一种通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法
【专利摘要】本发明涉及发酵生产纤维素酶的方法，具体的说是一种通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法。以甜叶菊糖苷作为纤维素酶发酵的诱导物，进而诱导木霉菌产纤维素酶。本发明采用甜叶菊糖苷主要组分甜菊糖甙作为纤维素酶发酵的诱导物，诱导提高木霉菌产纤维素酶产量的方法，原料来源广泛，成本低廉，便于规模化生产应用。
【专利说明】一种通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及发酵生产纤维素酶的方法，具体的说是一种通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法。
【背景技术】
[0002]纤维素酶(cellulases)是一组可以水解纤维素生成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖酶。纤维素酶是一种复合酶，主要由三种主要成分组成，即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶，三种成分协同作用降解纤维素大分子。随着能源需求的不断增加和环境问题的日益严重，纤维素原料作为一种储量丰富、价格低廉的可再生资源，在生物燃料及相关高附加值产品领域的应用已成为一个研发热点。纤维素的酶水解是纤维素生物炼制的主要瓶颈之一，纤维素酶水解目前面临的主要问题是纤维素酶的用量大、成本较高。我国对于纤维素酶有着很高的市场需求，但迄今为止仍未解决规模生产纤维素酶的难题(Y Qu1MZhuj K Liuj X Baoj J Linj Studies on cellulosic ethanol product1n for sustainablesupply of liquid fuel in China, B1technol.J.，2006，1，1235 - 1240)。诺维信、杰能科等国外公司产品的垄断造成市场价格居高不下。因此提高纤维素酶的产量，降低纤维素酶的生产成本是纤维素生物炼制生产生物燃料与生物基材料化学品亟待解决的问题。
[0003]真菌纤维素酶是诱导酶，诱导物是调控纤维素酶合成的主要因素。许多物质如纤维素、羧甲基纤维素、各种纤维素水解物、乳糖、槐糖等都被认为是生物合成纤维素酶的潜在诱导物，其中槐糖一直以来都被认为是纤维素酶合成最有效的诱导物，在里氏木霉中，其对纤维素酶的诱导效率是纤维二糖的2500倍，是微晶纤维素等其它诱导物的几十到几千倍(M Mandels, Fff Parrish, ET Reese, Sophorose as an inducer of cellulase inTrichodermaviride, J.Bacter1l., 1962, 83, 400 - 408)。槐糖虽然表现出极强的诱导效果，但由于其天然产量极低，价格极其昂贵(约1200元/mg，Si gma公司产品)，难以在实际生产中应用。因此寻找一种制备简单，效果显著的诱导物对纤维素酶的工业化生产具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种利用制备简单、效果显著的通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
[0006]一种通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法:以甜叶菊糖苷作为纤维素酶发酵的诱导物，诱导木霉菌产纤维素酶。
[0007]进一步的说,在里氏木霉发酵培养基中加入甜菊糖式(stev1side)或甜菊糖式类似物诱导里氏木霉发酵生产纤维素酶。
[0008]更进一步的说，将木霉菌在土豆培养基(PDA)中培养至培养液中孢子浓度为17-1O8个/mL ;而后将孢子液接种于液体种子培养基中，进行种子培养；再将种子液以1-10% (体积)的接种量接入添加甜叶菊糖苷的发酵产酶培养基中发酵培养，进而产生纤维素酶。种子液以优选的接种量为5%。
[0009]再更进一步的说，将木霉菌在土豆培养基(PDA)中以28-32°C培养4-7天，收集孢子，将孢子用无菌水稀释至孢子浓度为17-1O8个/mL ；
[0010]将所述孢子液接种于pH值在3.5-5.5的液体种子培养基中，培养18_48小时进行种子培养；优选PH值在4.5;
[0011]将上述种子液以1-10% (体积比)的接种量接入pH值在3.5-5.5添加甜叶菊糖苷的发酵产酶培养基进行发酵产酶；其中种子液优选的接种量为5%，优选pH值在4.5 ;
[0012]所述甜叶菊糖苷的添加量为0.4_5g/L。
[0013]甜叶菊糖苷是从甜叶菊中提取的一类糖苷,其主要组分甜菊糖式stev1side分子中含有一个槐糖，其余组分莱鲍迪式A (Rebaud1side A)、莱鲍迪式B (Rebaud1side B)、莱鲍迪式C (Rebaud1side C)、杜克式A (Dulcoside A)等都含有槐糖的衍生物或结构类似物。目前我国甜叶菊的种植面积非常广阔，产量高，最高亩产可达300公斤，且甜叶菊糖苷的提取工艺已十分成熟，现在我国甜叶菊糖厂有20多家，年生产能力2000吨，甜叶菊糖苷的价格约为150-200元/公斤。
[0014]本发明所具有的优点:本发明采用甜叶菊糖苷主要组分甜菊糖甙作为纤维素酶发酵的诱导物，诱导提高木霉菌产纤维素酶产量的方法，原料来源广泛，成本低廉，便于规模化生产应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例提供的甜叶菊糖苷中主要组分甜菊糖甙stev1side的分子结构式示意图；
[0016]图2为本发明实施例提供的甜叶菊糖苷中含有槐糖衍生物或结构类似物物质的分子结构式示意图；
[0017]图3为本发明实施例提供的不同添加量的甜菊糖式stev1side对木霉QM9414产纤维素酶的诱导作用效果图；
[0018]其中，ck不添加甜菊糖式stev1side的对照；
[0019]+STV0.56g/L发酵培养基中添加0.56g/L的甜菊糖式stev1side ；
[0020]+STVlg/L发酵培养基中添加lg/L的甜菊糖式stev1side ；
[0021]+STV5g/L发酵培养基中添加5g/L的甜菊糖式stev1side ；
[0022]图4为本发明实施例提供的不同添加量的甜菊糖甙stev1side对木霉QM9414纤维素酶滤纸酶活的诱导作用效果图；
[0023]其中，ck不添加甜菊糖式stev1side的对照；
[0024]+STV0.56g/L发酵培养基中添加0.56g/L的甜菊糖式stev1side ；
[0025]+STVlg/L发酵培养基中添加lg/L的甜菊糖式stev1side ；
[0026]+STV5g/L发酵培养基中添加5g/L的甜菊糖式stev1side ；
[0027]图5为本发明实施例提供的不同添加量的甜菊糖甙stev1side对木霉QM9414纤维素酶羧甲基纤维素钠CMC酶活的诱导作用效果图
[0028]其中，ck不添加甜菊糖式stev1side的对照；
[0029]+STV0.56g/L发酵培养基中添加0.56g/L的甜菊糖式stev1side ；
[0030]+STVlg/L发酵培养基中添加lg/L的甜菊糖式stev1side ；
[0031]+STV5g/L发酵培养基中添加5g/L的甜菊糖式stev1side。
【具体实施方式】
[0032]通过参考下面的定义和实施例结合附图对本发明做进一步的详细说明，本文引用的所有出版物均通过引用方式并入本文，以用于描述和揭示可能与本发明联系使用的组合及方法。
[0033]除非本文另有定义，此处应用的所有技术术语和科学术语，皆具有本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的含义。
[0034]应该理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明不限于所描述的具体的方法学、方案和试剂。
[0035]本文提出的标题不是对本发明各个发明或者各种实施方案的限制，应将整个说明书作为一个整体来参考。下面即将被定义的术语可以被更加全面的定义。
[0036]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。以下实施例中的试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0037]里氏木霉(Trichoderma reesei) QM9414菌株:美国模式培养物集存库(简称ATCC,网址 WWW.atcc.0rg), ATCC 编号为 26921。
[0038]土豆培养基(PDA固体培养基):购自BD公司。
[0039]甜叶菊糖苷购自曲阜圣仁制药有限公司。
[0040]羧甲基纤维素钠CMC-Na购自sigma公司。
[0041]实施例1
[0042]选用里氏木霉QM9414为纤维素酶生产菌种，分析不同添加量甜菊糖甙的诱导作用
[0043]制备里氏木霉菌种新鲜孢子液:将木霉菌株在土豆培养基(PDA)平板上划线，在30摄氏度生长4-7天，使用本领域已知的方法，收集孢子，用无菌弯曲玻璃棒刮擦产生孢子的培养物表面，以刮下孢子，在无菌水中稀释，测定孢子浓度为17-1O8个/mL ；
[0044]取平板上活化好的菌种，接种在pH值在4.5种子培养基中，种子培养基的组成包括:
[0045]葡萄糖10g/L，玉米浆 10g/L，KH2P0415g/L，(NH4) 2S045g/L，MgSO4.7Η200.6g/L, CaCL20.5g/L, FeSO4.7H205mg/L, MnSO4.H2Ol.6mg/L, ZnSO4.7H201.4mg/L,CoCL2.6H200.37mg/L,调节 pH 值为 4.5。
[0046]30摄氏度，200rpm振荡培养24小时，后将种子按体积比5%的接种量接种发酵培养基，共接4组，每组3个平行。32摄氏度，200rpm振荡培养24小时后，转入30摄氏度，200rpm振荡培养。
[0047]第I组的三个平行，发酵培养基的组成包括:
[0048]葡萄糖4.5g/L,乳糖 26g/L,玉米衆 25g/L, KH2P042g/L, (NH4)2SO4L 4g/L,MgSO4.7Η200.3g/L, CaCL20.45g/L，FeSO4.7H205mg/L，MnSO4.H2Ol.6mg/L, ZnSO4 *7H201.4mg/L, CoCL2.6Η200.37mg/L，调节 pH 值为 4.5。
[0049]产酶阶段培养到48小时，72小时及96小时时分别取样，离心取上清液得到粗酶液；
[0050]第2组的三个平行,在发酵培养基中添加0.56g/L的甜菊糖式(stev1side),发酵培养基的组成在第I组的基础上添加甜菊糖式(stev1side) 0.56g/L,同时降低乳糖的含量至13g/L;
[0051]调节pH值为4.5，产酶阶段培养到48小时，72小时及96小时时分别取样，离心取上清液得到粗酶液；
[0052]第3组的三个平行，在发酵培养基中添加lg/L的甜菊糖甙stev1side，发酵培养基的组成在第一组的基础上添加甜菊糖式stev1sidelg/L,同时降低乳糖的含量至13g/L；
[0053]第4组的三个平行，在发酵培养基中添加5g/L的甜糖菊苷Stev1side，发酵培养基的组成在第一组的基础上添加甜菊糖式stev1side5g/L,同时降低乳糖的含量至13g/L；
[0054]将得到的各个粗酶液分别进行SDS-PAGE蛋白电泳及酶活测定。
[0055]酶活测定方法参照IUPAC标准方法进行纤维素滤纸酶活及羧甲基纤维素钠CMC酶活测定(参照 Ghose, Pure&App.Chem., 1987, 59, 257-268，及 Laboratory AnalyticalProcedure (LAP)关于纤维素酶酶活测定方法)
[0056]滤纸酶活计算:根据葡萄糖标准曲线，计算待测酶液中释放2.0mg葡萄糖所需的稀释系数，则FPU=0.37/ (释放2.0mg葡萄糖的稀释系数)
[0057]羧甲基纤维素钠CMC酶活计算，在50°C，pH为4.80条件下，每分钟每毫升酶液从浓度为5mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放I μ mol还原糖所需要的酶量为一个活力单位(U)，还原糖以葡萄糖等量。
[0058]纤维素酶的表达量如图3所示，添加0.56-5g/L的甜菊糖甙Stev1side在各个时间点均提高了木霉的纤维素酶表达量，如图4及图5所示，添加0.56-5g/L的甜菊糖甙stev1side均能提高木霉的纤维素酶滤纸酶活及羧甲基纤维素钠CMC酶活，添加0.56g/L的甜菊糖甙在48小时纤维素酶滤纸酶活提高了 12.86%，添加5g/L的甜菊糖甙在48小时纤维素酶滤纸酶活和羧甲基纤维素钠CMC酶活分别提高了 69%和86.67%，添加0.56g/L的甜菊糖甙在72小时纤维素酶滤纸酶活和羧甲基纤维素钠CMC酶活分别提高了 11%和13.4%，添加5g/L的甜菊糖甙纤维素酶滤纸酶活和羧甲基纤维素钠CMC酶活在72小时分别提高了13.1%和35%，添加0.56g/L的甜菊糖甙纤维素酶滤纸酶活和羧甲基纤维素钠CMC酶活在96小时分别提高了 11.5%和13%，添加5g/L的甜菊糖甙纤维素酶滤纸酶活和羧甲基纤维素钠CMC酶活在96小时分别提高了 13%和20%。
[0059]上述参照实施例对通过添加含有槐糖结构的甜菊糖式stev1side或其它甜叶菊糖苷类物质诱导发酵生产纤维素酶的方法进行的详细描述，是说明性的而非限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法，其特征在于:以甜叶菊糖苷作为纤维素酶发酵的诱导物，诱导木霉菌产纤维素酶。
2.按权利要求1所述的通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法，其特征在于:在里氏木霉发酵培养基中加入甜菊糖甙(stev1side)或甜菊糖甙类似物诱导里氏木霉发酵生产纤维素酶。
3.按权利要求1或2所述的通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法，其特征在于:将木霉菌在土豆培养基(PDA)中培养至培养液中孢子浓度为17-1O8个/mL ;而后将孢子液接种于液体种子培养基中，进行种子培养；再将种子液以1-10% (体积)的接种量接入添加甜叶菊糖苷的发酵产酶培养基中发酵培养，进而产生纤维素酶。
4.按权利要求3所述的通过添加甜叶菊糖苷提高纤维素酶产量的方法，其特征在于: 将木霉菌在土豆培养基(PDA)中以28-32°C培养4_7天，收集孢子，将孢子用无菌水稀释至孢子浓度为17-1O8个/mL ； 将所述孢子液接种于PH值在3.5-5.5的液体种子培养基中，培养18-48小时进行种子培养； 将上述种子液以1-10% (体积比)的接种量接入pH值在3.5-5.5添加甜叶菊糖苷的发酵产酶培养基进行发酵产酶； 所述甜叶菊糖苷的添加量为0.4-5g/L。
【文档编号】C12N9/42GK104419691SQ201310382801
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】吕雪峰, 王敏, 李建军 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所