专利名称：异环麦芽寡糖和异环麦芽寡糖合酶以及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有由通式1表示的结构的异环麦芽寡糖和异环麦芽寡糖合酶(isocyclomaltooligosaccharide synthase)及其制备方法和用途，详细地讲，涉及具有由通式1表示的结构的异环麦芽寡糖和异环麦芽寡糖合酶及其制备方法，产生异环麦芽寡糖合酶的微生物，编码该酶的DNA和含有该DNA的重组DNA和转化体，使用该酶的异环麦芽寡糖的生成方法和制备方法，以及含有异环麦芽寡糖的组合物。
通式1环{→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)背景技术作为以葡萄糖作为组成糖的糖，已知有例如，以淀粉作为原料制备的淀粉部分分解物-直链淀粉，淀粉糊精，麦芽糖糊精，麦芽寡糖，异麦芽寡糖等。已知这些糖，通常在分子的一端具有非还原性末端，在另一端具有还原性末端，表现出还原性。一般而言，淀粉部分分解物的相当于其固体物质的还原力的大小可表示为葡糖当量(DextroseEquivalent，DE)。已知，该值大的分解物，通常分子小，低粘度，甜味强，反应性强，容易与氨基酸和蛋白质等具有氨基的物质发生氨基羰基反应，变褐，发出恶臭，具有品质容易劣化的性质。
为了改善这些缺点，长久以来一直期待一种减低其还原力或使之消失的简便方法。例如，已知有，如Journal of American ChemicalSociety，美国，1949年，第71卷，第353-358页中公开的，通过使软化淀粉酶(macerans amylase)作用于淀粉，使6-8分子的葡萄糖生成通过α-1，4葡糖苷结合形成环状结构的α-，β-或γ-环糊精的方法。现在，以工业规模由淀粉生产环糊精，这些环糊精由于它们所具有的非还原性，而且无味，可以用于有效利用其具有包合能力等特性的用途中。此外，首先，还已知有先前如特开平7-143876号公报，特开平7-213283号公报等中公开的，本申请人通过使非还原性糖合酶和海藻糖游离酶作用于麦芽寡糖等淀粉部分分解物，使2分子的葡萄糖生成结合了α，α-1，1的海藻糖的方法。现在，以工业规模由淀粉生产海藻糖，可以用于利用其还原性和温和的、高品质的甜味特性等的用途。进而，还已知有先前如WO01/90338A1说明书，WO02/055708A1说明书，WO02/40659A1说明书等中公开的，本申请人通过使α-异麦芽糖基葡萄糖合酶和α-异麦芽糖基转移酶作用于淀粉或其部分分解物，使4分子的葡萄糖生成具有通过α-1，3葡糖苷结合和α-1，6葡糖苷结合而相互结合的结构，即环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}结构的环状四糖的方法。此外，进而，还已知有，如特开2005-95148号公报中公开的，本申请人首先通过使环状异麦芽糖基麦芽糖合酶作用于淀粉或其部分分解物，使4分子的葡萄糖生成具有通过α-1，4葡糖苷结合和α-1，6葡糖苷结合而相互结合的结构，即环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}结构的环状四糖(别名为环状麦芽糖基麦芽糖)的方法。由于这些环状四糖具有环状结构，因此具有包合能力，其表现出稳定发挥性有机物的作用，并且是一种非还原性糖类，因此不发生氨基羰基反应，不用担心变褐和劣化，因此有望可以对其进行利用和加工。
这样一来，作为以葡萄糖作为组成糖的非还原性糖，葡萄糖聚合度为6-8的α-，β-，γ-环糊精，葡萄糖聚合度为2的α，α-海藻糖，葡萄糖聚合度为4的具有环{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}结构的环状四糖和具有{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}的结构的环状四糖(别名为环状麦芽糖基麦芽糖)通过利用各自的特性，可利用于或可有望利用于各种领域中。如果可以提供这些糖之外以葡萄糖作为组成糖的非还原性糖，可扩大非还原性糖的选择范围，并且可有望在多种用途中应用。
发明内容
本发明要解决的课题是提供以葡萄糖作为组成糖的新型非还原性糖，提供在扩大非还原性糖的选择范围的同时生成该非还原性糖的新酶和它们的生成方法和制备方法，编码该酶的DNA，含有该DNA的重组DNA和转化体，以及含有该非还原性糖的组合物。
本发明人等为了解决上述课题，倾注于期待由淀粉部分分解物生成新型非还原性糖的全新的酶，广泛寻找产生这种酶的微生物。其结果发现，从冈山县冈山市的土壤中新分离的杆菌属(Bacillus)的微生物AM7株产生新的酶，通过这种酶的作用，由淀粉或其部分分解物等α-1，4葡聚糖大量生产具有通式1表示的结构的异环麦芽寡糖。此外，弄清楚了异环麦芽寡糖合酶的各种性质，并且建立其制备方法，而且建立编码该酶的DNA和含有该DNA的转化体，进而，建立由该酶生成异环麦芽寡糖的方法和使用该酶制备异环麦芽寡糖或含有这些的组合物的方法和用途，从而完成本发明。
通式1环{-6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)也就是说，本发明通过提供具有由通式1表示的结构的新型异环麦芽寡糖和生成该糖的新型异环麦芽寡糖合酶和它们的生成方法和制备方法，以及编码该酶的DNA和含有该DNA的重组DNA和转化体，以及由含有异环麦芽寡糖或含有该糖的糖类组合物构成饮食品，化妆品和药物组合物，从而解决上述课题。
如果根据本发明，在扩大以葡萄糖作为组成糖的非还原性糖的选择范围上，可以大量提供以往未知的新型环状糖，异环麦芽寡糖可以在以饮食品，化妆品，药物为代表的各个领域中应用。
图1是表示糖I制品的HPLC洗脱模式的图。
图2是表示糖II制品的HPLC洗脱模式的图。
图3是表示糖I制品的1H-NMR谱图的图。
图4是表示糖I制品的13C-NMR谱图的图。
图5是表示本发明的异环麦芽五糖的结构的图。
图6是表示糖II制品的1H-NMR谱图的图。
图7是表示糖II制品的13C-NMR谱图的图。
图8是表示本发明的异环麦芽六糖的结构的图。
图9是表示异环麦芽寡糖合酶的最适温度的图。
图10是表示异环麦芽寡糖合酶的最适pH的图。
图11是表示异环麦芽寡糖合酶的温度稳定性的图。
图12是表示异环麦芽寡糖合酶的pH稳定性的图。
图13是表示重组DNA，pBAMH1的图。图中，黑色粗线表示的部分是编码环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)来源的本发明的异环麦芽寡糖合酶的DNA。
图14是表示异环麦芽寡糖合酶表达用的重组DNA，pETAM1的图。图中，黑色粗线表示的部分是编码环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)来源的本发明的异环麦芽寡糖合酶的DNA。
符号的说明a1位为结合了α-1，4葡糖苷的葡萄糖残基b1位为结合了α-1，6葡糖苷的葡萄糖残基具体实施方式
本发明中所谓异环麦芽寡糖，是指具有由下述通式1表示的结构的环状糖通式1环{→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
所谓异环麦芽寡糖，在上述通式1中，存在n为4的异环麦芽寡糖，即麦芽五糖分子的还原末端葡萄糖的1位和非还原末端葡萄糖的6位羟基通过α-1，6葡糖苷结合形成环状结构的五糖(本说明书中，称为异环麦芽五糖)，和上述通式1中，存在n为5的异环麦芽寡糖，即麦芽六糖分子的还原末端葡萄糖的1位和非还原末端葡萄糖的6位羟基通过α-1，6葡糖苷结合形成环状结构的六糖(本说明书中，称为异环麦芽六糖)。这些糖是本发明人首次从由土壤中获得的微生物的培养液中发现的以往未知的新糖，以葡萄糖作为组成糖的环状的五糖或六糖只要具有上述结构，无论其来源，形态，纯度，制备方法，都包含于本发明中。
本发明中所谓的异环麦芽寡糖合酶，是指作用于葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖，催化分子间转移反应中在α-1，4葡聚糖的非还原末端葡萄糖的4位上通过α-1，4转移，生成各种葡萄糖聚合度的α-1，4葡聚糖的歧化反应，另一方面，在作用于葡萄糖聚合度为7的α-1，4葡聚糖(麦芽七糖)时，其催化在麦芽六糖单位切断，通过该麦芽六糖的还原末端葡萄糖的1位α-1，6转移到同一分子的非还原末端葡萄糖的6位羟基上的分子内转移反应而环化生成异环麦芽六糖的反应，在作用于葡萄糖聚合度为8的α-1，4葡聚糖时，催化在麦芽五糖或麦芽六糖单位切断，通过该麦芽五糖或麦芽六糖的还原末端葡萄糖的1位α-1，6转移到同一分子的非还原末端葡萄糖的6位羟基上的分子内转移反应而环化生成异环麦芽五糖或异环麦芽六糖的反应的所有酶。催化上述反应的酶无需区别其来源，形态，粗酶或纯化酶都包含于发明的异环麦芽寡糖合酶中。
本发明中的异环麦芽寡糖合酶的酶活性可以以如下方式测定。使直链淀粉以1.25w/v％的终浓度溶解于含有1mM氯化钙的50mM醋酸缓冲液(pH6.0)中，以之作为底物液，在0.8ml该底物液中加入0.2ml酶液，在30℃下进行30分钟酶反应，在约100℃下对该反应液加热10分钟，使反应停止后，通过每1g固体物质加入4000单位的α-葡糖苷酶且每1g固体物质加入250单位的葡萄糖淀粉酶，50℃下处理1小时，从而分解残存的可溶性淀粉和夹杂的寡糖，用后述实验1记载的HPLC定量该处理液中的异环麦芽五糖量。异环麦芽寡糖合酶活性的1单位定义为在上述条件下1分钟内生成1μmol的异环麦芽五糖的酶量。
作为本发明的异环麦芽寡糖合酶的具体例，可以例举有例如具有下述物化性质的异环麦芽寡糖合酶。
(1)分子量在SDS-凝胶电泳法中，分子量为106000±20000道尔顿。
(2)等电点通过含有两性电解质(Ampholine)的等电点电泳法中，pI7.5±0.5。
(3)最适温度在pH6.0、反应30分钟的条件下，最适温度为50℃至55℃。
(4)最适pH在30℃、反应30分钟的条件下，最适pH为pH4.5至8.0。
(5)温度稳定性在pH6.0下保持60分钟的条件下，在35℃以下稳定，1mM钙离子存在下，在40℃以下稳定。
(6)pH稳定性于4℃下保持24小时的条件下，在pH4.5至9.0的范围内稳定。
此外，一种具有上述物化性质的本发明的异环麦芽寡糖合酶，也存在不仅具有上述物化性质，而且具有序列表中的序列号1表示的氨基酸序列作为其N末端序列的情况。
本发明的异环麦芽寡糖合酶通常具有规定的氨基酸序列，作为其中的一个例子，可以例举有，例如序列表中序列号2表示的氨基酸序列或与之相同的氨基酸序列。作为具有与序列表中序列号2表示的氨基酸序列相同的氨基酸序列的变异体酶，可以例举有在保持作用于葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖，生成通式1表示的异环麦芽寡糖的酶活性的范围内，具有序列号2表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或2个以上的氨基酸的氨基酸序列的酶，通常，合适的是对于序列号2表示的氨基酸序列具有60％以上，优选70％以上，更优选80％以上，最优选90％以上的同源性的氨基酸序列的酶。
不过，具有上述物化性质或氨基酸序列的异环麦芽寡糖合酶只不过是一例，具有与上述不同的物化性质或N末端氨基酸序列的酶，只要生成异环麦芽寡糖，当然也包含于本发明中。
本发明的异环麦芽寡糖合酶不受其来源的限制，作为优选的来源，可以例举有微生物，尤其适合使用由本发明人从土壤中分离的微生物AM7株或其变异株。以下，显示的是具有异环麦芽寡糖合酶产生能力的微生物AM7株的鉴定试验结果。并且，鉴定试验按照《微生物的分类和鉴定》(长谷川武治编，学会出版中心，1985年)进行。
<A细胞形态>
(1)肉汤琼脂培养，27℃通常为0.5×2至0.7×5μm的杆菌。革兰氏阳性。具有运动性。具有椭圆形的孢子。在菌体的端点形成膨胀的孢子囊。
<B培养性质>
(1)肉汤琼脂平板培养，27℃形状圆形，大小为3天内为1-2mm。
周缘完整的边缘隆起扁平状光泽钝光表面粗糙色调不透明，白色(2)肉汤琼脂斜板培养，27℃生长中等程度形状丝状<C生理学性质>
(1)VP试验阴性(2)过氧化氢酶阳性(3)淀粉的加水分解阳性(4)酪氨酸的分解阴性(5)苯丙氨酸脱氨化阴性(6)硝酸的还原阳性(7)由D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露醇生成酸(8)生长的范围pH5.7-9.8，温度10-37℃，NaCl浓度为0-2％(9)对氧的状态通性厌氧性(10)DNA的GC含量50.7％基于以上的菌学性质，参考《柏捷氏细菌分类学手册》(Bergey’sManual of Systematic Bacteriology)，第2卷(1986年)，研究了其与公知菌的异同。其结果是，判断为本菌是属于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)属的微生物。根据这些结果，本发明人等将本菌命名为新型微生物环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7，于平成16年8月25日以保藏号FERM BP-10111保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所在的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
本发明的具有异环麦芽寡糖合酶产生能力的微生物中包含上述菌本身，其变异株，进而还包括具有异环麦芽寡糖合酶产生能力的其它微生物和其变异株等。
所谓本发明的DNA，是指编码上述异环麦芽寡糖合酶的所有DNA。本发明的DNA只要是编码异环麦芽寡糖合酶的DNA，其可以是天然来源的DNA，也可以是人工合成的DNA。作为天然的来源，可以例举有例如包括环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)的杆菌属的微生物，可以从这些菌体中获得含有本发明的DNA的基因DNA。也就是说，将这些微生物接种于营养培养基中，在需氧条件下培养约1至3天后，从培养物中收集菌体，通过用溶菌酶或β-葡聚糖酶等溶解细胞壁的酶或超声波进行处理，使含有该DNA的基因溶出到菌体外。此时，也可以组合使用蛋白酶等蛋白质水解酶，或使SDS等表面活性剂共存下进行冻融。如果对这样得到的处理物例如使用酚萃取、醇沉淀、离心分离、核酸酶处理等通常用的方法，可以得到目的基因DNA。为了人工合成本发明的DNA，例如可以根据序列表中序列号2所示的氨基酸序列进行化学合成。另外，也可以以含有该DNA的基因DNA作为模板，使用作为适当引物的化学合成DNA，有效实施PCR合成。
本发明的DNA通常具有规定的碱基序列，作为其的一个例子，可以例举有，例如序列表中序列号3表示的碱基序列或与之相同的碱基序列。作为具有与序列表中序列号3表示的碱基序列相同的碱基序列的变异体DNA，可以例举有在保持编码酶的活性的范围内，具有序列号3表示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或2个以上的碱基的碱基序列的DNA，通常，合适的是对于序列号3表示的碱基序列具有60％以上，优选70％以上，更优选80％以上，最优选90％以上的同源性的碱基序列的DNA。此外，基于基因编码的简并，不改变其编码的酶的氨基酸序列且1个或2个以上的碱基被取代为其它碱基的DNA当然也包含于本发明的DNA中。
通过在可自我复制的合适载体中插入本发明的DNA可以有效实施重组DNA。重组DNA通常由DNA和可以自我复制的载体组成，如果可以获得DNA，就可以比常规方法的重组DNA技术更容易地制备重组DNA。作为这种载体的例子，可以例举有，例如pBR 322、pUC18、pBluescriptII SK(+)、pUB110、pTZ4、pC194、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7等质粒载体和λgt·λC、λgt·λB、p11、φ1和φ105等噬菌体载体。其中，用大肠杆菌表达本发明的DNA时，pBR 322、pUC18、Bluescript IISK(+)、λgt·λC和λgt·λB合适，另一方面，用枯草杆菌表达时，pUB110、pTZ4、pC194、p11、φ1和φ105合适。pHV14、TRp7、YEp7和pBS7在二种以上的宿主内使重组DNA复制时有用。为了在上述载体中插入DNA，可以采用该领域中通常用的方法。具体来说，首先将含有DNA的基因和可自我复制的载体用限制酶和/或超声波切断，然后对生成的DNA片段和载体片段进行连接。如果利用对基因和载体切断处核苷酸特异性作用的限制酶，特别是II型限制酶，详细地讲如果使用Sau 3AI、Eco RI、Hind III、Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I、Pst I等，容易对DNA片段和载体片段进行连接。根据需要，可以将两者进行退火后，在生物体内或生物体外使DNA连接酶作用。这样得到的重组DNA导入适宜宿主之后，作成转化体，对其进行培养，可以无限复制。
这样获得的重组DNA可以导入于以大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、酵母为代表地合适的宿主微生物中。为了获得转化体，可以使用菌落杂交法，也可以在含有聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的营养培养基中进行培养，选择由该糖生成异环麦芽寡糖的转化体。
用于包含本发明的具有异环麦芽寡糖合酶产生能力的转化体的微生物的培养的培养基如果是微生物可以生长，可以是产生异环麦芽寡糖合酶的营养培养基，也可以是合成培养基和天然培养基的任一种。作为碳源，如果是微生物生长可以利用的物质，可使用例如植物来源的淀粉或フイトゲリコ一ゲン，动物或植物来源的糖原或支链淀粉，和其部分分解物或葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇，糖蜜等糖类，以及柠檬酸，琥珀酸等有机酸。这些碳源在培养基中的浓度可以通过碳源的种类进行适当选择。作为氮源，可以适当使用例如铵盐，硝酸盐等无机氮化合物以及例如尿素，玉米浆，酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物，肉汤等含氮有机物。此外，作为无机成分，可以适当使用例如钙盐，镁盐，钾盐，钠盐，磷酸盐，锰盐，锌盐，铁盐，铜盐，钼盐，钴盐等盐类。进而，根据需要，可以适当使用氨基酸，维生素等。
培养通常在选自于温度为15至37℃，pH在5.5至10的范围内，优选温度为20-34℃下，pH5.5-8.5的范围内的条件下进行需氧培养。培养时间如果是该微生物可以增殖的时间，优选为10小时至150小时。此外，培养条件中培养液的溶解氧浓度没有特别的限定，通常，优选为0.5-20ppm。为此，适当采用调节通气量，或是搅拌等手段。此外，培养方式可以是分次培养或连续培养中的任一种方式。
这样培养微生物后，回收含有本发明的酶的培养物。主要在培养物的除菌液中发现了异环麦芽寡糖合酶活性，可以收集除菌液作为粗酶液，也可以使用所有培养物作为粗酶液。为了从培养物中除去菌体，可以采用公知的固液分离法。例如，可以适当采用将培养物本身离心分离的方法或使用预涂滤器过滤培养物等过滤分离的方法，通过平膜、中空纤维膜等膜过滤分离的方法等。尽管除菌液可以原封不动的用作粗酶液，但一般可浓缩使用。作为浓缩法，可以采用例如硫酸氨盐析，丙酮和乙醇沉淀，使用平膜、中空纤维膜等的膜浓缩法等。
进而，还可以使用具有异环麦芽寡糖合酶活性的除菌液及其浓缩液，通过公知的方法进行固定。例如，可以适当与离子交换体的结合法，树脂和膜等的共价键结合和吸收法，以及利用高分子物质的内包法。
如上所述，本发明的异环麦芽寡糖合酶，可照原样或经浓缩使用其粗酶液，但是根据需要，也可以通过公知的方法，再分离纯化后使用。例如，对通过硫酸氨盐析培养液的处理物浓缩的粗酶制品进行透析后，通过使用“DEAE Toyopearl 650S”树脂的阴离子交换柱层析、接着采用“Phenyl-Toyopearl 650M”树脂的疏水性层析进行纯化，可以获得作为在电泳中单一的酶的本发明的异环麦芽寡糖合酶。
异环麦芽寡糖合酶为重组型酶时，根据宿主的种类不同，酶会积蓄在菌体中。这种情况下，可以原样使用菌体或培养物，但是，通常也可以有效实施以下方法在使用前，根据需要，通过渗压休克或表面活性剂从菌体中提取后，或通过超声波或细胞壁溶解酶破碎菌体后，通过过滤，离心分离等从菌体或菌体破碎物中分离重组型酶后，再使用。
这样获得的异环麦芽寡糖合酶，具体而言，也存在具有以下物化性质的情况。
(1)分子量在SDS-凝胶电泳法中，分子量为106000±20000道尔顿。
(2)等电点通过含有两性电解质的等电点电泳法中，pI7.5±0.5。
(3)最适温度在pH6.0、反应30分钟的条件下，最适温度为50℃至55℃。
(4)最适pH在30℃、反应30分钟的条件下，最适pH为pH4.5至8.0。
(5)温度稳定性在pH6.0下保持60分钟的条件下，在35℃以下稳定。
在1mM钙离子存在下，在40℃以下稳定。
(6)pH稳定性于4℃下保持24小时的条件下，在pH4.5至9.0的范围内稳定。
(7)N末端氨基酸序列具有序列表中序列号1表示的氨基酸序列，也就是丙氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-苏氨酸-缬氨酸-苏氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-蛋氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-精氨酸-苯丙氨酸的氨基酸序列。
作为本发明的异环麦芽寡糖合酶的底物的葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖，可以例举有淀粉，直链淀粉，支链淀粉，糖原等，和由淀粉酶或酸等对它们加水分解获得的淀粉糊精，麦芽糖糊精，麦芽寡糖等部分分解物。作为用淀粉酶分解的分解物，可以使用利用例如Handbook of Amylases and Related Enzymes(1988年)パ-ガモン·Press公司(东京)(1988年)记载的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、麦芽四糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.60)、麦芽五糖生成淀粉酶、麦芽六糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.98)等淀粉酶来分解淀粉，直链淀粉，支链淀粉，糖原等获得的部分分解物。另外，在制备部分分解物时也可以使支链淀粉酶(3.2.1.41)、异淀粉酶(EC 3.2.1.68)等淀粉脱支酶随意作用。
作为底物的淀粉，例如可以使用玉米、小麦、米等来源的地上淀粉，也可以使用土豆、甘薯、木薯等来源的地下淀粉，优选使用淀粉经糊化和/或液化的溶液。由于该淀粉部分分解的程度越低，异环麦芽寡糖的产率越高，因此DE在约20以下、优选在约12以下、更优选在约5以下的部分分解物合适。并且，本说明书中所谓的异环麦芽寡糖生成率是指用下式计算的值异环麦芽寡糖生成率(％)＝{(生成的异环麦芽寡糖的质量)/(反应液中的所有糖的质量)}×100。
在使本发明的异环麦芽寡糖合酶作用于底物时，其底物的浓度没有特别的限定，例如，即使在使用底物浓度为0.1％(w/v)的较低浓度溶液时，本发明的异环麦芽寡糖合酶反应也可进行，生成异环麦芽寡糖。工业上，底物浓度为1％(w/v)以上合适，在该条件下，可以有效生成异环麦芽寡糖。可以在反应温度，也就是进行反应的温度，即55℃附近下进行。优选使用30至45℃附近的温度。反应pH通常可以调整到4.5至8的范围内，优选是将pH调整到5.0至7.5的范围内。酶的使用量与反应时间紧密相关，可以通过作为目的的酶反应的进行适当选择。
例如，通过使本发明的异环麦芽寡糖合酶作用于底物浓度为0.1％(w/v)的淀粉或其部分分解物或支链淀粉的水溶液，可以从淀粉或其部分分解物以约20％，从支链淀粉中以约30％的高异环麦芽寡糖生成率获得本发明的异环麦芽寡糖。由该异环麦芽寡糖合酶产生异环麦芽寡糖的生成机制推测如下。
(1)该酶作用于作为底物的葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖，分子间转移反应中，在α-1，4葡聚糖的非还原末端的4位羟基上通过α-1，4转移产生的歧化反应，生成各种葡萄糖聚合度的α-1，4葡聚糖。
(2)该酶作用于葡萄糖聚合度为7的α-1，4葡聚糖(麦芽七糖)时，在麦芽六糖单位切断，通过将该麦芽六糖的还原末端葡萄糖的1位转移到同一分子的非还原末端葡萄糖的6位羟基上的分子转移反应进行环化，生成异环麦芽七糖和麦芽糖。
(3)该酶作用于葡萄糖聚合度为8以上的α-1，4葡聚糖时，在麦芽五糖或麦芽六糖单位切断，通过该麦芽五糖或麦芽六糖的还原末端葡萄糖的1位α-1，6转移到同一分子的非还原末端葡萄糖的6位羟基上的分子内转移反应而环化，生成异环麦芽五糖或异环麦芽六糖和葡萄糖聚合度减少5或6的α-1，4葡聚糖。
(4)(2)和(3)中新产生的麦芽糖和α-1，4葡聚糖，由于再次受到(1)-(3)的反应，而生成异环麦芽寡糖。
此外，在该异环麦芽寡糖生成反应时，也可以有效实施通过与其它酶合用，使异环麦芽寡糖生成率提高。例如，可以有效实施通过联合使用异环麦芽寡糖合酶和异淀粉酶或支链淀粉酶等淀粉脱支酶，使之作用于淀粉，从而使异环麦芽寡糖生成率进一步提高。
也可以原样使用由上述反应获得的反应液作为含有异环麦芽寡糖的糖液。此外，根据需要，也可以使选自于α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的1种或2种以上的酶作用于含有异环麦芽寡糖的糖液，加水分解夹杂的寡糖，以其作为含有异环麦芽寡糖的糖液来使用。此外，还可随意实施通过添加氧将反应液中残留的还原性糖转换为糖醇，使还原力消失等进一步的加工处理。一般是，可以进一步纯化含有异环麦芽寡糖的糖液，再使用。作为纯化方法，可以适当采用糖纯化中通常使用的方法，例如可以适当采用用活性炭进行脱色，用H型，OH型离子交换树脂脱盐，通过离子交换柱层析，活性炭柱层析，硅胶柱层析等柱层析进行分级，用乙醇和丙酮等有机溶剂分级，用具有适度分离性能的膜进行分离，进而通过不利用异环麦芽寡糖而吸收分解夹杂的糖类的微生物，例如酵母等进行发酵处理，或通过碱处理等分解除去残留的还原性糖等一种或两种以上的纯化方法。
尤其是，作为工业的大量生产方法，采用离子交换柱层析是合适的。例如，例如通过使用特开昭58-23799号公报、特开昭58-72598号公报等中公开的使用强酸性阳离子交换树脂的柱层析除去夹杂的糖，可以有效制造含有使目的物含量提高的异环麦芽寡糖或含有该糖的糖类。此时，可以随意采用固定床方式、移动床方法、类似移动床方法中的任一种方法。
这样得到的含有异环麦芽寡糖的水溶液或使其含量提高的糖水溶液，通常是含有相当于固体的10质量％以上，优选40质量％以上的异环麦芽寡糖的糖水溶液，通常，将其浓缩，做成糖浆状制品。这种糖浆状制品，可以再干燥，随意制成非晶质固状物制品或非晶质粉末状制品。
此外，由于本发明的异环麦芽寡糖具有包合能力，防止包合的香味成分、有效成分等挥散、防止品质劣化，因此在稳定，保持香味成分、有效成分方面极为优异。此时，根据需要，可以通过联合使用环糊精类、分支环糊精类、葡萄糖4分子通过α-1，3和α-1，6结合而相互结合的环状四糖、分支环状四糖类、葡萄糖4分子通过α-1，4和α-1，6结合而相互结合的环状麦芽糖基麦芽糖，环葡聚糖类，环果聚糖类等其它环状糖，通过包合能力有效实施稳定性的强化。作为环糊精类等环状糖，不必限定于高纯度的糖，也可以利用低纯度的环状糖、例如大量麦芽糊精以及含有各种环状糖的淀粉部分分解物。
而且，由于本发明的异环麦芽寡糖无法被α-淀粉酶或α-葡糖苷酶实质上分解，即使口服也无法消化吸收，是一种难消化性的糖，是一种无毒，无害的新型糖。
因此，本发明的异环麦芽寡糖或含有该糖的糖可以作为甜味剂、调味剂、品质改良剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂等有效应用于饮食品、嗜好品、饲料、饵料、化妆品、药品等各种组合物中。
本发明的异环麦芽寡糖或含有该糖的糖可以原样作为用于添加甜味的调味料来使用。如果需要，也可以与例如粉饴、葡萄糖、异构化糖、砂糖、麦芽糖、海藻糖、蜂蜜、枫糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、二氢查尔酮、蛇菊甙、α-葡糖基蛇菊甙、罗汉果甜味物、甘草甜素、ソ-マチン、sucralose、L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、甘氨酸、丙氨酸等其它甜味剂，和糊精、淀粉、乳糖等增量剂混合使用。
此外，可以照原样使用本发明的异环麦芽寡糖或含有该糖的糖的粉末状制品，或者根据需要，与增量剂，赋形剂，结合剂等混合后，随意做成颗粒、球状、短棒状、板状、立方体、片剂等各种形状再使用。
使用本发明的异环麦芽寡糖或含有该糖的糖的甜味与具有酸味、咸味、涩味、香味、苦味等其它味道的各种物质充分调和，因为耐酸性、耐热性强，所以可以在使一般食品附上甜味、改善味道、改善品质等中有效利用。
例如，可以作为酱油、粉末酱油、大酱、粉末大酱、未过滤的酒(もろみ)、酱菜、(撒在饭上)粉状食品、蛋黄酱、调味品、食用醋、三杯醋、粉末饭卷醋、中国调料、天夫罗汁、面汁、酱汁、番茄酱、烧肉料汁、咖哩汤、炖(焖)食品的调料、汤料、汤汁调料、复合调味料、日式料酒、新日式料酒、餐用糖、咖啡用糖等各种调味料的甜味剂，并且也可以作为味道改良剂、品质改良剂等有效实施。另外，可以在向例如干米饼、小方块糯米点心、米花糖、求肥(皮糖样点心)、饼类、豆沙包、米粉糕、馅类、羊羹、水羊羹、锦玉、果冻、蛋糕、麦芽糖球等各种日本点心、面包、饼干、椒盐饼干、小糖饼、馅饼、布丁、加糖奶油浆、蛋奶羹、奶油填馅点心、华夫饼干、海棉状点心、炸面圈、巧克力、口香糖、焦糖、牛轧糖、水果糖等各种洋点心、冰淇淋、雪糕等冰糕、果汁、冰蜜汁类、花酱、花生酱、果泥等酱类、果子酱、橘子果酱、成果酱、糖果等果实、蔬菜的加工食品类、什锦酱菜、暴腌的成甜萝卜、千枚渍、腌野薤等腌物类、日本罗卜咸菜素、腌白菜素等腌物的素、火腿、香肠等畜肉制品类、鱼肉火腿、鱼肉香肠、鱼糕、筒状鱼卷、炸虾(鱼)等鱼肉制品、海胆、咸乌贼、醋海带、尖墨鱼干、料酒浸的河豚干、鳕、真鲷、虾等田麸等各种珍味类、用海苔、野菜、墨鱼干、小鱼、贝等制造的用调料煮的制品类、煮豆、土豆沙拉、海带卷等家常菜食品、乳制品、鱼肉、畜肉、果实、蔬菜罐头、罐装类、合成酒、增酿酒、清酒、果酒、发泡酒、啤酒等酒类、咖啡、可可、果汁、碳酸饮料、乳酸饮料、乳酸菌饮料等清凉饮料、预混合料、热饼混合料、即饮饮料、即饮咖啡、即饮小豆汤、即饮汤等方便食品、另外断奶食品、治疗食品、健康饮料、肽食品、冷冻食品等各种饮食物给予甜味、味道改良，品质改良等中有效实施。
另外也可以用于提高家畜、家禽、以及其它的蜜蜂、蚕、鱼等饲养动物的饲料、饵料等嗜好性为目的的用途中。此外，可以作为香烟、牙膏、口红、唇膏、内服液、片剂、口含片、肝油糖球、口腔清凉剂、口腔香剂、漱口剂等各种固体物质、膏状、液体状等嗜好物、化妆品、药品等各种组合物的甜味剂、或味道改良剂、矫味剂、以及作为品质改良剂、稳定剂等有效利用。
作为品质改良剂、稳定剂，可以有效利用于容易失去有效成分、活性等各种生理活性物质或含有这些物质的健康食品、药品等中。例如，干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、巨噬细胞游走抑制因子、神经刺激因子、转移因子、白介素II等淋巴因子含有液；胰岛素、生长激素、催乳激素、促红细胞生成素、卵细胞刺激激素等激素含有液；BCG疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、小儿麻痹疫苗、天花疫苗、破伤风类病毒、蛇毒抗毒素、人免疫球蛋白等生物制剂含有液；青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素、硫酸卡那霉素等抗生素含有液；硫胺素、核黄素、L-抗坏血酸、肝油、胡萝卜素、麦角甾醇、生育酚等维生素含有液；EPA、DHA、花生四烯酸等高度不饱和脂肪酸或其酯的衍生物；脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白激酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等酶含有液；药用人参提取物、甲鱼提取物、小球藻提取物、芦荟提取物、蜂胶提取物等提取物等，病毒、乳酸菌、酵母等活菌糊，蜂王浆等各种生理活性物质、可以容易地制成不失去其有效成分、活性，而且稳定的高品质液体状、膏状或固状健康食品和药品等。
作为使上述那样的各种组合物中含有异环麦芽寡糖或含有该糖的糖的方法，只要是包括在直至完成该制品的工序中都可以，例如可以适宜选择混合、混揉、溶解、熔融、浸渍、浸透、散布、涂布、包衣、喷雾、注入、结晶、固化等众所周知的方法。其量通常含有0.1质量％以上合适，优选含有1质量％以上合适。
以下根据实验对本发明进行详细的说明。
<实验1非还原性糖的制备>
将由1.5％(w/v)淀粉部分分解物(商品名“パインデツクス#4”，松谷化学工业株式会社制造)、0.5％(w/v)酵母提取物(商品名“ポリペプトン(POLYPEPTON)”，日本制药株式会社制造)、0.1％(w/v)酵母提取物(商品名“酵母エキスS”，日本制药株式会社制造)、0.1％(w/v)磷酸二钾、0.06％(w/v)磷酸一钠·2水合物、0.05％(w/v)硫酸镁·7水合物、0.3％(w/v)碳酸钙和水构成的液体培养基以平均30ml装入到10个容量为500ml的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却。然后，接种环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)，于27℃、230rpm下进行120小时旋转振荡培养。培养后，离心分离(8000rpm，20分钟)，除去菌体，获得了培养上清(约0.3L)。使用0.25L获得的培养上清作为酶液，将其添加于0.25L含有2％(w/v)淀粉酶和2mM氯化钙的50mM醋酸缓冲液(pH6.0)中，使之于40℃反应48小时后，通过于约100℃热处理10分钟停止反应。
接着，为了将夹杂的还原糖加水分解成葡萄糖，用盐酸将上述反应物调整成pH5.0后，每1g固体物质加入400单位的α-葡糖苷酶(商品名糖苷转移酶L“AMANO”，天野エンザイム株式会社制)和每1g固体物质添加25单位的葡萄糖淀粉酶(ナガせ生化学工业株式会社销售)，使之于50℃反应24小时。反应后，通过于约100℃热处理10分钟使反应停止。通过分析用高效液相色谱(以下，简称HPLC。)分析获得的反应液中的糖，结果检测出洗脱时间为57.3分钟的葡萄糖，洗脱时间为43.7分钟的糖(以下，简称为糖I)，洗脱时间为37.1分钟的糖(以下，简称为糖II)。各个组成葡萄糖为73.3％，糖I为24.2％，糖II为2.5％。
并且，分析HPLC，在柱中串联连接上两个“MCIgel CK04SS”(三菱化学株式会社制)，用水作为洗脱液，在柱温度80℃，流速0.4ml/分钟的条件下进行，用差示折射仪RID-10A(株式会社岛津制作所制造)进行检测。
接着，通过过滤除去上述的反应液中的不溶物后，用三菱化学制离子交换树脂“(Diaion SK-1B)”和“Diaion WA30”以及Organo公司制造的阴离子交换树脂(IRA411)脱色，脱盐，浓缩，精密过滤后，采用调制用HPLC分级，结果，葡萄糖在29分钟至40分钟的洗脱时间洗脱，糖I在57分钟至75分钟的洗脱时间洗脱，糖II在120分钟至180分钟的洗脱时间洗脱。分别回收糖I和糖II的级分，精密过滤后，通过真空干燥，获得了约850mg固体物质的糖I，100mg固体物质的糖II。并且，使用“ODS-AQ R-355-15AQ”柱(YMC株式会社)，使用7.5％(v/v)甲醇作为洗脱液，在柱温度25℃，流速20ml/分的条件下进行调制用HPLC。
用分析HPLC研究获得的糖I和糖II制品的糖组成，结果表明，如图1和图2所示，糖I和糖II的含量均在97％以上，纯度极高。
此外，用Somogyi-Nelson’s法测定糖I和糖II制品的还原力，结果表明两制品的还原力在检测界限以下，糖I和糖II基本上是非还原性的。
<实验2糖I的结构分析>
<实验2-1质量分析>
对于实验1的方法获得的糖I制品，使用质量分析装置“LCQ-Advantage”(サ一モエレクトロン公司制)进行质量分析，结果显著地检测出质量数为833的钠添加分子离子，判明糖I的质量数为810。
<实验2-2组成糖分析>
对于实验1的方法获得的糖I制品，按照常规方法，用硫酸加水分解成单糖，用气相色谱法研究组成糖，结果只检测出D-葡萄糖，判明只有D-葡萄糖为糖I的组成糖。如果考虑上述的质量数，表明糖I为由5分子D-葡萄糖构成的环状糖。
<实验2-3甲基化分析>
对于实验1的方法获得的糖I制品，按照常规方法，进行甲基化分析，用气相色谱法研究甲基化物。结果汇集在表1中。
根据表1的结果，表明2，3，4-三甲基化物与2，3，6-三甲基化物的比率大约为1∶4，因此构成糖I的5分子D-葡萄糖中，1分子在1位和6位葡糖苷结合，而且其它4分子在1位和4位葡糖苷结合。
<实验2-4核磁共振分析>
使用实验1的方法获得的糖I制品，按照常规方法，进行核磁共振(NMR)分析。1H-NMR谱示于图3，13C-NMR谱示于图4。在1H-NMR谱中约5.07ppm的信号，约5.00ppm的信号，约4.99ppm的信号，约4.98ppm的信号和约4.87ppm的信号归属于D-葡萄糖残基的1位质子，求出其spin-spin结合常数，为约3.49Hz(约5.07ppm的信号)，约3.86Hz(约5.00ppm的信号)，约2.39Hz(约4.99ppm的信号)，约2.94Hz(约4.98ppm的信号)和约3.31Hz(约4.87ppm的信号)，由此判明结合1，4葡糖苷的D-葡萄糖残基的1位的异头物型和结合1，6葡糖苷的D-葡萄糖残基的1位的异头物型均为α型。
根据以上的结果，判明糖I为具有图5所示的环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1)}结构的环状五糖，即异环麦芽五糖。具有这种结构的糖是以往未知的，本发明的异环麦芽五糖是新的环状糖。
<实验3糖II的结构分析>
<实验3-1质量分析>
对于实验1的方法获得的糖II制品，使用质量分析装置“LCQ-Advantage”进行质量分析，结果显著地检测出质量数为995的钠添加分子离子，判明糖II的质量数为972。
<实验3-2组成糖分析>
对于实验1的方法获得的糖II制品，按照常规方法，用硫酸加水分解成单糖，用气相色谱法研究组成糖，结果只检测出D-葡萄糖，判明只有D-葡萄糖为糖II的组成糖。如果考虑上述的质量数，表明糖II为由6分子D-葡萄糖构成的环状糖。
<实验3-3甲基化分析>
对于实验1的方法获得的糖II制品，按照常规方法，进行甲基化分析，用气相色谱法研究甲基化物。结果汇集在表2中。
根据表2的结果，表明2，3，4-三甲基化物与2，3，6-三甲基化物的比率大约为1∶5，因此构成糖II的6分子D-葡萄糖中，1分子在1位和6位葡糖苷结合，而且其它5分子在1位和4位葡糖苷结合。
<实验3-4核磁共振分析>
使用实验1的方法获得的糖II制品，按照常规方法，进行核磁共振(NMR)分析。1H-NMR谱示于图6，13C-NMR谱示于图7。在1H-NMR谱中约5.20ppm的信号，约5.00ppm的信号，约4.99ppm的信号，约4.97ppm的信号，约4.96ppm的信号和4.86ppm的信号归属于D-葡萄糖残基的1位质子，求出其spin-spin结合常数，为约3.49Hz(约5.20ppm的信号)，约2.57Hz(约5.00ppm的信号)，约3.13Hz(约4.99ppm的信号)，约4.04Hz(约4.97ppm的信号)，约3.86Hz(约4.96ppm的信号)和约3.86Hz(约4.86ppm的信号)，由此判明结合1，4葡糖苷的D-葡萄糖残基的1位的异头物型和结合1，6葡糖苷的D-葡萄糖残基的1位的异头物型均为α型。
根据以上的结果，判明糖II为具有图8所示的环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}结构的环状六糖，即异环麦芽六糖。具有这种结构的糖是以往未知的，本发明的异环麦芽六糖是新的环状糖。
<实验4异环麦芽寡糖合酶的生产>
将实验1记载的液体培养基以每瓶100ml装入两个500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却。然后，接种环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)，于27℃、230rpm下进行48小时旋转振荡培养。
将20L与起子培养组成相同的液体培养基装入在容量为30L发酵器中，加热灭菌，冷却，温度到27℃后，接种约200ml起子培养液，边保持温度27℃、pH6.0～8.0，边通气搅拌培养96小时。培养后，从发酵器中取出培养液，通过离心分离(8000rpm，20分钟)除去菌体，获得约18L培养上清。对于培养液和培养上清，测定异环麦芽寡糖合酶活性，结果清楚了培养液中含约0.027单位/ml的酶活性，上清中含有约0.025单位/ml的酶活性，判明了由环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)产生的异环麦芽寡糖合酶大部分存在于菌体外。
<实验5异环麦芽寡糖合酶的纯化>
通过在实验4获得的培养上清中，在约10L(总活性为约250单位)中以终浓度80％饱和来添加硫酸铵，于4℃放置24小时，进行盐析。通过离心分离(11000rpm，30分钟)回收生成的盐析沉淀物，将其溶解于10mM醋酸缓冲液(pH6.0)中后，对同一种缓冲液进行透析，获得约240ml的粗酶液。粗酶液中的异环麦芽寡糖活性为0.96单位/ml(总活性为约230单位)。将该粗酶液提供给采用东曹株式会社制造的“DEAE-Toyopearl 650S”凝胶的离子交换层析(凝胶容量为120ml)。使异环麦芽寡糖合酶活性的某个级分不吸附于经10mM醋酸(pH6.0)平衡的“DEAE-Toyopearl 650S”凝胶，洗脱出非吸附的级分。回收该活性级分，以达到1M的终浓度添加硫酸铵，于4℃放置24小时后，通过离心分离除去不溶物，提供给采用东曹株式会社制造的“Buthyl-Toyopearl 650M”凝胶的疏水层析(凝胶容量为60ml)。使异环麦芽寡糖合酶活性的某个级分吸附于经含有1M硫酸铵的10mM醋酸(pH6.0)平衡的“Buthyl-Toyopearl 650M”凝胶，以硫酸铵浓度为1M至0M的线性梯度洗脱，结果在硫酸铵浓度为约0.1M左右洗脱出来。在这种纯化的各步骤中异环麦芽寡糖合酶的活性，比活性和产率示于表3。
用以5-20w/v％浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的异环麦芽寡糖合酶制品的纯度，结果蛋白条带是均一的，是高纯度的制品。
<实验6异环麦芽寡糖合酶的性质>
<实验6-1分子量>
将实验5的方法纯化得到的异环麦芽寡糖合酶制品提供给SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(5-20w/v％浓度梯度)，同时与泳动的分子量标记(日本バイオ·ラツド·ラボラトリ-ズ株式会社制造)进行比较，测定分子量，结果判明来自异环麦芽寡糖合酶的分子量为106000±20000道尔顿。
<实验6-2等电点>
用实验5的方法纯化得到的异环麦芽寡糖合酶制品提供给含有2.2w/v％两性电解质(Amersham pharmacia bioscience(株)制造)的等电点聚丙烯酰胺凝胶电泳法，同时与电泳的等电点标记(Amershampharmacia bioscience(株)制造)比较，求出等电点，结果判定为异环麦芽寡糖合酶的等电点为pI7.5±0.5。
<实验6-3酶反应的最适温度和最适pH>
使用实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶制品，按照活性测定的方法研究温度对酶活性，pH对酶活性的影响。其结果示于图9(最适温度)，图10(最适pH)。判明在pH6.0，30分钟反应条件下，异环麦芽寡糖合酶的最适温度为50-55℃，在30分钟反应条件下，最适pH为4.5-8.0。
<实验6-4酶的温度稳定性和pH稳定性>
使用实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶制品，研究本酶的温度稳定性和pH稳定性。通过在不存在氯化钙或1mM氯化钙存在下，将酶溶液(10mM醋酸缓冲液，pH6.0)于各温度下保持60分钟，水冷却后，测定残留的酶活性，求出温度稳定性。通过在各pH的100mM缓冲液中将该酶于4℃保持24小时后，将pH调整成6.0，测定残留的酶活性，求出pH稳定性。其结果示于图11(温度稳定性)，图12(pH稳定性)。如图11清楚所示，判明异环麦芽寡糖合酶的温度稳定性，在不存在氯化钙下达到35℃，在存在氯化钙1mM下达到40℃，清楚了该酶的温度稳定性由于钙离子而提高。此外，如图12清楚所示，判明异环麦芽寡糖合酶的pH稳定性在pH4.5-9.0的范围内。
<实验6-5金属盐对酶活性的影响>
使用实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶制品，按照活性测定的方法研究浓度为1mM的各种金属盐存在下金属盐对酶活性的影响。结果示于表4。
根据表4的结果清楚地所示，表明异环麦芽寡糖合酶活性被HgCl2抑制45％，被FeCl3和CuCl2抑制约20％。此外，即使用金属离子的螯合剂EDTA，也会受到较弱抑制。
<实验6-6N末端氨基酸序列>
使用实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶制品，用蛋白测序仪型号492HT(Applyed biosystems公司生产)分析该酶的N末端氨基酸序列，结果表明具有序列表中序列号1表示的氨基酸序列，即丙氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-苏氨酸-缬氨酸-苏氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-蛋氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-精氨酸-苯丙氨酸。
<实验6-7部分氨基酸序列>
取适量实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶制品，对10mMTris-HCl缓冲液(pH9.0)在4℃、18小时透析后，加入相同缓冲液，使蛋白浓度为约1mg/ml。取1ml该溶液，加入20μg的赖氨酰肽链内切酶(和光纯药株式会社销售)，于30℃下保持20小时，加水分解酶蛋白。将加水分解物注入预先用含有10％(v/v)乙腈的0.1％(v/v)三氟乙酸平衡的HPLC用柱(商品名“microbondpack C18柱”，直径3.9mm×长150mm、Waters公司制造)，在流速为0.9ml/分，室温条件下，从0.1％(v/v)三氟乙酸-10％乙腈溶液中，以0.1％(v/v)三氟乙酸-50％(v/v)乙腈溶液的100分钟的线性梯度的条件下通液，分级出肽片段。通过测定波长210nm的吸光度测定从柱洗脱的肽片段。通过测定在波长210nm的吸光度检测从柱子上洗脱下来的肽。用与实验6-6相同的方法分别分析从通液开始约14分钟，约18分钟，约30分钟，约35分钟，约38分钟，约61分钟，约64分钟，约67分钟和约82分钟时洗脱的9种肽片段的氨基酸序列，结果，它们分别具有序列表中序列号4-12表示的氨基酸序列。
<实验7编码异环麦芽寡糖合酶的DNA的克隆和含有该DNA的重组DNA和转化体的制备>
从环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)中克隆编码异环麦芽寡糖合酶的DNA，制备可自我复制的重组DNA，进行编码酶的DNA的碱基序列的测定以及转化体的制备。
<实验7-1染色体DNA的制备>
将由0.25％(w/v)淀粉部分分解物(“パインデツクス#4”，松谷化学工业株式会社制造)、0.2％(w/v)酵母提取物(商品名“酵母エキスS”，日本制药株式会社制造)、0.1％(w/v)磷酸二钾、0.06％(w/v)磷酸一钠·2水合物、0.05％(w/v)硫酸镁·7水合物以及水构成的液体培养基以每100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却之后，接种环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)，于27℃、230rpm下进行5天的旋转振荡培养。
然后使经离心分离从培养物中收集的菌体悬浮于TES缓冲液(pH8.0)，加入0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃温育30分钟。于-80℃下对该处理物冷冻1小时后，加入TSS缓冲液(pH9.0)后，加温至60℃，加入TES缓冲液/酚混合液，于冰水中一边冷却，一边激烈振荡10分钟，经离心分离收集上清。向该上清加入2倍上清容积的冷乙醇，回收沉淀的粗染色体DNA，溶解于SSC缓冲液(pH7.1)后，分别加入7.5μg和125μg核酸酶和蛋白酶，于37℃保持1小时使其反应。向反应物中加入氯仿/异戊醇混合液，对染色体DNA进行提取，加入冷乙醇，收集含有生成染色体DNA的沉淀。将这样得到的纯化染色体DNA溶解于SSC缓冲液(pH7.1)，使终浓度约为1mg/ml，将该溶液于-80℃下冷冻。
<实验7-2通过PCR对部分DNA片段的克隆>
在进行编码异环麦芽寡糖合酶的DNA的克隆前，首先，进行其部分DNA片段的PCR克隆。基于异环麦芽寡糖合酶的N末端氨基酸序列的序列表中序列号1表示的氨基酸序列中第10-15位和第13-18位的氨基酸序列，合成序列表中序列号13和14表示的两种有义引物F1和F2。此外，基于该酶的内部氨基酸序列的序列表中序列号4表示的氨基酸序列中第4-8位和第1-5位的氨基酸序列，合成序列表中序列号15和16表示的两种反义引物R1和R2。通过组合有义引物F1和反义引物R1，以实验7-1获得的染色体DNA作为模板，按照常规方法进行第1轮PCR。接着，以获得的PCR产物作为模板，通过组合有义引物F2和反义引物R2，进行第2轮PCR，结果确认了约200个碱基对和约300个碱基对这两种PCR扩增DNA片段。将PCR扩增DNA片段插入于质粒(商品名pCR-Script Amp SK(+)，Stratagene公司制)的限制性酶Srf I部位后，通过常规的感受态细胞法对感受态细胞(商品名“Epicurian Coli XL2-Blue”，Stratagene·cloning system公司制造)进行转化。用常规的碱-SDS法从获得的转化体中提取重组DNA，选择出携带具有作为目的片段的约300个碱基对的插入片段的重组DNA的转化体。接着，通过常规的双脱氧法分析该重组DNA的碱基序列，结果发现，该重组DNA含有具有序列表中序列号17表示的链长为251个碱基对的碱基序列的DNA。
由于合写于在序列表中序列号17中的氨基酸序列的第37-46位和第47-60位的氨基酸序列与异环麦芽寡糖合酶的部分氨基酸序列的序列表中序列号6和10表示的氨基酸序列完全一致，因此表明上述DNA片段是编码来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7(FERMBP-10111)的异环麦芽寡糖合酶的一部分的DNA片段。
<实验7-3通过菌落杂交法对编码异环麦芽寡糖合酶的DNA的克隆>
取0.1ml由实验7-3制备的纯化染色体DNA溶液，在其中加入约100单位限制性酶Hind III，使之于37℃反应1小时，加水分解染色体DNA后，通过琼脂糖电泳法收集由约5000-9000个碱基对构成的DNA片段。另一方面，通过常规方法使限制性酶Hind III作用，完全切断质粒载体(Stratagene·cloning system公司制造，注册商标“pBluescript II SK(+)”)后，使用0.5μg该被切断的质粒载体和约5μg先前得到的DNA片段，用市售的试剂盒(宝酒造制造，商品名“DNA连接试剂盒”)按照附带的说明书操作，进行连接。用得到的重组DNA通过通常的感受态细胞法转化感受态细胞(商品名“EpicurianColi XL2-Blue”，Stratagene·cloning system公司制造)，制作Hind III染色体DNA文库。
将得到的转化体接种于按照常规方法制备的含有10g/L胰蛋白酶、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、100mg/L氨苄青霉素钠盐以及50mg/L 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷的琼脂平板培养基(pH7.0)，于37℃下培养24小时后，将培养基上形成的约655个菌落固定于尼龙膜(商品名“Hybond-N+”，Amersham制)上。另一方面，用限制性酶Not I和Bam HI消化由实验例7-2制备的重组DNA后，通过常规的琼脂糖凝胶电泳法收集目的片段的约300个碱基对的DNA片段，用DNA标识试剂盒(商品名“DIG DNA Labeling and Detection Kit”，Rosche Diagnostics株式会社售)标识，制成DIG(地高辛配基)标识探针。对前述的固定在尼龙膜上的655株菌落，使用DNA标识探针进行通常的菌落杂交，获得了作为阳性克隆的1种转化体。将该转化体命名为“BAMH1”。
<实验7-4编码异环麦芽寡糖合酶的DNA的碱基序列的测定>
将转化体BAMH1按照常规方法接种于含有100μg/ml氨苄青霉素钠盐的L-肉汤(broth)培养基(pH7.0)，于37℃下进行24小时旋转振荡培养。培养结束后，通过离心分离从培养物中收集菌体，用通常的碱-SDS法提取重组DNA。用通常的双脱氧法对该重组DNA的碱基序列进行分析，表明该重组DNA是来自环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)，含有具有序列表中序列号18所示的链长为2985个碱基对的碱基序列的DNA。如图13所示，在该重组DNA中，该DNA连接在限制酶Hind III识别部位的下游。另一方面，由该碱基序列推定的氨基酸序列是合记于序列号18中的碱基序列，该氨基酸序列与用实验6-6的方法确认的本发明的异环麦芽寡糖合酶的N末端氨基酸序列和用实验6-7方法阐明的部分氨基酸序列、序列表中序列号1和序列号4至12所示的氨基酸序列进行比较时，发现序列表中序列号1所示的氨基酸序列与合记在序列号18的氨基酸序列第36至55位的氨基酸序列完全一致。另外，序列表中序列号4、5、6、7、8、9、10、11和12所示的氨基酸序列分别与合记在序列表中序列号18表示的碱基序列中的氨基酸序列中第126至135、第140至149、第84至93、第152至163、第806至816、第925至939、第94至107、第185至197、和第272至286的氨基酸序列完全一致。以上表明，本发明的异环麦芽寡糖合酶含有序列表中序列号2所示的氨基酸序列，该酶由环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)中序列表中序列号3所示碱基序列的DNA编码。另外，合记在序列表中序列号18中的氨基酸序列的第1至35位的氨基酸序列被推定为该多肽的分泌信号肽序列。从这些事实可以判明，该多肽分泌前的前体由合记在序列表中序列号18中的氨基酸序列构成，该氨基酸序列由序列表中序列号18所示碱基序列编码。将如上所述制备的，确认了其碱基序列的重组DNA命名为“pBAMH1”。
<实验8表达用重组DNApETAM1的制备和由该转化体ETAM1产生重组型异环麦芽寡糖合酶>
将重组DNA“pBAMH1”中的重组型异环麦芽寡糖合酶基因插入于表达载体中，研究重组型异环麦芽寡糖合酶在大肠杆菌中的表达。
<实验8-1表达用重组DNA，pETAM1的制备和转化体ETAM1的制备>
在将pBAMH1中的异环麦芽寡糖合酶基因插入于表达用载体时，在异环麦芽寡糖合酶的结构基因的上游插入限制性酶Nde I识别位点，以消除存在于该结构基因内部的Nde I识别位点为目的通过PCR导入变异。使用pBAMH1作为模板，通过组合基于位于pBAMH1的载体的pBluescript II SK(+)中异环麦芽寡糖合酶的结构基因的上游的碱基序列合成的具有序列表中序列号19所示的碱基序列的有义引物和基于结构基因内部的Nde I识别位点的碱基序列合成的具有序列表中序列号22所示的碱基序列的反义引物，以及组合基于结构基因内部的Nde I识别位点的碱基序列合成的具有序列表中序列号21所示的碱基序列的有义序列和基于位于结构基因的下游的限制性酶Bam HI识别位点的碱基序列合成的具有序列表中序列号23所示的碱基序列的反义引物，进行第1次PCR，获得了扩增的PCR。接着，以获得的扩增的DNA片段作为模板，为了在结构基因的上游导入Nde I识别位点，通过组合基于合成的具有序列表中序列号20表示的碱基序列的有义引物和基于位于结构基因下游的限制性酶Bam HI识别位点的碱基序列合成的具有序列表中序列号23所示的碱基序列的反义引物，进行第2次PCR，扩增在结构基因上有具有目的片段的Nde I识别位点，并且消除了结构基因内部的Nde I识别位点的异环麦芽寡糖合酶基因。将通过常规方法，在用限制性酶Nde I和Bam HI消化的表达用载体pET-38b(+)(Novagene公司制)中整合了上述扩增的DNA而获得的重组DNA命名为“pETAM1”。pETAM1示于图14。用pETAM1转化对大肠杆菌JM109(东洋纺株式会社售)，从得到的转化体中制备pETAM1，通过转化表达用宿主大肠杆菌BL21(DE3)(Novagene公司制)，从而制备转化体“ETAM1”。
<实验8-2由转化体ETAM1生产重组型异环麦芽寡糖合酶>
将由10g/L胰蛋白酶(商品名“Bacto-tryptone”，Difco公司售)、5g/L酵母提取物(商品名“Bacto-yeast extract”，Difco公司售)、10g/L食盐和水构成的液体培养基以每100ml装入容量为500ml的三角烧瓶，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却之后，无菌条件下调整成pH7.5后，无菌条件下添加2mg卡那霉素，从而制备出液体培养基。在该液体培养基中接种实验8-1的方法获得的转化体ETAM1，于27℃旋转振荡培养，在浊度达到约0.6时，通过以0.4mM的终浓度添加异丙基-1-硫代-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导异环麦芽寡糖合酶基因的表达，再培养3小时。按照常规的方法通过对所获得的培养物进行离心分离，从而分离培养上清和菌体，进行回收。对于菌体，通过超声波破碎法从细胞中制备总提取物。通过将菌体悬浮于20mMTris-磷酸缓冲液(pH7.5)后，一边将该菌体悬浮液在冰水中冷却一边用超声波匀浆器(型号UH-600，株式会社エスエムテ-制造)破碎细胞来进行超声波破碎法，以这种破碎物作为全细胞提取物的方法。
对这样制备的培养上清和全细胞提取物，分别测定异环麦芽寡糖合酶活性，将它们的活性值分别换算成每1ml培养物的值。并且，在于上述转化体相同的条件下培养作为对照的携带质粒pET-38b(+)的大肠杆菌BL21(DE3)，从培养物中制备培养上清和全细胞提取物，同样测定异环麦芽寡糖合酶活性。其结果示于表5。
根据表5的结果清楚地表明，转化体ETAM1在细胞内产生本发明的异环麦芽寡糖合酶。在宿主的对照大肠杆菌中，其培养上清，全细胞提取物中均没有发现该酶活性。
再按照实验5所示的方法，对这种由实验8的方法获得的全细胞提取物进行盐析，透析，提供给采用DEAE-Toyopearl 650S凝胶、Buthyl-Toyopearl 650M凝胶的柱层析进行纯化，再根据实验6所示的方法分析这种纯化酶制品。其结果是，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量为约106000±20000道尔顿，通过等电点聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的等电点为约7.5±0.5，异环麦芽寡糖合酶活性的最适温度在pH6.0，反应30分钟的条件下，为约50-55℃，在30℃，30分钟反应的条件下最适pH为约4.5-8.0，关于温度稳定性，在保持于各个温度60分钟的条件下，不存在氯化钙下温度稳定性达到35℃，在1mM氯化钙存在下达到约40℃，在4℃保持在各个pH值24小时的条件下，pH稳定性在约4.5-9.0的范围内稳定。这些物化性质与由实验5中所示的方法制备的这种酶的性质实质上相同。以上的结果表明本发明的异环麦芽寡糖合酶可以由重组DNA技术良好地制造。
<实验9对各种糖的作用>
用各种糖，研究异环麦芽寡糖合酶的底物特异性。制备含有麦芽糖，麦芽丙糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖，麦芽庚糖，新海藻糖，海藻糖，曲二糖，黑曲霉糖，异麦芽糖，异麦芽丙糖，潘糖，异潘糖，麦芽糖醇，麦芽三糖醇(Maltotriitol)，α-、β-或γ-环糊精，淀粉酶，可溶性淀粉，糖原，支链淀粉或葡聚糖的水溶液。在这些底物溶液中添加最终浓度为20mM的醋酸缓冲液(pH6.0)和最终浓度为1mM的氯化钙后，每1g底物固体物质分别添加每1单位的由实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶制品，将底物浓度调整成2w/v％，在40℃，pH6.0下使之作用24小时。为了研究酶反应前后的反应液中的糖，使用n-丁醇、吡啶、水混合液(容量比6∶4∶1)作为洗脱剂，并且使用墨克公司制“キ-ゼ儿凝胶60”(铝板，10×20cm)作为薄层板，进行2次展开的二氧化硅凝胶薄层层析(以下，简称为TLC)，分离糖类。通过硫酸-甲醇法使之发色，检测分离出的糖类，确认对各个糖类的酶作用的有无或强弱的程度。结果示于表6。
注)酶反应前后，-表示“没变化”，+表示“底物的点稍有减少，发现了异环麦芽寡糖的生成”，++表示“底物的点大为减少，发现了异环麦芽寡糖的生成”，+++表示“底物的点几乎消失，发现了异环麦芽寡糖的生成”，根据表6的结果清楚地表明，异环麦芽寡糖合酶对试验的糖中的麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖，麦芽庚糖作用充分，而且，与麦芽丙糖稍有作用，而且，本发明的异环麦芽寡糖合酶对淀粉酶，可溶性淀粉，糖原也较好作用。根据这些结果，表明该酶作用于葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖。
<实验10作用机制>
<实验10-1由麦芽六糖产生的生成物>
在最终浓度为1w/v％的麦芽六糖水溶液中加入最终浓度为20mM的醋酸缓冲液(pH6.0)和最终浓度为1mM的氯化钙后，每1g底物固体物质加入1单位由实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶，于45℃，pH6.0使之作用，进行经时的取样，通过于100℃保持10分钟停止反应。用HPLC测定该酶反应液的糖组成。在柱中连续连接上两个“MCIgelCK04SS”(三菱化学株式会社制)，用水作为洗脱液，在柱温度80℃，流速0.4ml/分钟的条件下进行，用差示折射仪RID-10A(株式会社岛津制作所制造)进行HPLC。其结果示于表7。
根据表7的结果清楚地表明，该酶作用的结果是由底物麦芽六糖生成比麦芽六糖聚合度低的麦芽寡糖，比异环麦芽五糖，异环麦芽六糖和麦芽六糖聚合度高的麦芽寡糖。如果根据这些结果推测，可以推定本发明的异环麦芽寡糖合酶作用于麦芽六糖，在分子间通过α-1，4转移麦芽糖至麦芽五糖的系列麦芽寡糖，催化包括聚合度在8以上的麦芽寡糖的葡萄糖聚合度各不相同的麦芽寡糖的生成(歧化反应)，与此同时，在麦芽五糖单位切断，通过分子内α-1，6转移，由葡萄糖聚合度为7的麦芽寡糖(麦芽庚糖)生成异环麦芽五糖，而且在麦芽五糖或麦芽六糖单位切断，通过分子内α-1，6转移，由葡萄糖聚合度为8以上的麦芽寡糖生成异环麦芽五糖和异环麦芽六糖。
根据以上内容，认为本发明的异环麦芽寡糖合酶产生的异环麦芽寡糖的反应机制如下所示。该酶作用于作为底物的葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖，在分子间α-1，4转移一系列的麦芽寡糖，催化聚合度各不相同的麦芽寡糖的生成(歧化反应)。另一方面，在作用于葡萄糖聚合度为7的α-1，4葡聚糖(麦芽庚糖)时，通过催化从其还原性末端起在麦芽五糖单位切断，将还原末端葡萄糖的1位分子内转移到麦芽五糖的非还原末端葡萄糖的6位羟基上的环化反应，从而生成异环麦芽五糖和麦芽糖。此外，在作用于葡萄糖聚合度为8以上的α-1，4葡聚糖时，通过催化从其还原性末端起在麦芽五糖或麦芽六糖单位切断，将还原末端葡萄糖的1位分子内转移到麦芽五糖或麦芽六糖的非还原末端葡萄糖的6位羟基上的环化反应，从而生成异环麦芽五糖和异环麦芽六糖，生成葡萄糖聚合度减至5或6的α-1，4葡聚糖。
<实验11由各种底物生成异环麦芽寡糖>
使用本发明的异环麦芽寡糖合酶，进行由各种糖生成异环麦芽寡糖的试验。制备麦芽六糖，麦芽七糖，淀粉酶，可溶性淀粉，淀粉部分分解物(商品名“パインデツクス#100”松谷化学工业株式会社制造)，糖原(来源于玉米，キユ一ピ一株式会社制造)的各种水溶液。
在这些水溶液(终浓度为1.0w/v％)中以终浓度20mM加入醋酸缓冲液(pH6.0)，以终浓度1mM加入氯化钙后，每1g固体物质添加由实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶制品1单位，使之于45℃，pH6.0下作用48小时后，通过将该反应液于100℃加热10分钟，使反应停止。与实验1相同，用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶处理后，用HPLC定量异环麦芽寡糖，求出异环麦芽寡糖的生成率。其结果示于表8。
根据表8的结果清楚地表明，试验的任一种糖受到异环麦芽寡糖合酶的作用都生成异环麦芽五糖和异环麦芽六糖。其生成率的合计，底物为麦芽六糖时生成率低至约14％，与之相对，底物为淀粉酶时最高约为29％，随后依次为可溶性淀粉，淀粉部分分解物。
<实验12异环麦芽寡糖生成反应和反应产物的还原力>
在淀粉水溶液(最终浓度为1.0w/v％)中以终浓度20mM加入醋酸缓冲液(pH6.0)，以终浓度1mM加入氯化钙后，每1g固体物质添加由实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶制品1单位，使之于45℃，pH6.0下反应，在添加酶之后立刻取样，立即于约100℃将取样的样品加热10分钟从而使反应停止，用水冷却，获得反应0小时的反应液。接着，分别在反应1、2、3、4小时时取样，立即于约100℃加热10分钟来停止反应，用水冷却，获得反应1小时、反应2小时、反应3小时、反应4小时的各个反应液。用Somogyi-Nelson’s法测定获得的反应液的还原糖量，用蒽酮硫酸法测定总糖量，以百分率(％)表示还原糖量在总糖量中所占比率，以此作为还原力。此外，与实验1相同，用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶处理后，用HPLC定量异环麦芽寡糖，求出异环麦芽寡糖的生成率。其结果示于表9。
根据表9的结果清楚地表明，使本发明的异环麦芽寡糖合酶作用于可溶性淀粉，生成异环麦芽寡糖，当异环麦芽寡糖的生成率在10％以上时，还原力有0.1％左右的略微增加。这意味着本发明的异环麦芽寡糖合酶是基本上催化转移环化反应的酶，这些反应时几乎不伴随加水分解。可知在使该酶作用于淀粉和其分解物等，生成异环麦芽寡糖时，如果预先降低反应前的淀粉和其分解物的还原力，即DE，增加的还原力少，因此可以获得还原力低的生成物。
<实验13异淀粉酶和支链淀粉酶的添加对异环麦芽寡糖的生成的效果>
制备淀粉部分分解物(商品名“パインデツクス#100”松谷化学工业株式会社制造)水溶液，以终浓度20mM加入醋酸缓冲液(pH5.5)，以终浓度1mM加入氯化钙后，每1g固体物质添加由实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶制品1单位，并且每1g固体物质分别添加0、125、250、500、1250或2500单位的异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，使之于45℃，pH5.5下作用24小时后，于100℃加热10分钟，使酶失活。接着，与实验1相同，用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶处理后，用HPLC定量异环麦芽寡糖，求出异环麦芽寡糖的生成率。此外，使用支链淀粉酶代替异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，每1g固体物质分别添加0、1.3、2.7、5.3、13.3或26.7单位，进行相同的操作，求出异环麦芽寡糖的生成率。其结果示于表10和表11。
根据表10和表11的结果清楚地表明，通过添加异淀粉酶和支链淀粉酶，异环麦芽寡糖的生成率增加。
<实验14液化淀粉DE对异环麦芽寡糖的生成的影响>
将玉米淀粉制成浓度为2质量％的淀粉乳，在其中加入0.1质量％的碳酸钙，调整成pH6.0，每克淀粉加入0.2、0.4、0.6、1.0、1.5或2.0质量％的α-淀粉酶(商品名“タ一マシ一ル60L”，ノボ公司制)，分别在95℃反应10分钟，然后于120℃高压灭菌，急冷到约40℃，制得DE3.1～20.4的表10中所示的6种淀粉液化溶液。在这些淀粉液化溶液(最终浓度为1质量％)中按1g固形物质添加由实验5的方法获得的纯化异环麦芽寡糖合酶1单位，使之于45℃，pH6.0下作用48小时后，通过对该反应液煮沸10分钟来使该反应液停止。为了研究这些热失活的反应液中的异环麦芽寡糖的生产量，与实验1相同，添加α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶使之反应后，用HPLC定量异环麦芽寡糖，求出异环麦芽寡糖的生成率。其结果示于表12。
根据表12的结果清楚地表明，由本发明的异环麦芽寡糖合酶产生的异环麦芽寡糖的生成率受到液化淀粉的DE影响，DE值越低，异环麦芽寡糖生成率越高，相反，DE值越高，异环麦芽寡糖生成率越低。具体的是，表明液化淀粉的DE约20以下合适，理想的是DE为约8以下合适，更理想的是DE为约5以下合适。
<实验15异环麦芽寡糖的热稳定性>
按实验11的方法由可溶性淀粉制备，将通过按实验1的方法纯化至纯度100％所获得的异环麦芽五糖溶解于无离子水，制备浓度为5w/v％的异环麦芽五糖溶液。将8ml该溶液收集于玻璃制试管中，密封后，于120℃加热30-90分钟。放冷后，进行这些溶液的着色度的测定和用HPLC法进行的异环麦芽五糖的纯度测定。以1cm小室中480nm处的吸光度为着色度。结果示于表13。
根据表13的结果清楚所示，使异环麦芽五糖水溶液于120℃的高温加热也无着色，没有发现由于分解而导致的纯度降低，表明异环麦芽五糖是对热稳定的糖。
<实验16异环麦芽寡糖的pH稳定性>
将实验15中使用的异环麦芽五糖溶解于各种缓冲液中，制备异环麦芽五糖浓度为4w/v％，pH调整成2-10的9种异环麦芽五糖溶液。将8ml各个溶液收集于玻璃制试管中，密封后，于100℃加热24小时。放冷后，与实验15同样，进行这些溶液的着色度的测定和用HPLC法进行的异环麦芽五糖的纯度测定。结果示于表14。
根据表14的结果清楚所示，异环麦芽五糖水溶液在100℃的24小时加热中，在pH5-10的范围内基本不分解，可知其在弱酸性至碱性的大范围内稳定。但是，在pH4时稍有分解，在pH3时一半以上分解，在pH2时完全分解而小时。
<实验17氨基羰基反应>
将实验15中使用的异环麦芽五糖和市售的试剂特级甘氨酸溶解于无离子水中，进而制备出用磷酸缓冲液调整成pH7.0的含有1w/v％甘氨酸的5w/v异环麦芽五糖溶液。作为对照，除了使用α-环糊精代替异环麦芽五糖之外，以与上述相同的方式制备含有α-环糊精的溶液。将4ml各溶液收集于玻璃制试管中，密封后，于120℃加热30-90分钟。室温下放冷后，测定它们的着色度，研究氨基羰基的反应性。同时，同样加热只含有甘氨酸的溶液，将其作为空白。着色度为1cm小室中480nm处的吸光度，其值为减去空白的值之后的值。结果示于表15。
根据表15的结果清楚所示，异环麦芽五糖并未显示出着色度上升，与对照的α-环糊精相同，在甘氨酸共存下既使加热也不容易发生着色，褐变，表明其是氨基羰基反应性低的稳定的糖。
<实验18氨基羰基反应>
将实验15中使用的异环麦芽五糖和市售的多蛋白胨(日本制药制造)溶解于无离子水中，进而制备出用含有5w/v％多蛋白胨的异环麦芽五糖溶液。作为对照，除了使用α-环糊精代替异环麦芽五糖之外，以与上述相同的方式制备含有α-环糊精(α-CD)的溶液。将4ml各溶液收集于玻璃制试管中，密封后，于120℃加热30-90分钟。室温下放冷后，测定它们的着色度，研究氨基羰基的反应性。同时，同样加热只含有多蛋白胨的溶液，将其作为空白。着色度为1cm小室中480nm处的吸光度，其值为减去空白的值之后的值。结果示于表16。
根据表16的结果清楚所示，异环麦芽五糖的着色度极低，与对照的α-环糊精相同，在多蛋白胨共存下既使加热也不容易发生着色，褐变，表明其是氨基羰基反应性低的稳定的糖。
<实验19异环麦芽寡糖的包合作用>
将实验15中使用的异环麦芽五糖溶解于无离子水中，制备20质量％水溶液。在平均20ml水溶液中分别添加以摩尔换算的相对于异环麦芽五糖3倍量的甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇4种短链醇，醋酸、丙酸、n-丁酸和n-戊酸4种短链脂肪酸，和苯甲醇，苯乙醇，4-苯基-1-正丙醇和o-甲氧甲酚4种芳香族化合物作为香味成分，搅拌均匀，使之包合。然后，将它们分别过滤，通过将滤液冷冻干燥除去未包合物。为了测定冷冻干燥物中的包合物，对各个冷冻干燥物，用气相色谱法定量化合物。使用α-环糊精(α-CD)作为对照，进行同样试验。结果示于表17。
根据表17的结果清楚地表明，异环麦芽五糖具有包合短链醇，短链脂肪酸和芳香族化合物等各种化合物的能力。异环麦芽五糖对于甲醇，乙醇，醋酸，丙酸，n-丁酸的包合量比α-环糊精要多。由于异环麦芽五糖显示出芳香族化合物的包合能力，因此其包合量根据所包合的化合物的种类而大不相同。
<实验20异环麦芽寡糖的消化性试验>
对于实验15中使用的异环麦芽五糖，按照冈田等人的记载于日本营养和食品科学学会杂志(日本栄善食糧学会誌)，Vol.43，pp.23-29(1990)中报道的方法在试管中研究由唾液淀粉酶，合成胃液，胰淀粉酶以及肠粘膜酶产生的消化性。作为对照，使用同为环状糖的α-，β-和γ-环糊精，同样研究消化性。结果示于表18。并且，表中的分解率(％)是指，在上述各消化反应中，用式分解率(％)＝{(反应液中的还原糖量)/(反应液中的总糖量)}×100计算出的值。
*环糊精根据表17的结果清楚地表明，与α-和β-环糊精相同，唾液淀粉酶，合成胃液，胰淀粉酶和肠粘膜酶的任一种都基本无法消化异环麦芽五糖。另一方面，γ-环糊精被胰淀粉酶和肠粘膜酶进行部分消化。异环麦芽五糖是一种难消化的糖。
<实验21急性毒性试验>
将实验15中使用的异环麦芽五糖经口施于小鼠，进行急性毒性试验。其结果是，确认了异环麦芽五糖是一种低毒性物质，即使在可以给药的最大量时也没有发现死亡例，其LD50值为5g/kg小鼠体重以上。
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。但是，本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1按照实验1的方法起始培养环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)。然后将约20L由1.5％(w/v)淀粉部分分解物(商品名“パインデツクス#4”，松谷化学工业株式会社制造)、0.5％(w/v)酵母提取物(商品名“ポリペプトン(POLYPEPTON)”，日本制药株式会社制造)、0.1％(w/v)酵母提取物(商品名“酵母エキスS”，日本制药株式会社制造)、0.1％(w/v)磷酸二钾、0.06％(w/v)磷酸一钠·2水合物、0.05％(w/v)硫酸镁·7水合物、0.3％(w/v)碳酸钙和水构成的液体培养基装入容量为30L的发酵器中，加热灭菌，冷却，温度达到27℃后，pH保持于5.5-8.0，通气培养96小时。培养后，用SF膜除菌过滤，回收约18L培养滤液，进而用UF膜浓缩其滤液，回收约1L含有0.41单位/ml本发明的异环麦芽寡糖合酶的浓缩酶液。
实施例2将马铃薯淀粉乳制成浓度为约1质量％的淀粉乳，在其中以1mM的终浓度加入氯化钙，调整成pH6.0，于95℃加热约20分钟进行糊化，然后冷却至约40℃，以每1g淀粉固体物质2.44ml(约1单位)的比例加入含有由实施例1的方法获得的异环麦芽寡糖合酶的浓缩酶液，于pH6.0，温度40℃使之反应48小时。将该反应液加热到95℃，保持30分钟后，冷却，过滤，将过滤得到的滤液按照常规的方法用活性炭脱色，通过H型和OH型离子交换树脂脱盐来纯化，再通过浓缩，以相当于固体物质约90％的产率获得了含有浓度为65质量％的异环麦芽寡糖的糖浆。本品，含有27.5质量％相当于固体物质的异环麦芽寡糖，含有72.5质量％其它的糖，其具有低还原性，具有适度粘度，可以作为甜味剂、调味剂、品质改良剂、脱水防止剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂、包合剂、粉末化基材等，可有效应用于各种饮食品、化妆品、药品等各种组合物中。
实施例3将木薯淀粉制成浓度为约1质量％的淀粉乳，在其中加入使成为0.1％的碳酸钙，将pH调整到6.0，在其中以每克淀粉固体物质加入使成为0.2质量％的α-淀粉酶(商品名“ダ-マミ-ル60L”、ノボ公司制造)，于95℃使之反应10分钟，然后于120℃高压灭菌20分钟，再急剧冷却到约40℃，得到DE为约3的液化溶液，按照每克淀粉固体物质对应2.44ml(约1单位)的比例向液化溶液中加入用实施例1方法得到的含有异环麦芽寡糖合酶的浓缩液，并以每克淀粉固体物质对应1000单位的比例向液化溶液中加入异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，于pH6.0、温度40℃使之反应48小时。将该反应液加热到95℃，保持30分钟后，冷却，过滤，将过滤得到的滤液按照常规的方法用活性炭脱色，通过H型和OH型离子交换树脂脱盐来纯化，再通过浓缩，获得了浓度为60质量％含有31.5％相当于固体物质的异环麦芽寡糖的糖浆。将得到的糖浆作为糖液，使用采用强酸性阳离子交换树脂(AMBERLITE CR-1310、Na型、Organo株式会社制造)的柱进行分级。把树脂填充在4根内径5.4cm带夹套的不锈钢制柱中，将这些柱串联连接使树脂总长为20米。将柱内温度保持在60℃，相对于树脂量加5v/v％糖浆，向其中通60℃的温水，以SV0.13洗脱进行分离，用HPLC法监控洗脱液的糖组成，收集含有异环麦芽寡糖的级分，将其进行纯化，浓缩，喷雾干燥，以相当于固体物质的约54％的收率获得含有异环麦芽寡糖的粉末。本品含有51.5质量％相当于固体物质的异环麦芽寡糖，含有48.5质量％其它的糖，其具有低还原性，可以作为甜味剂、调味剂、品质改良剂、脱水防止剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂、包合剂等，可有效应用于各种饮食品、化妆品、药品等各种组合物中。
<实施例4>
将玉米淀粉制成浓度为约1质量％的淀粉乳，在其中加入使成为0.1％的碳酸钙，将pH调整到6.0，在其中以每克淀粉固体物质加入使成为0.2质量％的α-淀粉酶(商品名”ダ-マミ-ル60L”、ノボ公司制造)，于85-90℃使之反应20分钟，然后于120℃高压灭菌20分钟，再急剧冷却到约40℃，得到DE约3的液化溶液，按照每克淀粉固体物质对应2.44ml(约1单位)的比例向液化溶液中加入用实施例1方法得到的含有异环麦芽寡糖合酶的浓缩液，并以每克淀粉固体物质对应1000单位的比例向液化溶液中加入异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，于pH6.0、温度40℃，使反应48小时。该反应液在加热至95℃并保持30分钟后，使pH5.0、温度50℃，在其中以每克淀粉固体物质对应1000单位的比例向其中加入α-葡糖苷酶(商品名糖苷转移酶L“AMANO”，天野制药制)，以每克淀粉固体物质对应100单位的比例向其中加入葡萄糖淀粉酶(商品名“グルコチ一ム”，ナガせ生化学工业株式会社制)，于pH5.0，温度50℃使之反应16小时。将该反应液加热到95℃，保持30分钟后，冷却，过滤，将过滤得到的滤液按照常规的方法用活性炭脱色，通过H型和OH型离子交换树脂脱盐来纯化，再通过浓缩，以相当于固体物质的约95％的收率获得了浓度为60质量％含有异环麦芽寡糖的糖浆。本品含有32.6质量％相当于固体物质的异环麦芽寡糖，63.0质量％葡萄糖和4.4质量％其它糖，其具有低还原性，具有适度粘度，可以作为甜味剂、调味剂、品质改良剂、脱水防止剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂、包合剂、粉末化基材等，可有效应用于各种饮食品、化妆品、药品等各种组合物中。
<实施例5>
将实施例4的方法获得的含有异环麦芽寡糖的糖浆装入高压灭菌锅中，添加相对于固体成分的约9质量％的拉奈镍作为催化剂，一边搅拌一边使温度上升到130℃，通过氢压上升到75kg/cm2后，添加氢，将包含于含有异环麦芽寡糖的糖浆中的葡萄糖和其它还原性糖置换为这些糖的糖醇。从该反应液中除去拉奈镍，通过按常规方法脱色，脱盐，进行纯化，浓缩，真空干燥，粉碎，以相当于固体物质约90％的收率获得了含有异环麦芽寡糖的粉末。本品含有相当于固体物质的32.5质量％的异环麦芽寡糖，63.2质量％山梨糖醇和4.3质量％其它的糖，其基本没有显示出还原性，不容易发生氨基羰基反应，可以作为甜味剂、调味剂、品质改良剂、脱水防止剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂、包合剂等，可有效应用于各种饮食品、化妆品、药品等各种组合物中。
<实施例6甜味剂>
向0.8质量份由实施例3的方法获得的含异环麦芽寡糖的粉末中均匀混入0.2质量份海藻糖含水结晶(株式会社林原商事售，注册商标“トレハ”)，0.01质量份“α-グリコシルステビオシド”(东洋精糖株式会社售，商品名“αGsweet”)和0.01质量份的L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(商品名“糖精(aspartame)”)，将该混合物装入颗粒成型机得到粒状甜味剂。本品甜味品质优异，其具有蔗糖的约两倍的甜味度。本品适于作为在室温保存下，不必担心变质劣化的稳定的甜味剂。
<实施例7硬糖果>
将100质量份的浓度为55％蔗糖溶液与50质量份的含有用实施例4方法获得的异环麦芽寡糖的糖浆加热混合，然后在减压下加热浓缩至水分含量低于2％。该浓缩液与0.6质量份柠檬酸和适量的柠檬香料及着色剂混合，所得混合物以常规方法成形，得到制品。本品香脆，口味和香味良好，是一种不引起蔗糖的结晶化，吸湿性少，且不引起垂流的稳定的高品质的硬糖。
<实施例8口香糖>
将3质量份的树胶基加热熔化至柔软的程度，在其中加入2质量份无水麦芽糖，2质量份木糖醇，2质量份含有由实施例5的方法获得的含有异环麦芽寡糖的粉末和1质量份含水结晶海藻糖，再混合适量的香料和着色剂，按照常规方法，通过滚动揉捏，成形并包装，以获得制品。本品质感、口味和香味良好，适于作为一种低蚀性，低热量的口香糖。
<实施例9加糖炼乳>
将4质量份的用实施例2方法所获得的含有异环麦芽寡糖的糖浆和2质量份的蔗糖溶解在100质量份原乳中，用一平底加热器加热灭菌，然后浓缩成浓度为70％的溶液，在无菌状态下装罐，从而获得制品。本品甜味适中，香味好，可有效用于水果、咖啡、可可和茶等的调味。
<实施例10乳酸菌饮料>
将175质量份的脱脂奶粉、100质量份的用实施例3的方法所获含有异环麦芽寡糖的粉末和高乳蔗糖(Lactosucrose)(株式会社林原商事售，注册商标“乳果オリゴ”)粉溶于1500质量份的水中，将得溶液在65℃灭菌30分钟，冷却至40℃后，在其中按常规方法接种30质量份的乳酸菌促酵物，并在37℃培养8小时，得到乳酸菌饮料。本品香味好，含有寡糖，异环麦芽寡糖，适于作为一种稳定维持乳酸菌并具有促进双歧杆菌增殖作用和整肠作用的乳酸菌饮料。
<实施例11粉末果汁>
将33质量份通过喷雾干燥制备的橙汁粉与用实施例5的方法所的获得的50质量份的富含非还原性糖类的粉末、10质量份的无水结晶マルチト一ル、0.65质量份的无水柠檬酸、0.1质量份的苹果酸、0.1质量份的2-O-α-糖基-L-抗坏血酸、0.1质量份的柠檬酸钠、0.5质量份的葡聚糖和足量的香料粉在搅拌条件下混合均匀。将所得混合物粉碎成微粉，送入流化床制粒机内粒化30分钟，向其喷洒用实施例2方法所获作为粘接剂的含有非还原性糖类的糖浆作为粘合剂，同时排风温度为40℃。对所获颗粒称重并包装，获得所需产品。该产品的果汁含有率约30％的颗粒果汁。该产品无异味、异臭，高品质，作为低卡路里的果汁，商品价值高。
<实施例12乳蛋糕乳脂>
将100质量份的玉米淀粉，100质量份由实施例2方法得到的含有含有异环麦芽寡糖的糖浆，60质量份的海藻糖含水结晶，40质量份的蔗糖和1质量份的盐充分混合，加入280质量份的鸡蛋搅拌，在其中慢慢加入1000质量份的沸腾的牛奶，再加热继续搅拌，在玉米淀粉完全糊化，整体呈半透明状态时停止加热，随后将其冷却，加入适量的香草香料。将所得混合物称重、填充并包装，制得制品。本品具有柔滑的光泽，是一种香味良好，可抑制淀粉氧化的高品质乳蛋糕乳脂。
<实施例13火腿>
向1000质量份的猪腿肉中加入15质量份的盐、3质量份的硝酸钾，并揉搓均匀，将其堆积起来并在冷藏室中放置过夜。随后，在冷藏室中将其浸渍于由500质量份的水、100质量份的盐、3质量份的硝酸钾、40质量份用实施例5方法获得的含有异环麦芽寡糖的粉末和调味品组成的盐溶液中7天，然后通过用常规方法用冷水冲洗，用绳包扎、熏制、蒸煮、冷却并包装而获得产品。该产品是一种色调好、香味良好的高品质的火腿。
<实施例14粉状肽>
在1质量份的40％食用大豆的肽溶液(不二制油株式会社售，商品名“Hinute S”)中混合2质量份的由实施例3方法制备的含有异环麦芽寡糖的粉末，将所得混合物放入塑料容器中，在50℃温度下减压干燥，粉碎得到粉状肽。该产品香味良好，可有利作为预混合物、冰淇淋等低卡路里的糖果制造材料，还可有利用作用于口服流食和插管流食的难消化性的食物纤维、整肠剂量。
<实施例15化妆品乳膏>
将2质量份的聚氧乙烯乙二醇-单硬脂酸酯、5质量份的自乳化型单硬脂酸甘油酯、2质量份按实施例5方法获得的含有异环麦芽寡糖的粉末、1质量份的α-糖基芸香苷(株式会社林原售，商品名αG芸香苷)、1质量份的液体石蜡、10质量份的三辛酸甘油酯，以及适量防腐剂按常规方法加热溶解，在其中加入2质量份的L-乳酸、5质量份的1，3-丁二醇和66质量份的纯化水，所得混合物由匀浆器乳化，再加入适量的香料，搅拌混合，制得化妆用乳膏。本品具有抗氧化性，稳定性高，可有效用作优质防晒霜、皮肤嫩化剂和皮肤增白剂。
<实施例16牙膏>
把45质量份磷酸氢钙、1.5质量份月桂基硫酸钠、25质量份甘油、0.5质量份聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酯、10质量份的由实施例3的方法制得的含有异环麦芽寡糖的粉末、0.02质量份糖精与18质量份水混合制得牙膏。本品不降低表面活性剂的洗涤力，改善难闻味道，使用后感觉也良好。
<实施例17流食用固体制剂>
配制100质量份由实施例2的方法制得的含有异环麦芽寡糖的糖浆，200质量份海藻糖含水结晶，200质量份麦芽四糖高含量粉末、270质量份粉末蛋黄，209质量份脱脂奶粉，4.4质量份氯化钠、1.8质量份氯化钾，4质量份硫酸镁、0.01质量份硫胺素，0.1质量份抗坏血酸钠，0.6质量份维生素E乙酸酯和0.04质量份烟酰胺组成的组合物，每25克该组合物填充到防潮性复合小袋中，密封制得制品。本品作为流食，可经口，或通过管向鼻腔，胃，肠等的使用方法利用，可有效地用于补充生物体的能量。
<实施例18外伤治疗用药膏>
在100质量份由实施例5的方法制得的含有异环麦芽寡糖的糖浆和300质量份麦芽糖中，加入50质量份溶解有3质量份碘的甲醇，进行混合，再加入200质量份的10w/v％支链淀粉水溶液，进行混合，制得显示出适度的延展和粘附性的外伤治疗用药膏。本品是一种经时变化少、商品价值高的药膏。此外，本品不仅具有由碘产生的杀菌作用，而且因麦芽糖也作为能量补充剂作用于细胞，故可缩短治疗时间，很好地治疗创伤面。
产业上利用的可能性如果根据本发明，可以使用异环麦芽寡糖合酶大量制备、提供具有由通式1表示的结构的异环麦芽寡糖。可以提供全新的异环麦芽寡糖的本发明，对饮食品、化妆品、药品等各种应用领域大有贡献，其产业的意义极大。
通式1[化4]环{→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→)}(n是指4或5)。
序列表<110>株式会社林原生物化学研究所<120>异环麦芽寡糖和异环麦芽寡糖合酶以其制备方法和用途<130>10107902<160>23<210>1<211>20<212>PRT<213>环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)<400>1Ala Ser Ile Gly Thr Val Thr Glu Asn Asp Thr Ile Tyr Gln Ile Met1 5 10 15Val Asp Arg Phe20<210>2<211>960<212>PRT<213>环状芽孢杆菌<400>2Ala Ser Ile Gly Thr Val Thr Glu Asn Asp Thr Ile Tyr Gln Ile Met1 5 10 15Val Asp Arg Phe Asn Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Ala Thr Gly Ala20 25 30Ala Ile Arg Tyr Gly Glu Asn Ser Glu Glu Asp Phe Arg Tyr Met Lys35 40 45
Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys Leu Pro Tyr Ile His Asn50 55 60Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Ala Glu Pro Gln Met65 70 75 80Thr Asn Arg Glu Asn Asn Gly Thr Gly Lys Asn Thr Ala Tyr His Gly85 90 95Tyr Asn Val Lys Asp Pro Asn Lys Ala Asn Pro Tyr Phe Gly Thr Lys100 105 110Glu Lys Leu Lys Glu Leu Val Asp Ser Ala His Ala Leu Gly Ile Lys115 120 125Val Ile Ile Asp Val Val Pro Asn His Ile Gly Asp Tyr Met Leu Gly130 135 140Thr Gln Ala Phe Tyr Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Ala Ala Pro Phe145 150 155 160Asn Asn Pro Ala Trp Tyr His His Asn Gly Asp Ile Asn Trp Ser Leu165 170 175Ala Asp Gly Arg Tyr Asp Gln Trp Ala Gln Asp Tyr Leu Glu Asn His180 185 190Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Ile Asp Phe Asp Val Pro Ala Ala Lys195 200 205Gln Ala Ile Phe Ser Ser Ile Lys Gly Trp Phe Asp Tyr Thr Gly Ala210 215 220Asp Gly Ala Arg Val Asp Ala Ala Lys Leu Met Lys Pro Thr Asp Ile225 230 235 240Gly Glu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Asn Thr Phe Gly Glu Asn Phe245 250 255Asp Gly Asn Ala Glu Phe Val Ser Arg Trp Val Gly Thr Asn Lys Glu260 265 270Trp Gly Met Leu Asp Phe Pro Leu Phe Phe Ser Val Leu Asn Ser Phe275 280 285Ala Tyr Gly Gln Ser Phe Asp Ala Asn Ile Lys Gly Thr Leu Ala Gln290 295 300Asp Ser Tyr Tyr Gly Gly Asn Ala Asn His Met Val Thr Phe Ile Asp
305 310 315 320Asn His Asp Arg Asn Arg Phe Leu Thr Glu Ala Gly Gly Ser Val Glu325 330 335Lys Leu Gln Asn Ala Leu Ser Phe Ile Phe Thr Val Arg Gly Thr Pro340 345 350Val Val Phe Gln Gly Thr Glu Gln Asn Lys Gly Asn Gly Asn Gly Gln355 360 365Ile Met Thr Gly Gly Ile Ala Asp Thr Trp Asn Arg Trp Ser Met Val370 375 380Lys Arg Asp Ala Asn Gly Asn Val Leu Glu Asn Tyr Phe Asn Glu Asn385 390 395 400Ala Ser Thr Phe Lys His Val Ala Lys Leu Asn Glu Ile Arg Lys Asn405 410 415Asn Pro Ala Leu Arg Thr Gly Thr Gln Arg Glu Met Trp Ser Ala Gln420 425 430Asn Leu Tyr Ala Phe Ser Arg Arg Ile Asp Thr Gly Thr Asn Val Gly435 440 445Gln Glu Val Ile Ser Ala Phe Ser Asn Ala Ser Gly Gly Ser Gln Thr450 455 460Val Thr Leu Pro Leu Arg Ala Glu Ser Thr Leu Thr Ala Gly Thr Val465 470 475 480Leu Val Asn Gln Leu Asn Pro Ser Asp Thr Val Thr Val Gln Ala Gly485 490 495Gly Val Thr Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr Leu Gly Ala Asn Ser Ala500 505 510Lys Ile Tyr Ala Lys Thr Gln Pro Val Thr Asp Thr Gln Ala Pro Ser515 520 525Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Thr Val Gln Asn Ala Ser Ser Ala Leu530 535 540Val Ser Trp Ser Ala Ser Thr Asp Asn Val Gly Val Thr Gly Tyr Glu545 550 555 560Ile Tyr Arg Asn Gly Val Lys Ile Gly Thr Ser Ala Thr Thr Ser Phe565 570 575Thr Asp Asn Gly Leu Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Tyr Thr Val Lys
580 585 590Ala Tyr Asp Ala Ala Met Asn Leu Ser Ala Phe Ser Ala Ala Ala Leu595 600 605Ile Val Thr Pro Ala Gly Asn Ser Val Thr Ile Tyr Tyr Lys Gln Gly610 615 620Tyr Thr Asn Pro Tyr Ile His Tyr Arg Pro Val Gly Gly Thr Trp Thr625 630 635 640Thr Ser Pro Gly Val Ala Ile Pro Ala Ala Glu Val Ala Gly Tyr Asn645 650 655Lys Ile Thr Ile Asn Ile Gly Ala Ala Thr Gln Leu Glu Ala Cys Phe660 665 670Asn Asn Gly Ser Gly Ile Trp Asp Ser Asn Gly Gly Ser Asn Tyr Leu675 680 685Phe Gly Thr Gly Thr Trp Thr Tyr Thr Pro Thr Gly Asn Ile Gln Ala690 695 700Gly Gly Pro Val Thr Pro Thr Ala Ser Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val705 710 715 720Ala Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ala725 730 735Thr Pro Thr Val Ala Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val Ala Pro Thr Ala740 745 750Thr Pro Val Pro Thr Ala Thr Pro Ala Gly Asn Thr Ala Thr Ile Tyr755 760 765Tyr Lys Asn Thr Ala Phe Ser Asn Ser Tyr Ile His Tyr Lys Leu Asp770 775 780Gly Ala Thr Thr Trp Thr Thr Ser Pro Gly Val Pro Met Gln Ala Ser785 790 795 800Thr Phe Ser Gly Tyr Lys Ser Ile Thr Ile Pro Leu Gly Thr Ala Thr805 810 815Gly Leu Thr Ala Ala Phe Asn Asn Gly Ser Gly Thr Trp Asp Ser Asn820 825 830Gly Gly Asn Asn Tyr His Phe Gly Thr Gly Ser Ser Ser Leu Val Gly835 840 845Gly Ser Leu Thr Thr Gly Glu Pro Gln Ala Asp Ser Val Thr Phe Arg
850 855 860Val Ser Val Pro Gly Ser Thr Pro Ala Asn Ala Pro Val Tyr Leu Thr865 870 875 880Gly Ser Phe Asn Ser Trp Asn Ala Ala Asp Thr Ala Tyr Leu Leu Thr885 890 895Arg Gly Ser Asp Gly Val Tyr Ser Val Thr Leu Asn Leu Pro Ala Gly900 905 910Thr Ala Val Thr Tyr Lys Leu Thr Arg Gly Ser Trp Ala Thr Val Glu915 920 925Thr Thr Ser Ser Gly Ala Asp Ile Thr Ash Arg Thr Leu Thr Pro Ala930 935 940Gly Gly Ala Gln Thr Val Thr Ile Ser Val Gln Arg Trp Lys Asp Gln945 950 955 960<210>3<211>2880<212>DNA<213>环状芽孢杆菌<400>3gcgagtattg gtacagtaac cgagaatgac acgatctatc agattatggt tgaccgcttc 60aatgacgggg attcttccaa taacgcaaca ggagctgcca tccgctatgg ggagaactct 120gaggaggatt tccgttacat gaagggcggc gactggcagg gggtcattga caagctcccg 180tatattcaca atatgggcta tactgcgatc tggatctcgc ccgtagccga gccgcagatg 240actaaccgtg agaacaacgg aacaggcaag aacactgcct accacggcta caatgtcaaa 300gatccgaaca aggccaaccc ttacttcggc accaaagaaa agctgaaaga gcttgtagac 360tccgcgcatg cgctcggaat taaggtcatc attgatgtcg ttcccaacca catcggcgat 420tacatgctgg gcactcaggc tttttacgat atcccatcct tgcagcctgc cgctccgttc 480aataatccgg cctggtatca ccacaatggg gacattaact ggtcgcttgc cgatggacgg 540tacgatcagt gggctcagga ttatctggag aatcatgatc tgggtggtct ggatgatatc 600gacttcgatg ttcctgccgc caagcaggct attttcagct cgatcaaggg ctggtttgac 660tatacggggg cagacggcgc ccgtgttgat gcggccaagc tgatgaagcc gaccgatatc 720ggcgagctgc agaatttgct gggcgtgaat acgtttgggg agaatttcga cggcaatgcc 780gaattcgtct cccgctgggt cggtaccaac aaggagtggg ggatgctcga cttcccgtta 840
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Glu Leu Val Asp Ser Ala His Ala Leu Gly Ile Lys1 5 10<210>8<211>11<212>PRT<213>环状芽孢杆菌<400>8Asn Thr Ala Phe Ser Asn Ser Tyr IIe His Tyr1 5 10<210>9<211>15<212>PRT<213>环状芽孢杆菌<400>9Asp Thr Ala Tyr Leu Leu Thr Arg Gly Ser Asp Gly Val Tyr Ser1 5 10 15<210>10<211>14<212>PRT<213>环状芽孢杆菌<400>10Leu Pro Tyr Ile His Asn Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile1 5 10<210>11<211>13<212>PRT<213>环状芽孢杆菌
<400>11Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Ala Ala Pro Phe Asn Asn1 5 10<210>12<211>15<212>PRT<213>环状芽孢杆菌<400>12Pro Thr Asp Ile Gly Glu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Asn Thr1 5 10 15<210>13<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>13gayacnatht aycarat 17<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>14taycaratha tggtnga 17<210>15<211>17<212>DNA
<213>人工序列<400>15acrttrtanc crtgrta 17<210>16<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>16ccrtgrtang cngtrtt 17<210>17<211>251<212>DNA<213>环状芽孢杆菌<400>17tat cag att atg gtt gac cgc ttc aat gac ggg gat tct tcc aat aac48Tyr Gln Ile Met Val Asp Arg Phe Asn Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn1 5 10 15gca aca gga gct gcc atc cgc tat ggg gag aac tct gag gag gat ttc96Ala Thr Gly Ala Ala Ile Arg Tyr Gly Glu Asn Ser Glu Glu Asp Phe20 25 30cgt tac atg aag ggc ggc gac tgg cag ggg gtc att gac aag ctc ccg144Arg Tyr Met Lys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys Leu Pro35 40 45tat att cac aat atg ggc tat act gcg atc tgg atc tcg ccc gta gcc192Tyr Ile His Asn Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Ala
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aaaaaggatc cttactgatc cttccagcgc301权利要求
1.具有由下述通式1表示的结构的异环麦芽寡糖通式1环{→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
2.含异环麦芽寡糖的糖，含有权利要求1记载的异环麦芽寡糖和其它糖。
3.根据权利要求2记载的含异环麦芽寡糖的糖，其特征在于形态是糖浆、粉末或固状物质中的任一种。
4.异环麦芽寡糖合酶，具有作用于葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖，生成具有通式1表示的结构的异环麦芽寡糖的作用通式1环{→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
5.根据权利要求4记载的异环麦芽寡糖合酶，具有以下物化性质(1)分子量在SDS-凝胶电泳法中，分子量为106000±20000道尔顿；(2)等电点在含有两性电解质的等电点电泳法中，pI7.5±0.5；(3)最适温度在pH6.0、反应30分钟的条件下，最适温度为50℃至55℃；(4)最适pH在30℃、反应30分钟的条件下，最适pH为pH4.5至8.0；(5)温度稳定性在pH6.0下保持60分钟的条件下，在35℃以下稳定，1mM钙离子存在下，在40℃以下稳定；(6)pH稳定性于4℃下保持24小时的条件下，在pH4.5至9.0稳定。
6.根据权利要求4或5记载的异环麦芽寡糖合酶，具有序列表中的序列号1表示的氨基酸序列作为N末端氨基酸序列。
7.根据权利要求4-6中任一项记载的异环麦芽寡糖合酶，具有序列表中序列号2表示的氨基酸序列，或序列表中序列号2表示的氨基酸序列中在保持其酶活性的范围内缺失、取代或添加了1个或2个以上氨基酸的氨基酸序列。
8.根据权利要求4-7中任一项记载的异环麦芽寡糖合酶，其中葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖是选自于麦芽寡糖、麦芽糖糊精、淀粉糊精、直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉和糖原的1种或2种以上的糖。
9.根据权利要求4-8中任一项记载的异环麦芽寡糖合酶，是微生物来源的酶。
10.根据权利要求9记载的异环麦芽寡糖合酶，其中微生物是属于芽孢杆菌属的微生物。
11.根据权利要求10记载的异环麦芽寡糖合酶，其中属于芽孢杆菌属的微生物是环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7(以保藏号FERM BP-10111保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)或其变异株。
12.具有权利要求4-11任一项记载的异环麦芽寡糖合酶产生能力的微生物，该微生物是环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)AM7(以保藏号FERM BP-10111保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)或其变异株。
13.编码权利要求4-11任一项记载的异环麦芽寡糖合酶的DNA。
14.根据权利要求13记载的DNA，具有序列表中序列号3表示的碱基序列，或具有序列号3表示的碱基序列中在保持其编码的酶的活性的范围内，缺失、取代或添加了1个或2个以上碱基的碱基序列，或与这些序列互补的碱基序列。
15.根据权利要求13或14记载的DNA，是基于基因编码的简并，不改变其编码的氨基酸序列且序列表中序列号3所示的碱基序列中1个或2个以上的碱基被取代为其它碱基的DNA。
16.根据权利要求13-15中任一项记载的DNA，是来源于芽孢杆菌属微生物的。
17.可复制的重组DNA，含有权利要求13-16中任一项记载的DNA和可自我复制的载体。
18.根据权利要求17记载的重组DNA，其中可自我复制的载体是质粒载体pBluescript II SK(+)。
19.在适当宿主中导入了权利要求17或18记载的重组DNA的转化体。
20.根据权利要求19记载的转化体，其中宿主是大肠杆菌。
21.异环麦芽寡糖合酶的制备方法，其特征在于在营养培养基中培养具有产生权利要求4-11中任一项记载的异环麦芽寡糖合酶能力的微生物，从所得的培养物中收集权利要求4-11中任一项记载的异环麦芽寡糖合酶。
22.重组型异环麦芽寡糖合酶的制备方法，其特征在于培养权利要求19或20记载的转化体，从培养物中收集重组型异环麦芽寡糖合酶。
23.具有通式1表示的结构的异环麦芽寡糖的生成方法，其特征在于使权利要求4-11中任一项记载的异环麦芽寡糖合酶或权利要求12记载的具有异环麦芽寡糖合酶产生能力的微生物作用于含有葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖的溶液通式1环{→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
24.根据权利要求23记载的异环麦芽寡糖的生成方法，其中葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖是选自于麦芽寡糖、麦芽糖糊精、淀粉糊精、直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉和糖原的1种或2种以上的糖。
25.具有通式1表示的结构的异环麦芽寡糖或含有它的糖组合物的制备方法，其特征在于使权利要求4-11中任一项记载的异环麦芽寡糖合酶作用于淀粉经糊化和/或液化了的溶液通式1环{→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
26.根据权利要求25记载的异环麦芽寡糖或含有它的糖组合物的制备方法，其中淀粉经糊化和/或液化了的溶液是DE20以下的溶液。
27.根据权利要求25或26记载的异环麦芽寡糖或含有它的糖组合物的制备方法，其特征在于使权利要求4-11中任一项记载的异环麦芽寡糖合酶与异淀粉酶或支链淀粉酶一起作用于淀粉经糊化和/或液化了的溶液，根据需要，使选自于α-淀粉酶、β-淀粉酶、环麦芽糖糊精葡聚糖基转移酶、葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的1种或2种以上的酶也作用于淀粉经糊化和/或液化了的溶液。
28.权利要求25-27中任一项记载的异环麦芽寡糖或含有它的糖组合物的制备方法，其特征在于使权利要求4-11中任一项记载的异环麦芽寡糖合酶与异淀粉酶或支链淀粉酶一起作用于淀粉经糊化和/或液化了的溶液，根据需要，使选自于α-淀粉酶、β-淀粉酶、环麦芽糖糊精葡聚糖基转移酶、葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的1种或2种以上的酶也作用于淀粉经糊化和/或液化了的溶液后，采用选自于通过柱层析进行分级，通过膜分离，通过用微生物进行发酵处理和碱处理分解除去中的1种或2种以上的纯化方法。
29.饮食品、化妆品或药品，含有权利要求1记载的异环麦芽寡糖、或权利要求2或3记载的含异环麦芽寡糖的糖。
全文摘要
本发明提供以葡萄糖作为组成糖的非还原性糖，提供在扩大非还原性糖的选择范围的同时生成该非还原性糖的新酶和它们的生成方法和制备方法，编码该酶的DNA，含有该DNA的重组DNA和转化体，以及含有该非还原性糖的组合物及其用途作为课题，通过提供具有由通式1表示的结构的异环麦芽寡糖和生成该糖的新型异环麦芽寡糖合酶和它们的生成方法和制备方法，以及编码该酶的DNA和含有该DNA的重组DNA和转化体，以及含有异环麦芽寡糖或含有该糖的糖类的组合物及其用途，从而解决上述课题。通式1环{→6)－[α－D－Glcp－(1→4)]
文档编号A23L1/09GK101044244SQ20058003570
公开日2007年9月26日 申请日期2005年9月26日 优先权日2004年9月27日
发明者渡边光, 西本友之, 久保田伦夫, 福田惠温, 三宅俊雄 申请人:株式会社林原生物化学研究所