一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法与应用，特别设及 一种同源重组黑曲霉菌株生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合 酶制造海藻糖的方法，属于基因工程和酶工程技术领域。
【背景技术】
[000引海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是。2&2011 ? 2&0,广泛分布于自然界中许多 生物细胞中，既是一种胆藏性糖类，又是应激代谢的重要产物。海藻糖不仅可W作为碳源和 能源，而且还具有保存生物活力的特殊功能，它具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、 干旱、高溫、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。由于海藻 糖具有广泛而独特的生物学功能，广泛受到各个国家的密切关注，W致引发了世界性的海 藻糖研究和开发热潮。
[0003] 黑曲霉是一种广泛存在于自然界的腐生真菌，又是重要的工业发酵微生物，在工 业酶制剂、有机酸发酵方面应用广泛。可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄 糖氧化酶等超过30种酶制剂。因为黑曲霉出色的蛋白质分泌能力，黑曲霉也被开发为通用 的异源蛋白表达载体。黑曲霉具有强大的聚合物降解酶系，赋予其在各种廉价的培养基上 快速生长和发酵的能力，能够在极低的抑下保持旺盛的代谢活性，因而不易染菌，能够适 应工业发酵中粗放的物料和理化环境，运些品质使黑曲霉成为一种不可多得的工业生产宿 主菌，即细胞工厂。通过各种条件的优化，黑曲霉自身糖化酶产量甚至达到了30g/L。
[0004] 目前海藻糖的生产工艺主要有S种：
[000引 （1)提取法
[0006] 提取法主要通过培养海藻糖含量较高天然生物来获取，目前主要的提取对象为酵 母（海藻糖含量约占酵母干重的15% )，但由于海藻糖属于酵母内容物，提取时需要进行复 制的破壁及分离提取工艺，因此目前逐渐被酶法制备海藻糖法取代。
[0007] 似单酶法
[0008] 单酶法在1995年由日本Nishimoto等人首次提出，即采用海藻糖合酶转化麦芽 糖生产海藻糖的工艺。海藻糖合酶能够将a,a-1，4-糖巧键连接的麦芽糖直接转化为 a，a-1，1-糖巧键连接的海藻糖，该转化反应不需要憐酸盐的存在，不需要消耗高能物质， 但该方法所采用的酶热稳定性一般较低，且转化率多为60%左右，另外由于该酶同时具有 轻微的水解活性，因此单酶法转化过程中还会产生少量副产物的葡萄糖。
[000引 做双酶法
[0010] 双酶法在1991年由Lama等人首次报道，即采用麦芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTOase)两种酶利用淀粉为底物生产海藻糖的方 法。该方法中第一种酶用来催化聚合度值巧大于3的麦芽糊精，转化其还原端的a-1,4 连接键生成a-1，1连接键。第二种酶专一性催化水解a-1，4键生成的a-1，1键海藻糖 和低分子量的麦芽低聚糖。目前双酶法多数W还原性淀粉为原料，转化率多为70-80%左 右，因此较单酶法相比更为经济，除能够生产海藻糖之外，还可W同时产生具有较高附加值 的麦芽=糖，因此该工艺路线已被用于工业化生产。
[0011] 虽然双酶法具有W上诸多优点，但依然存在不足之处：双酶法转化所用两种酶需 要分别进行发酵及纯化才能获取，因此酶的生产成本明显高于单酶法。
【发明内容】
[0012] 本发明针对现有技术的不足，提供一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建 方法与应用。
[0013] 本发明技术方案如下：
[0014] 一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0015] (1)分别PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY与麦芽寡糖基海藻糖水解 酶基因TreZ,同时PCR扩增黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5和下游基因片段Gla3、 Gla3a;所述的黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1 ;所述 的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2;所述的黑曲霉糖 化酶基因的下游基因片段Gla3a的核巧酸序列如SEQ ID NO. 3 ;
[0016] (2)采用重叠PCR技术，将步骤（1)制得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY与 麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因化eZ拼接，制得化eY-TreZ融合基因片段，TreY-化eZ融合 基因片段的核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示W及氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示，然后将 步骤（1)制得的黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5与TreY-TreZ融合基因拼接，制得 GlaS-TreY-heZ片段，然后将黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3与GlaS-TreY-heZ 片段拼接，制得GlaS-TreY-heZ-GlaS片段；
[0017] 做将步骤似制得的GlaS-TreY-TreZ-GlaS片段与PMD18-TSimple连接，获得 重组质粒pSimple-TreY-TreZ;将步骤（1)制得的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3a 与pMDlS-T载体连接，制得pMD-Gla3a质粒；
[001引 （4)用甜曰1、BamHI双酶切载体PAN7-1，回收603化P的基因片段，甜曰1、BglII双 酶切步骤（3)制得的pMD-Gla3a质粒，回收1213bp的基因片段，连接上述回收的基因片段， 构建载体pAN-Gla3a;
[001引 妨在Gla5基因上游引物5'端引入一个甜al位点，然后与pEASY-Blunt载体连 接，构建质粒载体祀ASY-GlaS;
[0020] (6)用限制性内切酶甜al、化〇1、化al;酶切步骤（4)制得的载体pAN-Gla3a，回 收3470bp的基因片段，化oI、SpeI双酶切步骤（5)制得的质粒祀ASY-GlaS,回收3785bp的 基因片段，连接上述回收的基因片段，构建载体祀ASY-h地；
[00川 （7)用限制性内切酶甜al、化Ol双酶切步骤（6)制得的载体祀ASY-h地和步骤（3) 制得的重组质粒pSimple-TreY-TreZ，回收7392bp与6367bp的基因片段，连接上述回收的 基因片段，构建载体祀ASY-TreY-heZ;
[002引 做用限制性内切酶甜aI、HindIII双酶切步骤（7)制得的载体祀ASY-TreY-TreZ和载体PFGL59,回收983化P和7339bp的基因片段，连接上述回收的基因片段，制得 pFGL59-TreY-TreZ载体；
[002引 （9)将pFGL59-TreY-TreZ载体通过根癌农杆菌AGLl介导的黑曲霉转化法转化到 黑曲霉F0410中，经筛选，获得制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌。
[0024] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY是W隧 尼古下节杆菌（Art虹obacternicotinovorans)基因组为模板，上游引物Fl和下游引物Rl为引物，通过PCR扩增获得；
[00巧]F1:5，-GGATCCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC-3'
[0026] R15' -CCTCGGGGGTGAACGTGC-3,；
[0027] 上述PCR体系为50 y 1 :
[0028] 2XHiFi-PCRmaster25yl;上游引物Fl2. 5yl;下游引物Rl2. 5yl;模板 2. 5yl;(1地2〇 17. 5yl;
[0029] 上述PCR程序如下：
[0030] 95°C变性 5min;95°C变性 30sec，62°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，共 30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0031] 麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ是W隧尼古下节杆菌（Arthrobacter nicotinovorans)基因组为模板，上游引物F2和下游引物R2为引物，通过PCR扩增获得；
[0032] F2:5，-ATGAGTTCGCCATTCGAGGT-3，
[0033] R2:5 ' -GACGTCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG-3,
[0034] 上述PCR体系为50 y 1 :
[0035] 2XHiFi-PCRmaster25yl;上游引物F2 2. 5yl;下游引物R2 2. 5yl;模板 2. 5yl;(1地2〇 17. 5yl;
[0036] 上述PCR程序如下：
[0037] 95°C变性 5min;95°C变性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，共 30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0038] W黑曲霉基因组为模板，用Gla5重叠特异引物GlaS-F和GlaS-R-I进行PCR扩增， 扩增得到片段Gla5;
[0039] Gla5重叠特异引物如下：
[0040] GlaS-F: 5'-TCTAGACTCGGCGACTTGGTCTT-3'5' 引入甜al酶切位点
[0041] GlaS-R-I :5' -CGGTGTCAACACCATATTTGCCAACCCTGTGC-3'
[004引所述的PCR扩增体系为50 y 1:
[0043] 2XhqPCR MasterMix 25^1，IOymol/L上游引物GlaS-F 2. 5^1，IOymol/L下 游引物GlaS-R-I 2. 5yl，模板2. 5yl，用d地2〇 补足50yl;
[0044] 所述的PCR扩增程序如下：
[0045] 95°C预变性 5min;95°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 2min，30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0046] W黑曲霉基因组为模板，用Gla3重叠特异引物Gla3-F-1和Gla3-R进行PCR扩增， 扩增得到片段Gla3;
[0047] Gla3重叠特异引物如下：
[0048] Gla3-F-1 :5, -CAGGGTTGGCAAATATGGTGTTGACACCGMATCGACCTA-3'
[0049] Gla3-R :5, -ATGGATTGATTGTTCAGCCCAGGTCGACG-3'
[0050] 所述的PCR扩增体系为50 y 1 :
[0051] 2Xl'aqPCRMasterMix25y1，10ymol/L上游引物Gla3-F_l2. 5y1，10ymol/L 下游引物Gla3-R2. 5yl，模板2. 5yl，用d地2〇补足50yl;
[0052] 所述的PCR扩增程序如下：
[0053] 95°C预变性 5min;95°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2min，30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存；
[0054]W黑曲霉基因组为模板，用Gla3a特异引物Gla3a-F和Gla3a-R进行PCR扩增，扩 增得到片段Gla3a;
[0055]Gla3a特异引物如下：
[0056]Gla3a-F:5' -AGATCTACAATCAATCCATTTCGCTATAGTT-3' 5' 端引入BglII酶切位点
[0057]Gla3a-R:5' -TCTAGACATAAGGCGGGTTCACATCC-3'5' 端引入甜al酶切位点 [005引所述的PCR扩增体系为50y1 :
[0059] 2XhqPCRMasterMix25^1，IOymol/L上游引物Gla3a-F2. 5^1，IOymol/L 下游引物Gla3a-R2. 5yl，模板2. 5yl，用(1地2〇补足50yl;
[0060] 所述的PCR扩增程序如下：
[0061] 95°C预变性 5min;95°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2min，30 个循环； 72°C延伸lOmin，-20°C保存。
[0062] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，采用重叠PCR技术制备TreY-TreZ融合基因 片段的条件如下：
[006引所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
[0064] 95°C预变性 5min;95°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，5 个循环；
[006引所述的重叠PCR的初次扩增体系为：
[0066] TreY基因片段4yl;TreZ基因片段4yl!SXhqPCRMasterMix12. 5yl;d地2〇 4. 5y1 ;
[0067] 所述的重叠PCR的补充扩增体系为25y1 :
[0068] 上游引物Fl2yl;下游引物R2 2yl!SXhqPCRMasterMix12. 5yl;d地2〇 8. 5yl;
[0069] 所述的重叠PCR的补充扩增