取代的硫化物"或"经取代的硫基" 延伸所指为一硫基团，其中直接附着于母分子上的硫原子是经取代（但取代基不为氢），且 包含选自 _SRaa、-S = SR。。、-SC( = S)SRaa、-SC( = 0)SRaa、-SC( = 0)0Raa及-SC( = 0)Raa 的基团，其中R α是如本文所定义者。
[0075] 本文所指"氨基"或"胺"是指-NH2基团。"经取代的氨基"或"经取代的胺"延伸 所指为一单一取代的氨基，双取代的氨基或三取代的氨基。某些特定实施例中，"经取代的 氨基"为单一取代的氨基或双取代的氨基基团。
[0076] 本文所指"经单取代的氨基"或"经单取代的胺"是指一氨基基团，其中 直接附着于母分子上的氮原子是经一个氢原子及一个非为氢的基团所取代，其 包括选自-NH (Rbb)、-NHC ( = 0)Raa、-NHCO2Ra'-NHC ( = 0) N (Rbb) 2、-NHC ( = NRbb) N(Rbb) 2、-NHSO2R' -NHP ( = 0) (ORcc) 2及-NHP ( = 0) (NRbb) 2的基团，其中 R aa、Rbb及 R cc是如 本文所定义者，且其中-NH(Rbb)基团的Rbb部份不为氢。
[0077] 本文所指"经双取代的氨基"是指一氨基基团，其中直接附着于母分子 上的氮原子是经两个不为氢的基团所取代，其包括选自_N(R bb)2、-NRbb C( = 0) Raa、-NRbbCO2Raa、-NR bbC ( = 0) N (Rbb) 2、-NRbbC ( = NRbb) N (Rbb) 2、-NRbbSO2Raa、-NRbbP ( = 0) (ORcc)2 及_NRbbP( = 0) (NRbb)2的基团，其中Raa、Rbb及R c^是如本文所定义者，其限制条件为该直接 附着于母分子上的氮原子不被氢所取代。
[0078] 本文所指"经三取代的氨基"是指一氨基基团，其中直接附着于母分子上的氮原子 是经三个基团所取代，其包括选自-N(R bb) 3及-N(Rbb) 3+Γ的基团，其中Rbb及)T是如本文所 定义者。
[0079] 本文所指"生物素"，例如Ria基团，其包含以下结构：
【主权项】
1. 一种以酶性方式合成寡糖的方法，其特征在于，包含： (i) 在UDP-Gal再生酶组的存在下，将半乳糖制成UDP-Gal，其中该UDP-Gal再生酶组 包含半乳糖激酶、UDP-糖焦磷酸化酶及丙酮酸激酶；及 (ii) 在UDP-Gal及a-1，4半乳糖转移酶存在下，将Lac_OR1A转换为Gb3_0R1A，其中Ria 为氢、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经 取代或未经取代的环碳基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代 或未经取代的杂芳基或氧保护基团。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，该UDP-Gal再生酶组包含焦磷酸化酶。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，（i)及（ii)发生于Gb3-合成反应混合 物中，该Gb3_合成反应混合物包括半乳糖、PEP、ATP、UTP、Lac-〇R1A、a-1，4-半乳糖转移酶 及UDP-Gal再生酶组。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，在任何酶反应发生前，Lac-OR1A与半乳糖在 Gb3-合成反应混合物中的摩尔比为1 :1。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，Ria为氢、丙烯基、经取代的烷基、 生物素或神经酰胺。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，该a-1，4半乳糖转移酶是来 自脑膜炎双球菌的LgtC，该半乳糖激酶是来自大肠杆菌，该UDP-糖焦磷酸化酶是来自拟南 芥，该丙酮酸激酶是来自大肠杆菌，或该焦磷酸化酶是来自大肠杆菌。
7. 如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含分离Gb3-0R1A。
8. 如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含： (iii) 在UDP-GalNAc及P-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶存在下，将Gb3-0R1A转换成 Gb4-0R1A。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包含： (iv) 在UDP-GalNAc再生酶组存在下，将GalNAc制成UDP-GalNAc，其中该UDP-GalNAc 再生酶组包含N-乙酰己糖胺1-激酶、N-乙酰己糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶及丙酮酸激酶、 及视需要的焦磷酸化酶。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，（iii)及（iv)在Gb-4合成反应混合物中 进行，该Gb-4合成反应混合物包含GalNAc、PEP、ATP、UTP、Gb3-0R1A、P-1，3-N-乙酰半乳糖 胺转移酶及UDP-GalNAc再生酶组。
11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，该Gb-4合成反应混合物是通过将Gb-3 合成反应混合物至少与GalNAc、P-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰己糖胺1-激酶及 N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶混合制得。
12. 如权利要求8-11中任一项所述的方法，其特征在于，该P-1，3-N-乙酰半乳糖胺转 移酶是来自流感嗜血杆菌的LgtD，N-乙酰己糖胺1-激酶是来自龙根菌、或N-乙酰己糖胺 1-磷酸尿苷酰转移酶是来自大肠杆菌。
13. 如权利要求8-12中任一项所述的方法，其特征在于，进一部包含分离Gb4_0R1A。
14. 如权利要求8-12中任一项所述的方法，其特征在于，进一部包含： (V)在UDP-Gal及P1，3-半乳糖转移酶存在下，将Gb4-0R1A转换为Gb5-0R1A。
15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，进一步包含： (vi) 在UDP-Gal再生酶组存在下，将半乳糖制成UDP-Ga。
16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，（V)及（vi)是在Gb5-合成反应混合物中 进行，该Gb5-合成反应混合物包含半乳糖、PEP、ATP、UTP、Gb4-0R1A、P1，3-半乳糖转移酶 及UDP-Gal再生酶组。
17. 如权利要求14-16中任一项所述的方法，其特征在于，该P1，3-半乳糖转移酶是来 自流感嗜血杆菌的LgtD。
18. 如权利要求14-17中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含分离Gb5-0R1A。
19. 如权利要求14-18中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含： (vii) 在⑶P-Fuc及a1，2-岩藻糖基转移酶存在下，将Gb5_0R1A转换为岩藻糖 基-Gb5-0R1A。
20. 如权利要求19所述的方法，其特征在于，进一步包含： (viii) 在⑶P-Fuc再生酶组存在下，自岩藻糖生成⑶P-Fuc，其中该⑶P-Fuc再生酶组 包含L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、丙酮酸激酶及视需要的焦磷酸化酶。
21. 如权利要求20所述的方法，其特征在于，（vii)及（viii)是在岩藻糖基-Gb5-合成 反应混合物中进行，该岩藻糖基-Gb5-合成反应混合物包含岩藻糖、ATP、GTP、PEP、Gb5-0R、 a-1，2-岩藻糖基转移酶及⑶P-Fuc再生酶组。
22. 如权利要求20所述的方法，其特征在于，该岩藻糖基-Gb5-合成反应混合物是 将Gb5_合成反应混合物与至少岩藻糖、GTP、a-1，2-岩藻糖基转移酶及L-岩藻糖激酶/ ⑶P-岩藻糖焦磷酸化酶混合而得。
23. 如权利要求19-22中任一项所述的方法，其特征在于，该L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻 糖焦磷酸化酶是来自脆弱拟杆菌，或该a1，2-岩藻糖转移酶是来自幽门螺旋杆菌。
24. 如权利要求19-22中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含分离岩藻糖 基-Gb5-0R1A。
25. 如权利要求14-18中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含： (ix) 在CMP_Neu5Ac及a-2, 3-唾液酸转移酶存在下，将Gb5_OR1A转换为唾液 酸-Gb5-0R1A。
26. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，进一步包含： (X)在CMP-Neu5Ac再生酶组存在下，自Neu5Ac生成CMP-Neu5Ac，其中该CMP-Neu5Ac再生酶组包含胞苷单磷酸激酶、CMP-唾液酸合成酶、丙酮酸激酶及视需要的焦磷酸化酶。
27. 如权利要求26所述的方法，其特征在于，（ix)及（X)是在唾液酸-Gb5-合成反应 混合物中进行，该唾液酸-Gb5-合成反应混合物包含他1154(：、01\?￡?、665-(?1\〇-2,3-唾 液酸转移酶及CMP-Neu5Ac再生酶组。
28. 如权利要求27所述的方法，其特征在于，该唾液酸-Gb5-合成反应混合物是 将Gb5_合成反应混合物与至少Neu5Ac、CTP、a-2, 3-唾液酸转移酶、胞苷单磷酸激酶及 CMP-唾液酸合成酶混合而得。
29. 如权利要求25-28中任一项所述的方法，其特征在于，该a-2, 3-唾液酸转移酶是 来自海洋细菌，该胞苷单磷酸激酶是来自大肠杆菌，或该CMP-唾液酸合成酶是来自多杀性 巴氏杆菌。
30. 如权利要求25-29中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含分离唾液 酸-Gb5-0R1A。
31. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，进一步包含： (a) 将Gb3-合成反应混合物与至少GalNAc、P1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰己 糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶予以混合以形成Gb4-合成反应混合 物； (b) 在允许转换Gb3-0R1ASGb4-0R14的条件下，培养Gb4-合成反应混合物； (c) 在允许转换Gb4-0R1ASGb5-0R14的条件下，在P1，3-半乳糖转移酶存在下，进一 步培养Gb4-合成反应混合物； (d) 将（c)中所制备含有Gb5-0R%^反应混合物与至少岩藻糖、GTP、a1，2_岩藻糖基 转移酶及L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶混合来形成岩藻糖基-665-01^反应混合 物；及 (e) 在允许转换Gb5-0R1A为岩藻糖基-Gb5-0R14的条件下，培养岩藻糖基-Gb5-0R14反 应混合物。
32. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，进一步包含： (a) 将Gb3-合成反应混合物与至少GalNAc、P1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰己 糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶混合来形成Gb4-合成反应混合物； (b) 在允许转换Gb3-0R1ASGb4-0R14的条件下，培养Gb4-合成反应混合物； (c) 分离Gb4-0R1A; (d) 将664-01^与P1，3-半乳糖转移酶及UDP-Gal再生酶组混合来形成Gb5-合成反 应混合物； (e) 在允许转换Gb4-0R1ASGb5-0R14的条件下，培养Gb5-合成反应混合物； (f) 将Gb5_合成反应混合物与至少岩藻糖、GTP、a1，2-岩藻糖转移酶及L-岩藻糖激 酶/⑶P-岩藻糖焦磷酸化酶混合以形成岩藻糖-Gb5-0R1A反应混合物；及 (g) 在允许转换Gb5-0R1AS岩藻糖-Gb5-0R14的条件下，培养岩藻糖-Gb5-0R1A反应混 合物。
33. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，进一步包含： (a) 将Gb3-合成反应混合物与至少GalNAc、P1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰己 糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶予以混合以形成Gb4-合成反应混合 物； (b) 在允许转换Gb3-0R1ASGb4-0R14的条件下，培养Gb4-合成反应混合物； (c) 在允许转换Gb4-0R1ASGb5-0R14的条件下，在P1，3-半乳糖转移酶存在下，进一 步培养Gb4-合成反应混合物； (d) 将（c)中所制备含有Gb5-0R1A的反应混合物与至少他1154(：、01\〇2,3-唾液酸转 移酶、胞苷单磷酸激酶及CMP-唾液酸合成酶予以混合以形成唾液酸-Gb5-0R1A反应混合物； 及 (e) 在允许转换Gb5-0R1AS唾液酸-Gb5-0R14的条件下，培养唾液酸-Gb5-0R1A反应混 合物。
34. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，进一步包含： (a)将Gb3-合成反应混合物与至少GalNAc、P1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰己 糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶予以混合以形成Gb4-合成反应混合 物； (a) 在允许转换Gb3-0R1ASGb4-0R14的条件下，培养Gb4-合成反应混合物； (b) 分离Gb4-0R1A; (c) 将664-01^与P1，3-半乳糖转移酶及UDP-Gal再生酶组混合以形成Gb5-合成反 应混合物； (d) 在允许转换Gb4-0R1ASGb5-0R14的条件下，培养Gb5-合成反应混合物； (6)将665-01^与〇-2,3唾液酸转移酶及01^-他1154(3再生酶组混合以形成唾液 酸-Gb5-合成反应混合物，其中该CMP-Neu5Ac再生酶组包含胞苷单磷酸激酶、CMP-唾液酸 合成酶、丙酮酸激酶及视需要的焦磷酸化酶；及 (f)在允许转换Gb4-0R1AS唾液酸-Gb5-0R14的条件下，培养唾液酸-Gb5-合成反应混 合物。
35. -种以酶性方式合成寡糖的方法，其特征在于，包含： (i) 包括在UDP-GalNAc再生酶组存在下，自GalNAc生成UDP-GalNAc，其中该 UDP-GalNAc再生酶组包含N-乙酰己糖胺1-激酶、N-乙酰己糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶、丙 酮酸激酶及视需要的焦磷酸化酶；及 (ii) 在UDP-GalNAc及P1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶存在下，将Gb3-0R1A转换为 Gb4-0R1A，其中Ria为氢、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未 经取代的炔基、经取代或未经取代的环碳基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取 代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基或氧保护基团。
36. 如权利要求35所述的方法，其特征在于，（i)及（ii)可在Gb4-合成反应混合物中 进行，其中该反应混合物包含GalNAc、PEP、ATP、UTP、Gb3-0R1A、P-1，3-N-乙酰半乳糖胺转 移酶及UDP-GalNAc再生酶组。
37. 如权利要求35或36所述的方法，其特征在于，该P-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移 酶是来自流感嗜血杆菌的LgtD，该N-乙酰己糖胺1-激酶是来自龙根菌、该N-乙酰己糖胺 1-磷酸尿苷酰转移酶是来自大肠杆菌，该丙酮酸激酶是来自大肠杆菌，或该焦磷酸化酶是 来自大肠杆菌。
38. 如权利要求35-37中任一项所述的方法，其特征在于，Ria为氢、丙烯基、经取代的烷 基、生物素或神经酰胺。
39. 如权利要求35-38中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含分离Gb4-0R1A。
40. 如权利要求35-39中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含： (iii) 在UDP-Gal及P-1，3-半乳糖转移酶存在下，将Gb4-0R1A转换为Gb5-0R1A。
41. 如权利要求40所述的方法，其特征在于，进一步包含： (iv) 在UDP-Gal再生酶组存在下，自半乳糖生成UDP-Gal，其中该UDP-Gal再生酶组包 含半乳糖激酶、UDP-焦磷酸化酶、丙酮酸激酶及视需要的焦磷酸化酶。
42. 如权利