一种人肿瘤抗原3H11Ag的制备方法及其酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体来说设及一种人肿瘤抗原3HllAg的制备方 法及检测该抗原的酶联免疫检测试剂盒的设计，及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 免疫检测是一种基于抗原、抗体的特异性识别反应的分析方法，可W通过对抗原 或抗体进行标记（如酶、巧光物质、放射性同位素标记等），利用标记物的信号放大作用， 与现代测试技术相结合，对样品中特定的目标物进行定性定量测定，具有特异性强、灵敏度 高，方法便捷、成本低和可系统化、商业化的特点。
[0003] 酶联免疫吸附法巧LISA)的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此 种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附 在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所 含的供氨体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反 应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此 种显色反应可通过酶标仪进行定量测定，运样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的 特异性结合起来，使酶联免疫吸附法成为一种既特异又敏感的检测方法。
[0004] 双抗夹屯、化ISA是指被检测的抗原结合在两个抗体之间，其中一个抗体包被固定 于固相载体上，即捕捉抗体，它可W捕获样品中的抗原。另一个则是检测抗体，此抗体可用 酶标记后直接测定抗原的量；或不标记，再通过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。该方法 具有检测的高灵敏、高专一性的特点。
[0005] 我国研究者通过用肿瘤细胞免疫小鼠获得了鼠源性单克隆抗体3H11,它能够与 多种肿瘤组织及细胞特异结合，曾在临床上尝试用于肿瘤显像确定肿瘤组织位置及大小。 通过用3H11抗体筛选肿瘤细胞CDNA文库，获得了能被3H11单克隆抗体特异识别的3H1IAg 肿瘤抗原。它来自于中屯、体蛋白CEP290(Cent;rosomalProteinof290kDa，Genebank序 列号80184)。由于3HllAg肿瘤抗原来自于一个胞内蛋白，当某些细胞发生恶变后，它可W 表达在恶变的细胞和组织表面，在肿瘤细胞培养上清及肿瘤病人血清中是否也存在3HllAg 肿瘤抗原目前还没有报道。本申请首次成功地在E.COli中克隆表达了SHllAg，并用本申 请表达纯化的3HllAg作为免疫原免疫兔子获得针对3HllAg的多克隆抗体。另外，本申请 还W3HllAg作为标准品，利用3H11单克隆抗体设计制备了双抗夹屯、酶联免疫检测试剂盒。 此试剂盒可用于检测确定肿瘤细胞培养上清及肿瘤病人血清中是否也存在3HllAg肿瘤抗 原。此发明可为科学研究和病理学研究提供相应的抗原检测工具。另外也可用于肿瘤病人 临床检测及筛选。
【发明内容】
[0006] 本发明W临床原发胃癌组织的CDNA为模板，通过PCR反应扩增3H1IAg,构建适宜 的表达载体，得到高表达高溶解的3HllAg;利用相应的抗原蛋白制备其多克隆抗体；进而 建立一种能够快捷简便测定3HllAg蛋白浓度的测定方法，为相应的科学研究甚至癌症相 关疾病的临床研究提供了便利。
[0007] 本发明的第一方面是提供一种人肿瘤抗原3HllAg蛋白高表达高可溶的制备方 法。
[0008]W胃癌组织CDNA为模板，按照公布的CEP290基因编码序列，设计引物扩增3H1IAg 基因，将其连入大肠杆菌冷激表达载体pCold-GST中，构建3HllAg的表达载体。用表达载 体转化表达菌，通过低溫诱导表达带GST标签的95kD融合蛋白。纯化带有GST标记的融合 蛋白，去除GST柄;签，得到不含柄；签的69kD3H1IAg蛋白。
[0009] 经过试验筛选，本发明设计了如下序列的特异性扩增引物：
[0010] SHllAg-T-F :5, GAAGTAAATGAGCTAAAAAGTG(SEQ ID No.2)和SHllAg-T-R: 5> CTGAAATTTGGCTATCACTGTC(沈Q ID No. 3)。
[0011] 本发明发现虽然本领域中已知的表达载体很多，但很多表达载体无法获得3HllAg 的可溶性表达，表达量有限。经过试验研究，本发明人发现用pCold-GST构建表达载体 pCo 1 d-GST-3Hl IAg,其表达3H1 IAg蛋白可溶性高且表达量大，去除GST标签之后，不含标签 的3H1 IAg蛋白的纯度仍然极高。
[0012]在本发明中，表达菌可W为化2UDE3)，C41，C43等，优选为化2UDE3)，其蛋白表 达量明显高于其他菌。
[0013] 转化了表达载体的大肠杆菌化21通过低溫诱导表达95kDGST-3HllAg融合蛋白， 诱导溫度为12-16°C，优选14-15°C。诱导后将菌体收集，超声波裂解，高速离屯、后收集蛋白 上清。
[0014] 在本发明中，优选使用GST亲和层析柱纯化带有GST标记的3H1IAg蛋白，通过HRV 3C蛋白酶去除GST标签，得到不含任何标签的69kD3HllAg蛋白。
[0015] 本发明的第二个方面是提供一种改进的3HllAg蛋白多克隆抗体的制备方法。
[0016] 用本发明前述方法制备并纯化的3HllAg蛋白免疫动物，取免疫动物的血清，经盐 析纯化获得3H1IAg的多克隆抗体。
[0017] 被免疫动物可W为兔，羊，鼠，马等。作为优选，所述动物为兔或羊。更优选为新西 兰白兔。
[0018] 免疫动物的程序为四次免疫，第一次免疫，W抗原与福氏完全佐剂混合后皮下注 射免疫动物，第二次和第=次免疫，W抗原与福氏不完全佐剂混合后皮下注射免疫动物，最 后一次免疫，W抗原静脉注射免疫动物。
[0019] 优选抗原与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂的质量比为1:0. 5-3,优选为 1:0. 8-2,进一步优选为1 :0. 9-1. 5,最优选为约1: 1。
[0020] 优选第一次免疫抗原总注射量为Img;第二次和第S次免疫，每次抗原总注射量 为0. 5mg;最后一次免疫，抗原注射量为Img。
[0021] 优选，每次免疫间隔10天。
[0022] 在本发明中，盐析纯化多克隆抗体的方法优选为：用饱和硫酸锭溶液盐析纯化血 清中的多克隆抗体。进一步优选为：按体积比约1:1的方式，向动物血清中加入饱和硫酸锭 溶液，离屯、后取沉淀；将所述沉淀用IMpH7. 4的PBS溶液悬浮，加入等体积饱和硫酸锭溶 液，离屯、后取沉淀，所述步骤重复操作两到四次。将最后所得沉淀溶于适量IMpH7. 4的PBS中，置于IMpH7. 4的PBS溶液中透析。
[0023] 纯化后的多抗保存于含30%甘油、0. 01%硫柳隶的0.IMpH7. 4PBS中，多抗的终 浓度为Img/ml。
[0024] 本发明的第S个方面是提供检测3HllAg的化ISA试剂盒。
[002引所述试剂盒中包含：3化IAg单克隆抗体包被的固相载体，3化IAg蛋白标准品， 3H1IAg的阳性对照品，抗3H1IAg的多克隆抗体，酶标二抗。或者包含：3化IAg单克隆抗体 包被的固相载体，3HllAg蛋白标准品，3HllAg的阳性对照样品，酶标抗3HllAg的多克隆抗 体。
[0026] 进一步可W包含：底物显色液、终止液、洗涂液和/或稀释液。
[0027] 在本发明中，优选所述3H1IAg和3H1IAg多克隆抗体是由本发明记载的制备方法 制备得到的。优选所述3HllAg多克隆抗体是兔多克隆抗体。
[0028] 所述3H11单克隆抗体可W采用本领域单克隆抗体的杂交瘤技术等制备获得。
[002引试剂盒中，3HllAg单克隆抗体的包被浓度可W为1-10yg/ml，优选3-7yg/ml，最 优选为5yg/ml。包被液为0. 2MpH7. 4的PBS。
[0030] 在本发明中，所述固相载体的材质可W选自但不限于聚氯乙締、聚苯乙締、聚丙酷 胺和纤维素等本领域常用的酶联免疫吸附的固相载体材质；其形式可W选自但不限于凹孔 平板、试管、珠粒等。在本发明的优选方案中，所述固相载体为凹孔平板，优选为聚苯乙締凹 孔平板，优选为聚苯乙締96孔板。
[0031] 优选用单抗包被固相载体之后，用封闭液进行处理，W封闭未包被的位点。所述封 闭液可W是含1 % -5%BSA的IMpH7. 4的PBS溶液，或者含0. 5% -3%